鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法与流程

本发明涉及兰科石斛属药用植物产品的鉴别方法技术领域，尤其涉及一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法。

背景技术：

安徽省霍山地区主要产3种药用石斛，种名分别为：霍山石斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)(又称霍山米斛)、铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.exLindl.)(又称黑节草)和细茎石斛(Dendrobium moniliforme(Linn.)Sw.)(又称铜皮石斛)。三者均为兰科石斛，属多年生草本植物，主要含有多糖、生物碱、联苄类和菲类等活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、扩张血管、降血糖等多种功效。三者共同被安徽省政府申报为地理标志产品“霍山石斛”(物种名称“霍山石斛”仅指一种，地理标志“霍山石斛”指代三种)。

反向简单重复序列区间多态性分子标记技术(ISSR，inter simple sequence repeat)，自1994年发明以来，便以其相对可靠的重复性、稳定性和丰富的多态性，广泛应用于种间和种下关系研究。本发明利用ISSR-PCR技术对安徽霍山产三种药用石斛及其相似种进行种间和种下鉴别，建立了一个完整可靠的药用石斛ISSR—PCR反应系统(反应体系、反应程序和扩增引物)和分子标记指纹图谱，为研究药用石斛的鉴别和良种选育、提供分子水平上的参考和借鉴。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种完整可靠且可为研究药用石斛的鉴别和良种选育提供分子水平上的参考和借鉴的鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法，包括如下步骤：

(1)：样品预处理

将采集到的药用石斛材料用70％-75％的乙醇水溶液擦拭表面后，按同种类混合在一起，取8-12g，加入10-12mL DNA提取缓冲液，放在提前预冷至(-25)-(-20)℃的研钵中，用研棒将其研磨成糊状，再用移液枪吸180-200uL至离心管中；

(2)：DNA初步提取

①快速向上述离心管中加入400-500uL提前预热至60-65℃的DNA提取缓冲液，上下摇动混匀，60-65℃水浴1-1.5h后取出离心管，10000-12000r/min离心10-15min；

②取上清液，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液，上下颠倒离心管25-35次，10000-12000r/min离心10-15min，取上清液，再用氯仿与异戊醇混合液处理1-2次，10000-12000r/min离心；

③取上清液0.8-1mL到离心管中，加入0.4-0.6mL提前预冷至(-25)-(-20)℃的异丙醇并混匀，静置10-15min，10000-12000r/min离心10-15min，弃上清，沉淀分别用70％-75％乙醇、无水乙醇各洗2-3次，60℃-65℃挥干乙醇5-6min，此沉淀即为基因组DNA初提物，最后，加100-150ul灭菌蒸馏水溶解DNA，即获得DNA提取液；

(3)：DNA的检测及保存

在得到DNA提取液后，对其纯度、浓度、完整性分别进行相应的检测及记录，再将检测完成的对应DNA提取液进行分管低温保存待用；

(4)：ISSR-PCR反应

①ISSR-PCR反应体系：

模板10ng/L，引物0.3μM，Mg²⁺2.0mM，dNTP 200μM，Taq聚合酶1U/20μl；

②ISSR-PCR反应：

以获取的DNA作为ISSR-PCR反应的模板，在PCR仪上进行ISSR-PCR扩增反应；

第一阶段：反应体系中加入第一组引物，94℃预变性8min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，扩增10个循环；

第二阶段：在上述反应体系中加入第二组引物，94℃变性45s，58-50℃退火45s，72℃延伸2min，扩增25个循环，梯度退火，最后于72℃终延伸8min；

(5)：电泳检测及基因分型能力评估

取3-5μl扩增产物用1.0％-1.5％琼脂糖凝胶，5-10V/cm恒压电泳检测，溴化乙锭染色后用凝胶成像系统对电泳检测结果进行拍照，获取相应电泳检测结果图，并对引物的基因分型能力进行评估分析，根据基因分型能力评估分析结果，确定该电泳检测结果是否可有效区分全部样品以确保后续建立的指纹图谱的可靠性；

