一种荧光定量PCR反应液及方法与流程

本发明涉及一种荧光定量PCR反应液及方法，尤其涉及一种应用于Taqman-MGB探针的荧光定量PCR反应液及方法，属于分子生物学技术和实验方法领域。

背景技术：

Taqman荧光定量PCR技术扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的Taqman荧光探针，也称水解探针，为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。常用的荧光淬灭基团有TAMRA，BHQ1和MGB等。MGB(Minor Groove Binder)是小沟结合物，其本身是一个化学基团，可以与探针-模板DNA双链中的小沟进一步形成氢键，从而提高Taqman-MGB探针与模板的结合稳定性。

Taqman-MGB探针具有许多特殊、优良的性质：1、Taqman-MGB探针比普通Taqman探针(比如Taqman-TAMRA探针和Taqman-BHQ1探针，一般长度为25-35bp)更短，一般为15bp左右；2、MGB可以提高探针Tm值10℃左右，提高配对与非配对模板间的Tm值差异；3、MGB探针特异性更高，可区分模板一个碱基的差异；4、MGB为不发光的荧光基团，并且与报告基团的空间位置更接近，可以使实验的背景更低，信噪比更高，结果更精确，灵敏度更高。

Taqman-MGB探针的特点使其多应用于普通Taqman探针不能胜任的领域，比如SNP分型、已知点突变的突变型和杂合子基因的检测以及microRNA的检测等。

但现有技术的Taqman-MGB探针存在两个缺陷：一是MGB探针酶切降解的过程中，需要用5'-3'外切酶高活性的DNA聚合酶，这种高外切酶活性的DNA聚合酶被少数厂家垄断，成本很高；二是Taqman-MGB探针的荧光定量PCR反应液需要专用的反应液。

具体地，由于MGB具有与探针-模板DNA双链中的小沟形成氢键的特点，具有普通外切酶活性的DNA聚合酶很难将MGB探针酶切降解。如果要水解MGB探针，需要5'-3'外切酶高活性的DNA聚合酶，而这种高外切酶活性的DNA聚合酶的生产技术一般为国外少数厂家垄断，比如ABI公司(Life公司)。

由于Taqman-MGB探针在识别模板的过程中影响因素较多，普通Taqman探针的荧光定量PCR反应液并不适用于Taqman-MGB探针。现有技术生产水解Taqman-MGB探针专用反应液的厂家只有1-2家，这些产品的价格昂贵，且无论在稳定性、扩增效率及检测灵敏度上都并不完善。

因此，适用MGB的DNA聚合酶和反应液限制了Taqman-MGB探针的应用和推广。

技术实现要素：

为克服现有技术的缺陷，本发明第一方面的目的是提供一种荧光定量PCR反应液，包括具有外切酶活性的DNA聚合酶、DNA聚合酶增强剂、DNA聚合酶增强剂的保护剂、基础荧光稳定剂。具体为：

所述荧光定量PCR反应液的成分为：10～50mM pH值8.0～8.9的Tris-HCl，10～60mM的KCl，2～5mM的MgCl₂，100～300μM的dNTP，0.025～0.1U/μL的DNA聚合酶，0.5×ROX，5～10％的基础荧光稳定剂，1～3％的DNA聚合酶增强剂，10～30％的DNA聚合酶增强剂的保护剂。

所述荧光定量PCR反应液不限于以上成分，还可包括引物、模板、探针、水等用于PCR反应的成分。

所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物与所述下游引物摩尔比为1:1，浓度为8～12μM，优选10μM。所述探针为Taqman-MGB探针。

在本发明的一个实施例中，Tris-HCl、KCl、MgCl₂、dNTP、DNA聚合酶和ROX可以是Buffer缓冲液，所述Buffer缓冲液可以是5×PCR Buffer、pH值为7.8～9.0。

本发明荧光定量PCR反应液中涉及的百分比为体积百分比或质量体积百分比，当反应液中的成分为液体时为体积百分比，当反应液中的成分为固体物质时为质量体积百分比。

所述DNA聚合酶为普通耐热DNA聚合酶，具有5'-3'聚合酶活性和/或5'-3'外切酶活性。进一步地，所述DNA聚合酶为具有较高的5'-3'外切酶活性的DNA聚合酶，优选Takara EX Taq^TM HS酶。

