一种荧光生物探针及其检测Hg2+浓度的方法与流程

本发明属于检测领域，具体涉及一种荧光生物探针、包含该荧光生物探针的生物检测系统及其检测Hg²⁺浓度的方法。

背景技术：

汞是最具毒性和最危险的重金属元素之一，通过食物链在生物体内累积，给人们带来了严重的健康危害，如生长发育缓慢、器官损伤、神经系统损伤，甚至死亡。美国环保署(USEPA)规定的饮用水中汞离子(Hg²⁺)的含量最高不超高10nmol/L。因此，有必要发展一种高选择性和高灵敏性的分析方法用于环境中汞离子的检测。近来，Ono等人证明了Hg²⁺能够高特异性和高选择性的嵌入DNA的两个胸腺嘧啶(T)中间，形成T-Hg²⁺-T的错配碱基对(Miyake Y,Togashi H,Tashiro M,et al.MercuryII-mediated formation of thymine-HgII-thymine base pairs in DNA duplexes[J].Journal of the American Chemical Society,2006,128(7):2172-2173.)，基于这一特性，通过结合一些信号转换策略，发展了许多不同的检测方法，如比色法(Zhu Y,Cai Y,Zhu Y,et al.Highly sensitive colorimetric sensor for Hg²⁺detection based on cationic polymer/DNA interaction[J].Biosensors and Bioelectronics,2015,69:174-178.)、荧光法(Yuan M,Zhu Y,Lou X,et al.Sensitive label-free oligonucleotide-based microfluidic detection of mercury(II)ion by using exonuclease I[J].Biosensors and Bioelectronics,2012,31(1):330-336.)、电化学法(Xuan F,Luo X,Hsing I M.Conformation-dependent exonuclease III activity mediated by metal ions reshuffling on thymine-rich DNA duplexes for an ultrasensitive electrochemical method for Hg²⁺detection[J].Analytical Chemistry,2013,85(9):4586-4593.)等，但是上述方法的检出下限一般都高于10nmol/L，无法满足实际需求。为了提高检测灵敏度，可以使用不同的酶来实现信号放大，如核酸外切酶(Chen J,Zhou S,Wen J.Disposable strip biosensor for visual detection of Hg²⁺based on Hg²⁺-triggered toehold binding and exonuclease III-assisted signal amplification[J].Analytical Chemistry,2014,86(6):3108-3114.)、聚合酶(Jia H,Wang Z,Wang C,et al.Real-time fluorescence detection of Hg²⁺ions with high sensitivity by exponentially isothermal oligonucleotide amplification[J].RSC Advances,2014,4(19):9439-9444.)、核酸内切酶(Li F,Feng Y,Liu S,et al.Triggered activity of a nicking endonuclease for mercuric(II)ion-mediated duplex-like DNA cleavage[J].Chemical Communications,2011,47(22):6347-6349.)、连接酶(Bi S,Ji B,Zhang Z,et al.Metal ions triggered ligase activity for rolling circle amplification and its application in molecular logic gate operations[J].Chemical Science,2013,4(4):1858-1863.)等，但基于酶的方法不仅增加了实验的复杂性和检测成本，而且Hg²⁺还有可能使酶变性，实际中难以应用。因此，开发一种灵敏度更高、操作简便快捷且成本低廉的Hg²⁺浓度检测方法，具有重要的应用前景。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种荧光生物探针，本发明的荧光生物探针可以检测浓度低至50-1200pM的Hg²⁺，且操作简单快捷、成本低廉，能够广泛应用于药品、食品安全、临床和环境检测等领域。

本发明的另一个目的是提供一种用于Hg²⁺检测的荧光生物检测系统，其特征在于包括本发明的荧光生物探针、辅助DNA和氧化石墨烯(GO)。

本发明的还一个目的是提供一种检测Hg²⁺浓度的生物检测方法。

为实现上述发明目的，提供以下技术方案：

一种荧光生物探针，由三种核酸片段H1、H2和H3组成，其中H1、H2和H3的5’端标记荧光基团FAM，H1、H2和H3的碱基序列见图9，H1、H2和H3在游离状态下各自形成茎环的发卡结构，H1、H2、H3环部10个碱基，茎部15对互补碱基，末端单链10个碱基，H1、H2和H3的5’末端单链吸附在氧化石墨烯表面，荧光淬灭，在Hg²⁺存在下，辅助DNA可以催化吸附于氧化石墨烯表面的H1、H2和H3组装生成”Y”字形刚性双链DNA(dsDNA)结构，脱离石墨烯表面，恢复荧光信号。