(6)：ISSR-PCR指纹图谱的建立

当基因分型能力评估结果显示电泳检测结果可有效区分全部样品后，该电泳检测结果图即为所选择鉴别的不同种药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱；

(7)：未知种属的石斛样品种类的鉴定

把未知种属的石斛样品按照上述步骤(1)-(6)建立其相应的ISSR-PCR指纹图谱，再将其与已建立的已知种属的药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱的信息相比较，当其与某一泳道的条带信息的吻合度达98％以上，即可判定为同一种；当其与某一泳道的条带信息的吻合度介于95％-98％之间，则可确定为近似种；当其与所有条带的吻合度都低于95％，即可判定不属于已知的任何一种药用石斛种类。

优选地，所述步骤(1)中药用石斛的种类分别为霍山石斛、霍山铁皮石斛、霍山细茎石斛及其相似种；所述相似种又进一步包括云南铁皮石斛、浙江铁皮石斛、河南石斛、安徽曲茎石斛、霍山细茎石斛♂×霍山铁皮石斛♀杂交种、霍山石斛♂×霍山细茎石斛杂交种。

优选地，所述步骤(2)中氯仿与异戊醇混合液为体积比分别为24:1的氯仿与异戊醇混合液。

优选地，所述步骤(1)和步骤(2)中DNA提取缓冲液的配方为：0.1mol·L^-1Tris-HCl(pH 8.0)，0.02mol·L^-1EDTA(pH 8.0)，1.5mol·L^-1NaCl，2％PVP40(W/V)，2％CTAB(W/V)，临用前加3％的β-巯基乙醇。

优选地，所述步骤(2)中水浴过程要同时对离心管中的混合液进行不间断的混匀，所述不间断的混匀方式为：水浴的前10min，每隔3min摇动离心管；剩余时间内，每隔10min上下颠倒离心管2-4次。

优选地，所述步骤(3)中利用紫外分光光度法进行DNA提取液的纯度和浓度检测，利用0.5％琼脂糖凝胶电泳进行DNA提取液的完整性检测。

优选地，所述步骤(3)中分管低温保存方法为：先将检测完成的DNA提取液进行分管，即用移液枪吸取100uL检测完成的DNA提取液至1.5mL离心管中，再重复操作至无剩余DNA提取液，再将分装完成的各离心管置于-20℃冰箱中保存。

优选地，所述步骤(4)中第一组引物为不含锚定碱基的两个引物序列：(AT)₈，(CT)₈；第二组引物为含两个锚定碱基的两个引物序列：(AT)₈CG,(CT)₈GA。

优选地，所述步骤(5)中各引物的基因分型能力的评估分析方法为：先根据电泳检测结果图上相同条带的有或无，统计得到所有位点的二元数据，再根据该位点具有条带的样本占总样本的比率P值和公式Ib＝1－2|0.5－P|来计算条带信息量Ib值，而一条引物的基因分型能力则可以用该引物扩增的所有位点的Ib值之和来评价，即Rp＝ΣIb，当0.5≤Rp/选择的位点数≤1时，该引物具备可区分所有样品的基因分型能力，其中，Rp/选择的位点数的比值越大，其区分能力越强；所述二元数据的统计方法为：有条带的记录为1，无条带记录为0，而“有”带或“无”带则采用Bandscan 5.0软件以总亮度值作为选择依据，其中，选取的亮度值大于或等于0.2时判断为有扩增带，小于0.2时判断为没有扩增带。

优选地，所述步骤(7)中采用Bandscan 5.0软件对未知种属的石斛样品与已知种属药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱进行检测，确定各条带的“亮度”与“位置”信息，再将二者比较。

