1.一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法,其特征在于:包括以下步骤:
以待测牛全基因组DNA为模板,以引物对P1、P2或P3为引物,PCR扩增牛PCAF基因片段,然后利用限制性内切酶HindIII对根据引物对P1扩增得到的产物S1进行酶切或利用限制性内切酶ApaI对根据引物对P2或P3扩增得到的产物S2或S3进行酶切,再对酶切后的产物片段进行琼脂糖凝胶电泳,根据凝胶成像系统分析电泳后片段大小,鉴定牛PCAF基因上单核苷酸多态性位点的基因型;
所述引物对P1为:
上游引物F1:5`-GGGTTCCCACTGCACAGGCCAAGCT-3`
下游引物R1:5`-GTCCATCAGACGCCCCCACACAGAG-3`;
所述引物对P2为:
上游引物F2:5`-ACCTTCAAGGCCTTTTACATGCGGG-3`
下游引物R2:5`-TCAAAGAGGAATGGACACAGGCAGA-3`;
所述引物对P3为:
上游引物F3:5`-CTCTTCCCAGTCTCACTTTTGTGGG-3`
下游引物R3:5`-AGGCACACTGTTTGATGAGTTTCTA-3`。
2.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法,其特征在于:所述PCR扩增的反应体系包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix、50ng牛基因组DNA以及10μmol/L的引物对P1、P2或P3的上、下游引物各0.5μL。
3.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法,其特征在于:所述PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火30s,72℃延伸30s,共43个循环,其中,前18个循环退火温度自68℃开始每个循环降低1℃,后25个循环,退火温度为50℃;72℃延伸10min。
4.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法,其特征在于:所述酶切在10μL的酶切体系中进行,酶切体系包括PCR产物5μL、10×T Buffer 1.0μL,0.1%BSA 1.0μL以及15U/μL限制性内切酶0.2μL,酶切条件为37℃消化8~10h。
5.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法,其特征在于:所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度3.0%的琼脂糖凝胶。
6.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法,其特征在于:根据凝胶成像系统分析S1酶切电泳片段大小,鉴定牛PCAF基因上单核苷酸多态性位点存在的三种基因型:TT基因型表现为21bp和57bp的条带,CC基因型表现为78bp的条带;TC基因型表现为78bp、57bp和21bp的条带;根据凝胶成像系统分析S2酶切电泳片段大小,鉴定牛PCAF基因上单核苷酸多态性位点存在的三种基因型:CC基因型表现为191bp和27bp的条带,TT基因型表现为218bp的条带;TC基因型表现为218bp、191bp和27bp的条带;根据凝胶成像系统分析S3酶切电泳片段大小,鉴定牛PCAF基因上单核苷酸多态性位点存在的三种基因型:CC基因型表现为287bp和27bp的条带,TT基因型表现为314bp的条带,CT基因型表现为314bp、287bp和27bp的条带。
7.一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP试剂盒,其特征在于:包括引物对P1、P2和P3;
所述引物对P1为:
上游引物F1:5`-GGGTTCCCACTGCACAGGCCAAGCT-3`
下游引物R1:5`-GTCCATCAGACGCCCCCACACAGAG-3`;
所述引物对P2为:
上游引物F2:5`-ACCTTCAAGGCCTTTTACATGCGGG-3`
下游引物R2:5`-TCAAAGAGGAATGGACACAGGCAGA-3`;
所述引物对P3为:
上游引物F3:5`-CTCTTCCCAGTCTCACTTTTGTGGG-3`
下游引物R3:5`-AGGCACACTGTTTGATGAGTTTCTA-3`。
8.如权利要求7所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括2×Taq PCR MasterMix和灭菌超纯水。
9.一种如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法在牛生长性状的标记辅助选择中的应用。