根据本发明，所述的荧光生物探针H1、H2和H3的发卡结构可以通过95℃下搅拌5min获得。

第二方面，本发明提供一种用于Hg²⁺检测的荧光生物检测系统，包括本发明的荧光生物探针，辅助DNA和氧化石墨烯，其特征在于所述的荧光生物探针由三种核酸片段H1、H2和H3组成，其中H1、H2和H3的5’端标记荧光基团FAM，H1、H2和H3的碱基序列见图9，H1、H2和H3在游离状态下各自形成茎环的发卡结构，H1、H2、H3环部10个碱基，茎部15对互补碱基，末端单链10个碱基；所述的辅助DNA是由20个碱基组成的DNA片段，碱基序列见图9；所述的氧化石墨烯可以采用修饰的Hummer法等方法合成制备。本发明的荧光生物探针H1、H2和H3的5’末端单链吸附在氧化石墨烯表面，荧光淬灭，在Hg²⁺存在下，辅助DNA可以催化吸附于氧化石墨烯表面的H1、H2和H3组装生成”Y”字形刚性双链DNA(dsDNA)结构，脱离石墨烯表面，恢复荧光信号。

根据本发明的荧光生物检测系统，所述的荧光生物探针H1、H2和H3的发卡结构可以通过95℃下搅拌5min获得。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中荧光生物探针H1、H2和H3为浓度30-200nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl缓冲溶液。优选地，荧光生物探针H1、H2和H3为浓度50-200nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl缓冲溶液。进一步优选地，荧光生物探针H1、H2和H3为浓度50nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl缓冲溶液。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中辅助DNA为浓度20-500nmol/L的辅助DNA Tris-HCl缓冲溶液。优选地，辅助DNA为浓度100-500nmol/L的辅助DNA Tris-HCl缓冲溶液。进一步优选地，辅助DNA为浓度100nmol/L的辅助DNA Tris-HCl缓冲溶液。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中Tris-HCl缓冲溶液为浓度50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂的溶液。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中氧化石墨烯表面(GO)可以采用修饰的Hummer方法制备。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中氧化石墨烯表面(GO)为浓度99-μg/mL。

第三方面，本发明提供一种Hg²⁺浓度的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)室温下，将待测品、荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液以及辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合，搅拌时间T1后，加入氧化石墨烯继续搅拌时间T2；

(2)测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，根据荧光强度-Hg²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Hg²⁺浓度值。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中荧光生物探针H1、H2和H3的使用前加热至95℃反应5min，然后逐渐冷却至室温。根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液浓度为30-200nmol/L。优选地，步骤(1)中荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液浓度为50-200nmol/L。进一步优选地，步骤(1)中荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液浓度为50nmol/L。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液浓度为20-500nmol/L。优选地，步骤(1)中辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液浓度为100-500nmol/L。进一步优选地，步骤(1)中辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液浓度为100nmol/L。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中Tris-HCl缓冲溶液为50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中的搅拌时间T1为0.2-5h。优选地，步骤(1)中的搅拌时间T1为1-5h。进一步优选地，步骤(1)中的搅拌时间T1为1h。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中的氧化石墨烯可以采用修饰的Hummer方法制备。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中的氧化石墨烯浓度为99μg/mL。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中的搅拌时间T2为5-30min。优选地，步骤(1)中的搅拌时间T2为5-10min。进一步优选地，步骤(1)中的搅拌时间T2为5min。