所述基础荧光稳定剂选自NP-40、TritonX-100、NaCl、KCl中的一种或多种组合，所述NP-40和/或TritonX-100在所述基础荧光稳定剂中的体积百分比为16.7％～33.3％，所述NaCl和/或KCl的摩尔浓度为10～25mM。其主要作用为稳定基础荧光值，使荧光值在呈指数上升之前保持稳定。

所述DNA聚合酶增强剂选自牛血清蛋白、二甲亚砜、甲酰胺、亚精胺、环糊精、甜菜碱中的一种或多种组合，所述牛血清蛋白在所述DNA聚合酶增强剂中的质量体积比为0.5％～1％，所述亚精胺和或环糊精的摩尔浓度为50～150mM，所述甜菜碱和或甲酰胺和/或二甲亚砜的摩尔浓度为1.5～2.5M。所述DNA聚合酶增强剂具有明显的提高DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性的作用，并且具有促进MGB与DNA小沟结合的能力，同时具有非常明显的FAM、HEX和VIC荧光增强效果。使普通DNA聚合酶能够水解Taqman-MGB探针。

所述DNA聚合酶增强剂的保护剂选自明胶、透明质酸、二硫苏糖醇中的一种或多种组合，所述明胶和/或透明质酸在所述DNA聚合酶增强剂的保护剂中的质量体积比为1.2％～3.6％，所述二硫苏糖醇的摩尔浓度为0.01～0.05mM。所述DNA聚合酶增强剂的保护剂有效的延长和稳定了DNA聚合酶增强剂的活性。

所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物与所述下游引物摩尔比为1:1，浓度为8～12μM，优选10μM。所述探针为Taqman-MGB探针。

进一步地，所述反应液的成分为：10mM pH值8.5的Tris-HCl，50mM的KCl，4mM的MgCl₂，200μM的dNTP，0.05U/μL的DNA聚合酶，0.5×ROX dye II，6％的基础荧光稳定剂，2％的DNA聚合酶增强剂，20％的DNA聚合酶增强剂的保护剂。

本发明第二方面的目的是提供一种荧光定量PCR反应液的应用方法，步骤如下：

(1)模板的制备：通过磁珠血浆/血清游离DNA/RNA提取试剂盒从混合血浆中提取血浆游离RNA，并进行逆转录，合成得到混合血浆逆转录的cDNA。

(2)反应液的制备：

按照本发明第一方面目的提供的一种荧光定量PCR反应液的配方进行反应液制备。即，至少包含如下成分：10～50mM pH值8.0～8.9的Tris-HCl，10～60mM的KCl，2～5mM的MgCl₂，100～300μM的dNTP，0.025～0.1U/μL的DNA聚合酶，0.5×ROX，5～10％的基础荧光稳定剂、1～3％的DNA聚合酶增强剂、10～30％的DNA聚合酶增强剂的保护剂。

(3)反应：

步骤(2)制备的反应液在荧光定量PCR仪中进行反应，模板选用步骤(1)制备的混合血浆逆转录的cDNA，PCR扩增条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火34秒，共40个循环。

本发明第三方面的目的是提供一种适用于Taqman-MGB探针的荧光定量PCR试剂盒，基于本发明涉及的一种荧光定量PCR反应液。

本发明涉及的一种荧光定量PCR反应液(以下简称反应液)，包含基础荧光稳定剂、DNA聚合酶增强剂以及保护剂。DNA聚合酶增强剂具有明显的提高DNA聚合酶5'-3'外切酶活性的作用，使普通DNA聚合酶能够水解Taqman-MGB探针。

本发明涉及的反应液不仅适用于FAM、HEX和VIC标记的Taqman-MGB探针，还同时适用于FAM、HEX和VIC标记的Taqman-BHQ1和/或TAMARA探针，具有广泛的应用前景和巨大的市场推广价值。

本发明含增强剂的一种荧光定量PCR反应液扩增样本的Ct值较低；含基础荧光稳定剂的反应液PCR扩增曲线较平，稳定基础荧光值，提高扩增效率；含保护剂的反应液在-20℃环境下保存6个月后仍然具有较强的稳定性，Ct值基本保持不变，延长反应液的有效期。

通过本发明涉及的反应液与现有技术反应液在Taqman-MGB探针应用中的对比实验，本发明涉及的反应液与现有技术反应液的Ct值之差高达4.994，即本发明反应液扩增同样一份临床样本的结果是现有技术反应液的31.87倍，本发明涉及的反应液的灵敏度明显优于现有技术，具有非常广阔的市场前景。

