一种与新疆驴产奶性状相关的SNP标记及其应用的制作方法

本发明主要涉及动物分子遗传育种领域，具体地说，本发明涉及一种利用DNA分子标记技术检测与新疆驴乳用性状相关性进行育种的方法。
背景技术：
：新疆驴是中国一种优良的原始地方品种，属于干旱沙漠生态类型的小型驴种，主要分布在塔里木盆地周围的农村。近年来，自治区政府比较重视驴产业发展，2008年，新疆驴被列为国家级畜禽遗传资源保护品种，在我国家畜品种遗传资源中占有重要的地位。新疆驴是一种具有肉、皮、药、乳、役等多种经济用途的畜种。其中驴奶更因其具有较高的营养价值，容易被人体消化吸收等优势逐渐被人们所关注。驴奶中各营养成分的比例最为接近人奶，可以作为母乳的替代品之一。驴奶因其独特的成分自古以来就成为一种医疗用品和滋补营养品。驴奶中还富含许多免疫活性物质和抗癌物质，可以作为一种免疫促进剂，具有增强人体免疫功能、延缓衰老、激发性欲等功能，具有较为广泛的药用价值。驴奶的高营养及高附加值的特点，也使其身价倍增，驴鲜奶的收购价为23元/千克，而驴奶粉目前售价能达到2200～3750元/千克，利润极其丰厚。但是，目前未有乳用驴的专门化品种，且生产用母驴的个体乳产量较低，远低于牛奶产量，甚至低于马奶产量，无法满足人们对驴奶的乳制品的需要。因此，选育具有高产奶性能的乳用驴既可弥补驴奶的市场空缺，又可显著提升新疆驴的饲用价值及经济价值，是开发驴产业的重要工作。新疆驴的1个泌乳期约为180d，产乳量为(465.1±153.8)kg/头；泌乳高峰期为第2～4泌乳月，占总产乳量的58.4％，在此期间泌乳曲线平稳；第5泌乳月产乳量大幅下降，此后，呈逐渐下降趋势直至停乳。同时，新疆驴的产乳量变异系数大，泌乳期期间，最高个体产乳量(768.6kg)是最低个体产乳量(234.0kg)的3.3倍。但是，查阅现有文献及专利中，未见有关于影响新疆驴产奶性能的基因位点相关报道；而针对新疆驴产奶性能的相关研究，多停留在行业保护及泌乳情况统计分析阶段，未见有关于新疆驴高产奶性能品种的选育研究，本专利所提供新疆驴的SNP标记位点，实属该行业之先例，将有效地推动高产奶性能的新疆驴的选育工作，更将为新疆畜牧行业的发展及新疆驴的产业化建设做出重要贡献。单核昔酸多态性(SInglesnuleotidepolmorphism，SNP)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者提出的一类遗传标记，主要是指在基因组水平上由单个核昔酸的变异所引起的序列多态性。表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现形式有转换、颠换、插入和缺失等。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR-single-strandconformationpolyrphism，PCR-SSCP)是近年来应用较为广泛的一种基因多态性检测技术，即应用一技术对控制家畜性状的基因进行分型，联合经济性状的遗传规律进行分析，可能找到与经济性状相连锁的重要标记基因，做到真正的早期选种、准确选种。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良畜禽重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。随着分子生物学的快速发展，分子标记在家畜育种中的应用日益广泛，其重要性也日益凸现。在提高驴产奶量的选育中，期望选择与产奶性状密切相关的DNA标记，以实现早起选育和提高育种准确性的目标，从而较快早期育种进程。技术实现要素：针对现有技术需求，本专利提供了一种与新疆驴产奶性状相关的SNP标记及其应用，并以标记辅助选择策略选育提高新疆驴的产奶量，加快新疆专门化乳用驴品种的培育。为了实现本发明的目的，本发明提供的一种与新疆驴产奶性状相关的SNP标记，其位于驴第21号染色体第29764535碱基对，此处碱基为C的基因命名为PRLR1，此处碱基为G的基因命名为PRLR2，此处碱基为G的新疆驴日均产奶量显著高于此处碱基为C的新疆驴，而乳蛋白率前者显著低于后者。本发明还提供用于检测上述与新疆驴产奶性状的SNP标记的引物，包括：正向引物F5'-TTTCATGCGTTATCCAAGCA-3'；反向引物R5'-GAAGGGCTTAGTTACGGGAAA-3'。