本发明的优点在于：

(1)本发明采用ISSR分子标记技术来构建石斛属植物的指纹图谱，对在幼苗期材料即可进行鉴定，对于保证药材基源的准确性和稳定性具有重要的作用；与利用化学色谱指纹图谱鉴定相比，本发明取样少、取样时期随意、不受植物生长环境条件影响；与利用分子测序鉴定相比，本发明环节简单，通过对金线莲属植物的DNA的提取，ISSR的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳就能得到准确可靠的鉴别图谱，省力、省时、省钱；

(2)本发明对PCR扩增的反应体系及扩增程序进行了优化，具有以下特点：多引物扩增、巢式扩增、区间重复序列扩增、梯度降温扩增，上述优化使结果更为稳定和可靠；

(3)本发明的所选择引物的扩增产物多态性高，基因分型能力高，可用于石斛属植物种间鉴别和种内居群间的鉴别。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法的流程图；

图2是本发明实施例1提供的鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法的不同种属药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法，如图1所示，包括如下步骤：

(1)：样品预处理

将采集到的药用石斛材料分别用75％的乙醇水溶液擦拭表面后，按同种类混合在一起，取10g，加入10mL DNA提取缓冲液(0.1mol·L^-1Tris-HCl(pH 8.0)，0.02mol·L^-1EDTA(pH 8.0)，1.5mol·L^-1NaCl，2％PVP40(W/V)，2％CTAB(W/V)，临用前加3％的β-巯基乙醇)，放在提前预冷至-20℃的研钵中，用研棒将其研磨成糊状，再用移液枪吸200uL至离心管中；其中，采集到的药用石斛种类分别为：霍山石斛、霍山铁皮石斛、霍山细茎石斛、云南铁皮石斛、浙江铁皮石斛、河南石斛、安徽曲茎石斛、霍山细茎石斛♂×霍山铁皮石斛♀杂交种及霍山石斛♂×霍山细茎石斛杂交种；

(2)：DNA初步提取

①快速向上述离心管中加入500uL提前预热至65℃的DNA提取缓冲液0.1mol·L^-1Tris-HCl(pH 8.0)，0.02mol·L^-1EDTA(pH 8.0)，1.5mol·L^-1NaCl，2％PVP40(W/V)，2％CTAB(W/V)，临用前加3％的β-巯基乙醇，上下摇动混匀，65℃水浴1h，水浴过程中对离心管中的混合液进行不间断的混匀，即水浴的前10min，每隔3min摇动离心管，剩余时间内则每隔10min上下颠倒离心管3次，水浴完成后，取出离心管，12000r/min离心10min；

②取上清液，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液(体积比分别为24:1的氯仿与异戊醇混合液)，上下颠倒离心管30次，12000r/min离心10min，取上清液，再用氯仿与异戊醇混合液(体积比分别为24:1的氯仿与异戊醇混合液)处理1次，12000r/min离心；

③取上清液1mL到离心管中，加入0.6mL提前预冷至-20℃的异丙醇并混匀，静置10min，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀分别用70％乙醇、无水乙醇各洗3次，60℃挥干乙醇5min，此沉淀即为基因组DNA初提物，最后，加100ul灭菌蒸馏水溶解DNA，即获得DNA提取液；

(3)：DNA的检测及保存

DNA的检测：得到DNA提取液后，利用紫外分光光度法进行DNA提取液的纯度和浓度检测，利用0.5％琼脂糖凝胶电泳进行DNA提取液的完整性检测；

DNA保存：先将检测完成的DNA提取液进行分管，即用移液枪吸取100uL检测完成的DNA提取液至1.5mL离心管中，再重复操作至无剩余DNA提取液，再将分装完成的各离心管置于-20℃冰箱中保存；

(4)：ISSR-PCR反应

①ISSR-PCR反应体系：

模板10ng/L，引物0.3μM，Mg²⁺2.0mM，dNTP 200μM，Taq聚合酶1U/20μl；

②ISSR-PCR反应：

以获取的DNA作为ISSR-PCR反应的模板，在PCR仪上进行ISSR-PCR扩增反应；

第一阶段：反应体系中加入第一组引物，94℃预变性8min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，扩增10个循环；