根据本发明的生物测试方法，步骤(2)中的检测条件为FAM的激发波长和发射波长分别设定为492nm和517nm，狭缝宽度为10nm，样品的荧光发射光谱用492nm的光激发，扫描范围505-600nm，扫描步长为1nm。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的一种Hg²⁺的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)室温下，将一系列浓度的Hg²⁺溶液标准品、荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液以及辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合，搅拌时间T1后，加入氧化石墨烯继续搅拌时间T2；

(2)测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，制备荧光强度-Hg²⁺浓度标准曲线；

(3)室温下，取待测样品，重复步骤(1)；

(4)测定步骤(3)所得物的荧光发射光谱强度，根据荧光强度-Hg²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Hg²⁺浓度值。

在一些具体的实施方案中，本发明提供的一种Hg²⁺的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)配制一系列浓度的Hg²⁺溶液标准品，如50pM、100pM、200pM、500pM、800pM、1000pM、1200pM、1500pM、2000pM；

(2)室温下，分别将步骤(1)配制的Hg²⁺溶液标准品、荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液以及辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合，搅拌时间0.5-2h后，加入氧化石墨烯继续搅拌时间5-10min，其中，所述的荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为30-200nmol/L，所述的辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为20-500nmol/L，所述的Tris-HCl缓冲溶液为浓度50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂的溶液，所述的氧化石墨烯通过修饰Hummer方法制备，浓度99μg/mL；

(3)测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，制备荧光强度-Hg²⁺浓度标准曲线；

(4)室温下，取待测样品，重复步骤(2)；

(5)测定步骤(4)所得物的荧光发射光谱强度，根据荧光强度-Hg²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Hg²⁺浓度值。

在另一些具体的实施方案中，本发明提供的一种Hg²⁺的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)配制一系列浓度的Hg²⁺溶液标准品，如50pM、100pM、200pM、500pM、800pM、1000pM、1200pM、1500pM、2000pM；

(2)室温下，分别将步骤(1)配制的Hg²⁺溶液标准品、荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液以及辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合，搅拌时间0.5-2h后，加入氧化石墨烯继续搅拌时间5-10min，其中，所述的荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50-200nmol/L，所述的辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为100-500nmol/L，所述的Tris-HCl缓冲溶液为浓度50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂的溶液，所述的氧化石墨烯通过修饰Hummer方法制备，浓度99μg/mL；

(3)测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，制备荧光强度-Hg²⁺浓度标准曲线；

(4)室温下，取待测样品，重复步骤(2)。

(5)测定步骤(4)所得物的荧光发射光谱强度，根据荧光强度-Hg²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Hg²⁺浓度值。

本发明提供的荧光生物检测系统，通过吸附在氧化石墨烯表面而导致荧光猝灭的本发明的荧光生物探针，在Hg²⁺和辅助DNA的作用下，组装生成”Y”字形刚性双链DNA(dsDNA)结构，脱离氧化石墨烯表面，恢复荧光信号的原理测定样品Hg²⁺浓度，基于有效的“打开”检测模式，灵敏度高，选择性强，Hg²⁺的线性范围为50-1200pM，且重复性好，方法简单可靠，克服了现有的“信号关闭”检测模式的假阳性、选择性差等缺陷。此外，相比于基于酶的放大技术，本发明提供的荧光生物检测系统采用的催发发卡组装无酶放大技术展现出更高的放大效率。

术语解释

本发明所述的“pM”是指浓度单位pmol/L。

附图说明

图1是本发明荧光生物检测系统检测Hg²⁺的原理示意图。

图2是实施例2中Hg²⁺的荧光发射光谱。

图3是实施例3中Hg²⁺的荧光发射光谱。

图4是实施例4中Hg²⁺的荧光发射光谱。

图5是实施例5中Hg²⁺的荧光发射光谱。

图6是荧光生物传感器的选择性分析结果。

图7是50nmol/L H1、H2、H3，100nmol/L辅助DNA1和99μg/mL GO的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂)中的不同浓度Hg²⁺的荧光发射光谱。

图8是图7中所测得的荧光强度与Hg²⁺浓度关系的曲线图。

图9是生物荧光探针H1、H2和H3和辅助DNA的碱基序列。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细说明，但并不因此限制本发明。本文中使用的原料、试剂均可以通过商购或本领域常规的方法制备。

