地黄分子标记指纹图谱的构建及其常见栽培品种的鉴别方法与流程

本发明属于地黄常见栽培品种的鉴别方法技术领域，具体涉及一种地黄分子标记指纹图谱的构建及其常见栽培品种的鉴别方法。

背景技术：

地黄(rehmanniaglutinosa)是玄参科地黄属多年生草本植物，包括天目地黄、裂叶地黄、高地黄、湖北地黄、茄叶地黄和地黄6个种，分布于中国、日本和韩国等国家。在我国，地黄主要分布于河南、山西、辽宁、山东、陕西和安徽等地。地黄根作为药材和食材，具有重要的经济价值。因此，地黄备受人们青睐，广为研究。

目标起始密码子多态性分子标记(startcodontargetedpolymorphism，scot)是一种基于单引物扩增反应的新型目的基因分子标记，是根据植物基因atg起始密码子侧翼保守区域设计单引物，对基因组中atg两侧的区域进行扩增，产生偏向候选功能基因区显性多态性标记，具有能获得与性状联系紧密的目的基因、能对性状进行跟踪、操作简单、重复性好﹑多态性丰富与引物通用性好等优点，已被广泛应用于硬粒小麦遗传多样性分析、中间偃麦草与普通小麦种的系统关系、突尼斯柑橘种的鉴定、君迁子分类、指纹图谱构建、间接器官发生途径再生火索麻植株的遗传纯合率、基因差异表达和分子遗传连锁图谱构建等方面。但是，scot标记在地黄上未见报道。

另外，由于地黄长期营养繁殖和区间的引种交流，多数品种经过长年栽种后品种退化，质量和产量严重下降，外部形态参差不齐。然而，现在对地黄的研究主要包括育种、化学调控和病虫害防治等方面，从分子角度探讨地黄遗传多样性和亲缘关系的研究相对较少。所以，本发明研究以地黄为材料，构建与优化地黄scot-pcr体系，并筛选合适引物，对30份种质进行了scot指纹图谱的构建，为地黄遗传多样性分析和品种鉴定等研究奠定基础，也为地黄常见的7个栽培品种红薯王、抗育831、北京3号、北京2号、金状元、金九和温85-5的区分提供方法。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种鉴定操作简单、重复性好且分辨率高的地黄分子标记指纹图谱的构建及其常见栽培品种的鉴别方法。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，地黄分子标记指纹图谱的构建及其常见栽培品种的鉴别方法，其特征在于具体步骤为：

(1)新鲜地黄样品的收集和预处理，试验用地黄种质收集于河南4个市县、山东2个区县和上海华东师范大学，包括裂叶地黄和地黄这2个种，共30份种质，均经过its测序与ncbi比对，确定为裂叶地黄或地黄种质，取其叶片保存于-70℃冰箱备用，为dna的提取备用；

(2)新鲜地黄样品基因组dna的提取与纯化，取新鲜地黄叶片，根据改良的ctba提取叶片dna，并用1wt％琼脂糖凝胶电泳检测dna完整性，再用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，将样品按所需浓度稀释后置于-20℃条件下保存备用；

(3)scot-pcr扩增，利用所提取的dna为模板，在mjresearchptc.200型扩增仪上进行scot-pcr扩增，pcr扩增体系特征为：总体积为25μl，含有8μlddh2o、1μl浓度为80ng·μl^-1的模板dna、1μl浓度为8μmol·l^-1的引物和15μlmix，退火温度为45℃，扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，36个循环，4℃保存，所用的scot-pcr扩增引物为下列6条单引物：

scot4accatggctaccaccgcg，

scot5acgacatggcgaccgcga，

scot11caacaatggctaccacgt，

scot15acgacatggcgaccatcg，

scot27ccatggctaccaccgcct，

scot29acgacatggcgaccaacg；

(4)琼脂糖凝胶电泳，扩增结束后，吸取扩增产物8-10μl进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，电极缓冲液为1×tae，在geldoctmez凝胶成像仪拍照；

(5)构建各供试样品的scot分子标记指纹图谱，根据6条引物scot4、scot5、scot11、scot15、scot27和scot29的扩增结果，对电泳图谱上清晰且可辨认的条带记为1，无条带记为0，缺失记为9，模糊不清的不予记录，建立30份地黄种质的scot指纹图谱数字化表格；

(6)利用构建的scot分子标记指纹图谱进行7种地黄常见栽培品种的鉴别，利用引物scot4扩增出的特异性条带将北京2号、金状元和金九区分出来，利用引物scot27扩增出的特异性条带将红薯王和抗育831区分出来，利用引物scot15扩增出的特异性条带将红薯王和金状元区分出来，利用引物scot5扩增出的特异性条带将北京3号鉴别出来，利用引物scot11扩增出的特异性条带将温85-5鉴别出来，利用引物scot27扩增出的特异性条带将金九鉴别出来。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明采用scot分子标记技术构建地黄分子标记指纹图谱，对在幼苗期的地黄叶片材料就可以鉴定，保证了材料基源的准确性和稳定性，通过对30份地黄种质的dna提取与纯化、scot-pcr的扩增、琼脂糖凝胶电泳就能得到准确可靠的鉴别图谱，省时省力且成本低廉；