附图说明

图1为实施例1中反应液体系1与反应液体系2对microRNA-21的进行PCR实验的扩增曲线；

图2为实施例2中反应液体系1与反应液体系3对microRNA-21的进行PCR实验的扩增曲线；

图3为实施例3中反应液体系1与反应液体系4在-20℃的条件下保存15天后，对microRNA-21的进行PCR实验的扩增曲线；

图4为实施例4中反应液体系1与商品化体系1对microRNA-21的进行PCR实验的扩增曲线；

图5为实施例6中对反应液体系1与反应液体系4连续监测micriRNA-21的Ct值结果趋势图；

图6为实施例7中商品化反应体系1的microRNA-21标准曲线1；

图7为实施例7中商品化反应体系1的microRNA-21标准曲线2；

图8为实施例7中商品化反应体系2的microRNA-21标准曲线1；

图9为实施例7中商品化反应体系2的microRNA-21标准曲线2；

图10为实施例7中优化反应液体系(反应液体系1)的microRNA-21标准曲线1；

图11为实施例7中优化反应液体系(反应液体系1)的microRNA-21标准曲线2。

具体实施方式

下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。本实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明实施例中涉及的各实验材料说明：

microRNA-21是目前研究最多的miRNAs之一，参与多种肿瘤的发生和一些病理生理改变，本发明具体实施方式以血浆microRNA-21的检测为例，对本发明的技术方案进行具体说明。

5×PCR Buffer pH8.5(江苏然科生物技术有限公司)含：50mM的Tris-HCl，250mM的KCl，20mM的MgCl₂，1000μM的dNTP，5U的Takara EX Taq^TM HS酶，2.5×ROX。dNTP购自上海生工，Takara EX Taq^TM HS酶和50×ROX购自大连宝生物，microRNA-21、引物和探针由上海英骏合成。商品化荧光定量反应预混液购自大连宝生物(商品化体系1)，货号为RR390；Taqman-MGB专用荧光定量反应预混液购自Life公司(商品化体系2)，货号为4440040。

hsa-microRNA-21-5p水解探针序列：5'-CTGGATACGACTCAACA-3'(SEQ ID NO:1)，在其5'端带有荧光基团6-FAM(6-羧基荧光素)，3'端带有荧光淬灭基团MGB。

hsa-miR-21-5p上游引物：5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3'(SEQ ID NO:2)

hsa-miR-21-5p下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'(SEQ ID NO:3)

试剂处理制备及反应方法：

(1)模板的制备：从5份混合血浆中提取血浆游离RNA(磁珠法血浆(血清)游离DNA/RNA提取试剂盒，江苏然科生物技术有限公司)，逆转录合成cDNA(逆转录试剂盒，江苏然科生物技术有限公司)，命名为血浆1、血浆2、血浆3、血浆4、血浆5。

(2)反应液的制备：

按照实施例1～5的配方表进行反应液制备，配方表中所述增强剂为DNA聚合酶增强剂，表中所述保护剂为DNA聚合酶增强剂的保护剂。

其中，表中所述基础荧光稳定剂的成分为25.5％的NP-40和12.5mM的NaCl，表中所述增强剂的成分为0.8％的牛血清蛋白、100mM环糊精和2M甜菜碱，表中所述保护剂的成分为2.5％的明胶和0.03mM二硫苏糖醇。

模板选用5份混合血浆逆转录的cDNA。本发明中反应液体系1为优化反应液体系。

(3)反应：

反应液在荧光定量PCR仪ViiA 7Dx中进行反应，反应液体系1～4、商品化体系1的PCR扩增条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火34秒，共40个循环。

商品化体系2的PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，60℃退火1分钟，共40个循环。

实施例1

优化反应液体系中增强剂的作用，其配方如下：

实施例2

优化反应液体系中基础荧光稳定剂的作用，其配方如下：

实施例3

优化反应液体系中保护剂的作用，其配方如下：

实施例4

优化反应液体系和商品化体系1的荧光定量PCR比较，其配方如下：

实施例5

优化反应液体系和商品化体系2的荧光定量PCR比较，其配方如下：

实施例1～5的实验结果与分析：

实施例1结果如表1和图1所示，含增强剂的反应液体系1扩增的5份血浆的microRNA-21的Ct值为31.61，SD为0.443，而不含增强剂的反应液体系2的Ct值为37.803，SD为1.02。