本发明提供了所述的SNP标记在鉴定产奶量高的新疆驴优势群体中的应用，其包括步骤包括：(1)提取待测新疆驴的基因组DNA；(2)以待测新疆驴的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，通过PCR反应扩增出新疆驴21号染色体29764363-29764592碱基间230bp片段；(3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中173bp处的碱基为G，则待测新疆驴为产奶量高的优势个体。前述应用中，步骤(2)中PCR扩增反应体系为20μL体系：DNA模板1.0μL，PCRMixture10μL，F、R引物各0.5μL，加ddH2O至总体积为20μL。前述应用中，步骤(2)中PCR扩增最适反应条件为：94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃延伸1min，31个循环；72℃5min；4℃保存。前述应用中，步骤(3)中检测PCR扩增产物采用SSCP检测；其中电泳的电压180V，电流50mA，时间10h。选取个体的产物，送往上海生物工程技术有限责任公司进行测序，判定位于驴21号染色体上第29764535位的碱基为G的新疆驴日均产奶量显著高于碱基为C的新疆驴日均产奶量。本发明进一步提供所述与新疆驴产奶性状相关的SNP标记在新疆驴分子标记辅助育种中的应用。本发明利用新疆驴21号染色体第29764535位的SNP位点进行基因分型，并对该位点与驴的产奶性状进行关联分析，通过SPSS17.0软件对不同基因型个体的产奶量、乳蛋白率进行显著性检验，经显著性检验分析PRLR2基因型个体产奶量显著高于PRLR1基因型个体(P＜0.05)，PRLR1基因型个体乳脂率显著高于PRLR2基因型个体(P＜0.05)。该多态位点的检出，选育提高新疆的驴产奶量，为新疆驴产奶性状的标记辅助选择提供了科学依据。实施本发明提供的一种与新疆驴产奶性状相关的SNP标记及其应用获得如下有益效果：本发明提供了一种与新疆驴产奶性状相关的SNP标记及其应用，既采用聚合酶链式反应(PCR)测序技术筛选到与新疆驴产奶性状相关的SNP标记，并通过，PCR-SSCP技术检测待测新疆驴的基因型，根据基因型进行产奶量高的新疆驴的选育，从而加快其育种进程。附图说明：图1显示为PRLR的PCR检测结果。图2显示为PRLR基因PCR-SSCP检测结果。图3显示为PRLR基因测序结果。在图1中M，D2000DNAMarker；1～5，PRLR基因PCR扩增产物；在图2、图3中，AA为PRLR1基因，AB为PRLR2基因。具体实施方式下面结合具体实施例详细说明本发明，但本发明并不限于下述的实施例。下列实施案列中若无特殊说明，所用技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。下列实施例中若无特殊说明，所用的材料及试剂等均可从商业途径购买。实施例一：与新疆驴奶性状相关SNP标记的获得(一)驴全血基因组DNA提取在新疆喀什地区，采集待测新疆驴颈静脉血液5ml，枸橼酸钠抗凝，-20℃保存；参照《分子克隆实验指南》，用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，-20℃保存。(二)PCR扩增含有SNP位点的核苷酸序列(1)引物设计及合成根据马属动物的SNP位点(GeneBank登录号：BIEC2-560864)，设计的特异性引物，引物序列如下：正向引物F5'-TTTCATGCGTTATCCAAGCA-3'；反向引物R5'-GAAGGGCTTAGTTACGGGAAA-3'。引物片段大小为230bp，最适退火温度56.5℃。(三)PCR扩增PCR扩增反应体系为20μL体系：DNA模板1.0μL，PCRMixture10μL，F、R引物各0.5μL，加ddH2O至总体积为20μL。PCR扩增最适反应条件为：94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃延伸1min，31个循环；72℃5min；4℃保存。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测特异性扩增的PCR产物，电压100V，电泳30min，EB染色15min后，利用Bio-RAD凝胶成像仪呈像。结果参见附图1。(四)SSCP检测(1)8％非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制表1：8％非变性聚丙烯酰胺凝胶配制方案名称体积(mL)30％丙烯酰胺溶液26.6005×TBE20.00010％AP0.700TEMED0.066蒸馏水52.800总计20.000依据表1配制2板胶，搅拌均匀后匀速灌入制胶器，并插入梳子，待胶凝固后，缓缓拔出梳子。