2、本发明通过正交试验对pcr扩增的反应体系和扩增程序进行了优化，使得结果更加稳定可靠；

3、本发明构建地黄分子指纹标记指纹图谱，可根据种质资源的添加不断更新，以满足发展的需要；

4、本发明提供的地黄分子标记指纹图谱构建及其常见栽培品种的鉴定方法，除了可以应用于地黄的种质鉴定之外，也可以应用于其它物种的种质鉴定；

5、利用本发明提供的琼脂糖凝胶电泳图示，也可采用bandscan软件进行指纹图谱的构建，实现地黄种质鉴定的自动化；

6、本发明所筛选出的引物，扩增产物多态性丰富、条带清晰，可用于种间鉴别和种内居群间的鉴定。

附图说明

图1是引物scot4对地黄2个种共30份种质的scot-pcr扩增结果电泳图；

图2是引物scot5对地黄2个种共30份种质的scot-pcr扩增结果电泳图；

图3是引物scot11对地黄2个种共30份种质的scot-pcr扩增结果电泳图；

图4是引物scot15对地黄2个种共30份种质的scot-pcr扩增结果电泳图；

图5是引物scot27对地黄2个种共30份种质的scot-pcr扩增结果电泳图；

图6是引物scot29对地黄2个种共30份种质的scot-pcr扩增结果电泳图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

试验用地黄种质收集于河南4个市县、山东2个区县和上海华东师范大学，包括裂叶地黄和地黄这2个种，共30份种质，均经过its测序与ncbi比对，确定为裂叶地黄或地黄种质，提取基因组dna，用筛选的引物进行scot分子标记分析，以凝胶电泳呈现的条带建立30份种质的scot-pcr分子标记指纹图谱，将所构建的分子标记指纹图谱用于地黄常见7个栽培品种的鉴定。

表130份种质地黄的名称及采集地

具体操作步骤如下：

1、dna的提取与检测

取新鲜地黄叶片，根据改良的ctba提取叶片dna，并用1wt％琼脂糖凝胶电泳检测dna完整性，再用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，将样品按所需浓度稀释后置于-20℃条件下保存备用。

2、基础scot-pcr体系的建立与目标引物的筛选

根据文献初步建立基础的地黄的scot-pcr反应体系，以温85-5、金九、金状元、红薯王等地黄常见栽培种质的dna模板，对设计的32条引物进行初次的筛选。scot-pcr反应体系为20μl，包含8μlddh2o、1μl模板dna(80ng·μl^-1)、1μl引物(8μmol·l^-1)和10μlmix。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，36个循环；72℃延伸5min；4℃保存。采用1wt％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，拍照分析。初次获得扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的14条引物，并正式用于pcr扩增。

3、scot-pcr的正交实验设计

温85-5为地黄最常见的栽培品种。选取温85-5品种dna为模板，以筛选的scot15为引物，针对模板dna浓度、引物浓度,ddh2o体积、pcr反应体系中mix的用量和退火温度5种因素设置5个不同水平，采用l25(5⁶)正交试验设计对基础scot-pcr进行体系优化，2次重复。pcr扩增反应在梯度pcr仪tgradient上进行，扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，退火温度的设定依据正交表1min，72℃延伸2min，36个循环；4℃保存。扩增结束后，吸取扩增产物8-10μl进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，电极缓冲液为1×tae，在geldoctmez凝胶成像仪拍照9+。8号和9号处理组合扩增谱带清晰、易于辨认，呈现多态性。综合各个条带的直观分析，最终确定地黄scot-pcr的最佳反应体系为：ddh2o8μl、模板dna用量80ng·μl^-11μl、引物8μmol·l^-11μl和mix15μl，退火温度45℃，总体积25μl。

表2scot-pcr的正交实验设计参数

4、退火温度优化

退火温度是影响pcr特异性的重要因素。根据正交试验筛选出的最有体系设计单因素实验，对退火温度再次进行梯度优化。试验设置了5个温度梯度：45.0℃、47.0℃、51.3℃、53.3℃、55.0℃。除退火温度不同外，反应程序与筛选出的正交试验体系相同。以条带扩增清晰、呈现多态性为依据，确定本试验的最佳退火温度为45.0℃。

5、正交试验最优体系的验证

用筛选的14条引物和优化后的正交体系，对30份地黄种质dna模板进行扩增，用1wt％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，验证该体系的稳定性、通用性和重复性，同时对14条引物进行第二次筛选。对所得的scot谱带保存并进行数据分析。除scot21和scot25外，所用引物均能在供试材料中扩增出条带清晰、亮度适中、多态性高的条带。如scot4、scot5、scot11、scot15、scot27和scot29在30份地黄材料中的扩增谱带清晰、易于辨认，呈现多态性。由此说明建立和优化的scot分子标记反应体系适用于地黄基因组dna的遗传多样性等后续研究。

6、指纹图谱构建

根据6条引物scot4、scot5、scot11、scot15、scot27和scot29的扩增结果，数据用人工读带的方法，根据scot-pcr扩增产物在凝胶电泳上的相对位置，依据分子量从大到小的顺序读带，对电泳图谱上清晰且可辨认的条带记为1，无条带记为0，缺失记为9，模糊不清的不予记录，建立30份地黄种质的scot指纹图谱数字化表格。

表36条引物构建30份地黄材料的指纹图谱

8、地黄常见栽培品种的鉴别

利用此6条scot多态性引物可有效区分地黄7个常用栽培品种(红薯王、抗育831、北京3号、北京2号、金状元、金九和温85-5)。利用引物scot4扩增出的特异性条带将北京2号、金状元和金九区分出来，利用引物scot27扩增出的特异性条带将红薯王和抗育831区分出来，利用引物scot15扩增出的特异性条带将红薯王和金状元区分出来，利用引物scot5扩增出的特异性条带将北京3号鉴别出来，利用引物scot11扩增出的特异性条带将温85-5鉴别出来，利用引物scot27扩增出的特异性条带将金九鉴别出来

以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。

sequencelisting

<110>河南师范大学

<120>地黄分子标记指纹图谱的构建及其常见栽培品种的鉴别方法

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