表1实施例1的micriRNA-21的Ct值结果比较

实施例2结果如图2所示，含基础荧光稳定剂的反应液体系1的基础荧光值曲线较平，而不含基础荧光稳定剂的反应液体系2的基础荧光值随循环数增加呈缓慢上升趋势。

实施例3含保护剂的反应液体系1扩增的5份血浆的microRNA-21的Ct值为31.61，而不含保护剂的反应液体系4的Ct值为31.57，二者差别不大，但当二者共同在-20℃的条件下保存15天，测得反应液体系1扩增的血浆的microRNA-21的Ct值为30.772，而不含保护剂的反应液体系4的Ct值为32.891，如图3所示。

实施例4的结果如表2和图4所示，以5份血浆为样本，反应液体系1测定的micriRNA-21平均Ct值为31.629，SD为0.448，而商品化体系1的平均Ct值为36.623，SD为0.526。从5份血浆的microRNA-21结果可以看出，反应液体系1与商品化体系1两者之间的平均Ct值差为4.994(36.623-31.629)，也就是说反应液体系1扩增同样一份临床样本的结果是商品化体系1的31.87倍，结果说明反应在液体系1在Taqman-MGB探针应用中的灵敏度明显优于商品化体系1。

表2反应液体系1测定血浆中micriRNA-21结果与商品化体系1结果的比较

实施例5的结果如表3所示，以5份血浆为样本，反应液体系1测定的micriRNA-21平均Ct值为31.629，SD为0.448，而商品化体系2的平均Ct值为33.898，SD为0.542。反应液体系1与商品化体系2两者之间的平均Ct值差为2.269(33.898-31.629)，也就是说反应液体系1扩增同样一份临床样本的结果是商品化体系2的4.82倍，结果说明反应液体系1在Taqman-MGB探针应用中的灵敏度同样明显优于Taqman-MGB探针专用的商品化体系2。

表3反应液体系1测定血浆中micriRNA-21结果与商品化体系2结果的比较

实施例6

稳定性实验：

将实施例3的含保护剂的反应液体系1和不含保护剂的反应液体系4，各分装12份，在-20℃环境下保存，每15天(0.5月)取出一支，以逆转录的cDNA为模板，进行PCR扩增的稳定性试验。

检测结果如表4和图5所示，优化体系稳定性的研究表明，含保护剂的反应液体系1在6个月内的Ct值平均为31.458，SD为0.586；而不含保护剂的优化体系Ct值呈上升趋势，在1个半月无法检出micriRNA-21浓度。

表4连续监测micriRNA-21的结果比较

实施例7

优化反应液体系(反应液体系1)、商品化体系1与商品化体系2的标准曲线的制作。

标准曲线模板的制备：人工合成microRNA-21序列，用水稀释microRNA-21序列至10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copies/μl。以稀释的microRNA-21序列为模板逆转录合成microRNA-21cDNA(逆转录试剂盒，江苏然科生物技术有限公司)。

分别以10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copies/μl的microRNA-21逆转录的cDNA为模板，制作标准曲线。结果如下：

表5商品化反应体系1、商品化反应体系2及优化反应液体系的microRNA-21标准曲线结果

如表5和图6～11所示的三组体系标准曲线的结果，表明，商品化体系1的microRNA-21的扩增效率为87.109％，R²为0.984；商品化体系2的microRNA-21的扩增效率为82.43％，R²为0.999；本发明优化体系microRNA-21的扩增效率为96.149％，R²为0.995。

从标准曲线的结果可以看出，本发明能有效的提高扩增效率，扩增效率明显优于商品化体系1和Taqman-MGB探针专用的商品化体系2。从三组体系标准曲线相应浓度的Ct同样可以看出，本发明在扩增合成模板时的灵敏度也明显优于商品化体系的结果。

<110> 江苏然科生物技术有限公司

<120> 一种荧光定量PCR反应液及方法

<160> 3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> hsa-microRNA-21-5p水解探针序列

<400> 1

CTGGATACGACTCAACA 17

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-21-5p上游引物

<400> 2

GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG 24

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hsa-miR-21-5p下游引物

<400> 3

GTGCAGGGTCCGAGGT 16