实施例1 氧化石墨烯(GO)的制备

称取2g石墨粉末溶于50mL浓硫酸中，搅拌2h；20℃条件下缓慢加入10g高锰酸钾，然后转移至35℃水浴中强烈搅拌4h；加入600mL超纯水稀释反应液；逐渐滴加20mL 30％H₂O₂溶液；将反应混合物分别依次用0.1mol/L HCl和超纯水洗涤5次，超声分散1h；以5000rpm的速度离心GO混合物10min，取上清液作为实验备用GO。

实施例2-5 荧光生物检测系统的参数测定

步骤(1)：室温下，将Hg²⁺浓度为1nM的Hg(NO₃)₂溶液、荧光生物探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂)以及辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合，搅拌时间T1后，加入实施例1制得的氧化石墨烯(99μg/mL)继续搅拌5min，其中，荧光生物探针H1、H2和H3在使用前均加热至95℃反应5min，然后逐渐冷却至室温，以便形成发卡结构；

步骤(2)：测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，对待测品Hg²⁺进行定性和/或定量分析。实验结果见表1，图2-图5。

表1

实验结果表明，荧光生物探针H1、H2、H3的浓度为30-200nmol/L，辅助DNA的浓度为20-500nmol/L，搅拌时间T1为0.2-5h，的生物检测系统荧光强度高，灵敏度好。

实施例6 荧光生物传感器的重复性分析

配制Hg²⁺浓度分别为50、500和1000pmol/L的硝酸汞溶液各六组，分别与H1、H2、H3(浓度均为50nmol/L)和辅助DNA(浓度为100nmol/L)的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂)混合，室温下反应1h，

随后加入99μg/mL GO反应5min，测定其荧光信号。用六次平行试验的相对标准偏差(RSD)来估算本文提出的传感器的重复性，实验结果表明，相对标准偏差分别为10.4％，9.7％和8.8％，因此，本发明提供的荧光生物检测系统重复性良好。

实施例7 荧光生物传感器的选择性分析

配置三个不同Hg²⁺浓度(50、500、1000pmol/L)的硝酸汞溶液以及浓度为Hg²⁺浓度100倍的干扰离子(Mg²⁺,Ca²⁺,Zn²⁺,Pb²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Co²⁺,Sn²⁺)，上述不同浓度Hg²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺和Sn²⁺溶液分别与H1、H2、H3(均为50nmol/L)和辅助DNA1(100nmol/L)的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl₂)混合，室温下反应1h，随后加入99μg/mL GO反应5min，测定其荧光信号。

实验结果见图6，干扰离子(Mg²⁺,Ca²⁺,Zn²⁺,Pb²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Co²⁺,Sn²⁺)的荧光信号强度与对应浓度Hg²⁺荧光强度比较，约低1个数量级，因此，本发明提供的荧光生物检测系统具高度的灵敏性和选择性，可以从复杂的金属离子样品中高度灵敏和选择地检测出Hg²⁺及其浓度。

实施例8 Hg2+浓度的测定

步骤a：配制Hg²⁺浓度为50pM、100pM、200pM、500pM、800pM、1000pM、1200pM、1500pM、2000pM的标准品溶液；

步骤b：分别将不同Hg²⁺浓度的硝酸汞溶液与H1、H2、H3(均为50nmol/L)和辅助DNA1(100nmol/L)的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl2)混合，室温下反应1h，随后加入99μg/mL GO的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH 8.0，含50mmol/L MgCl2)反应5min。用荧光光度计检测荧光发射光谱，结果见图7，绘制标准曲线，结果见图8，在Hg²⁺位于50-1200pmol/L范围内，该生物传感器具有很好的线性关系，线性相关系数为R²＝0.995，最低检出限为25pM(3倍空白样品标准偏差)，远远低于美国环保署(USEPA)规定的环境中Hg²⁺存在的最大水平(10nM)。

步骤c：将待测品用步骤b的生物检测系统检测荧光强度，根据标准曲线测定待测品的Hg²⁺浓度。

以上描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆工商大学

<120> 一种荧光生物探针及其检测Hg2+浓度的方法

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