(2)PCR扩增产物变性取5μlPCR产物，加入8μl变性缓冲液，95％甲酰胺、10mmol/LEDTA、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青，瞬时离心后，在PCR仪中98℃变性10min，取出后立即置于冰上，10min后全部上样。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳将适量0.5×TBE缓冲液加入上下槽，用注射器将产生的气泡赶出，并冲洗点样孔；按正负极合上电泳槽盖，预电泳30min后，用微量进样器吸取变性后的PCR产物加入点样孔；点样完成后，电压180V，电流50mA，电泳20h。(4)染色、显色：A.将凝胶从电泳槽中取出，用蒸馏水漂洗2次后，加入染色液(0.1％硝酸银)250ml，放于摇床避光轻轻摇15min，倒出染色液；B.加入显色液(2％氢氧化钠+0.1％甲醛)250ml，浸没凝胶，边摇边观察，直到凝胶上显现电泳带；C.倒出显色液，迅速用去离子水冲洗2～3次；D.Bio-RAD凝胶成像系统成像，根据条带数量和位置进行基因判型。结果表明，引物扩增的基因片段存在两种基因型：CC和CG，结果参见附图2。(五)DNA测序选取不同基因型个体的PCR产物40μl，送往上海生物工程技术有限责任公司进行测序，利用DNAMAN软件分析对比DNA序列，在新疆驴中，确定SNP位点：C→G，该位点位于驴第21号染色体上总长度为230bp的第位29764363-29764592碱基之间，测序结果对应为PRLR1和PRLR2两种基因，参见附图3。实施例二：新疆驴不同基因型与产奶性状的关联分析及检测应用利用软件SPSS17.0，对不同基因型与产奶性状(日均产奶量和乳脂率)进行关联分析，结果如下表2：表2:不同基因型与产奶性状的关系注：Mean±SD表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同小写字母时，表示差异显著(P<0.05)。从表2中可以看出，在新疆驴群体中，PRLR1基因型个体的总体平均日产奶量显著低于PRLR2基因型个体(P<0.05)；而PRLR1基因型个体的总体乳脂率显著高于PRLR2基因型个体(P<0.05)。这一结果表明，该SNP位点可作为新疆驴产奶量的一个分子标记，可用于选育提高新疆驴的产奶性能。综上所述，本发明通过选取位于新疆驴第21号染色体上第29764363-29764592位碱基之间的SNP位点的基因型，并确立其与新疆驴的产奶性能的关联性，以此定义SNP位点PRLR2和PRLR1基因型的产奶性能表型，从而可以较大程度地提高分子选育人员的工作效率，并可以有效地避免在高产奶性状选育过程中可能出现的各种干扰。如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。SEQUENCELISTING<110>新疆畜牧科学院畜牧研究所<120>一种与新疆驴产奶性状相关的SNP标记及其应用<130>PRLR1<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>198<212>DNA<213>PRLR1<220><221>PRLR1<222>(1)..(198)<400>1tcagtttatttatggtacttagataggtggagtgaaaaatgaagacaggcagaaagataa60aatggatggattttccatgagcttcctaaattatcttatttgggaaaattcctcagtttt120cccagaggcccataactaggaagttggagacccaggactcgagccccggtctgtcctttc180ccgtaactaagcccttca198SEQUENCELISTING<110>新疆畜牧科学院畜牧研究所<120>一种与新疆驴产奶性状相关的SNP标记及其应用<130>PRLR2<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>198<212>DNA<213>PRLR2<220><221>PRLR2<222>(1)..(198)<400>1tcagtttatttatggtacttagataggtggagtgaaaaatgaagacaggcagaaagataa60aatggatggattttccatgagcttcctaaattatcttatttgggaaaattcctcagtttt120cccagaggcccataactaggaagttggagacccaggactcgagcccgggtctgtcctttc180ccgtaactaagcccttca198当前第1页1 2 3