第二阶段：在上述反应体系中加入第二组引物，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸2min，扩增25个循环(梯度退火)，最后于72℃终延伸8min；

其中，第一组引物为不含锚定碱基的两个引物序列：(AT)₈，(CT)₈；第二组引物为含两个锚定碱基的两个引物序列：(AT)₈CG,(CT)₈GA；

(5)：电泳检测及基因分型能力评估

取5μl扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶，5V/cm恒压电泳检测，溴化乙锭染色后用凝胶成像系统对电泳检测结果进行拍照，获取相应电泳检测结果图，接着对引物的基因分型能力进行评估分析，确定该电泳检测结果是否可有效区分全部样品：根据电泳检测结果图上相同条带的有或无，统计得到所有位点的二元数据(有条带的记录为1，无条带记录为0，而“有”带或“无”带则采用Bandscan 5.0软件以总亮度值作为选择依据，其中，选取的亮度值大于或等于0.2时判断为有扩增带，小于0.2时判断为没有扩增带)，再根据Resolving Power(Rp)原理(Prevost A等，1999；Antonella P等，2001)将每一位点理想条件近似地以50％来代替，而Ib(band informativeness)可以用公式Ib＝1－2|0.5－P|获得，其中P是在该位点具有条带的样本占总样本的比率，而一条引物的基因分型能力则可以用该引物扩增的所有位点的Ib值之和来评价，即Rp＝ΣIb，当0.5≤Rp/选择的位点数≤1时，该引物具备可区分所有样品的基因分型能力，其中，Rp/选择的位点数的比值越大，其区分能力越强；

(6)：ISSR-PCR指纹图谱的建立

当基因分型能力评估结果显示电泳检测结果可有效区分全部样品后，该电泳检测结果图即为所选择鉴别的不同种药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱；

图2为不同种属药用石斛的ISSR-PCR电泳图，即不同种属药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱，其中，横坐标为DNA条带对应大小(bp)，纵坐标为各上样泳道，共11个泳道，泳道1-11从左至右依次为：DNA marker、云南铁皮石斛、浙江铁皮石斛、霍山铁皮石斛、霍山细茎石斛♂×霍山铁皮石斛♀、河南石斛、霍山细茎石斛、霍山石斛、霍山石斛♂×霍山细茎石斛♀、安徽曲茎石斛以及阴性对照结果；如图2所示，本实施例的不同种石斛的ISSR—PCR实验结果条带数清晰、明亮，所有样品条带均为多态性条带，选择位点总数(N)为14，区分能力Rp＝ΣIb＝11.42，Rp/N＝0.80，能有效区分全部样本石斛，该反应体系可用于霍山产三种药用石斛及其他相似种属石斛的种间和种下的鉴别；

(7)：未知种属的石斛样品种类的鉴定

把未知的四种药用石斛样品按照上述步骤(1)-(6)建立其相应的ISSR-PCR指纹图谱，利用Bandscan 5.0软件分析电泳图谱，确定条带的“亮度”和“位置”，再把识别的信息与已得的指纹图谱信息相比，结果发现有两种属植物样品分别与霍山铁皮石斛、霍山细茎石斛的吻合度达到99％，即判定该样品分别为霍山铁皮石斛、霍山细茎石斛；有一种石斛属植物样品的图谱与霍山石斛的图谱吻合度达96％，即判定该样品为霍山石斛近似种，再结合其他鉴别方法(外观性状、显微性状、化学色谱等)判定，结果发现该石斛属植株为多次继代的霍山石斛的组培苗培育而来；还有一种石斛属植物样品图谱与任何一种已知药用石斛的图谱信息吻合度均达不到95％，即可判定该石斛属植株非以上任何一种石斛品种。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。