本发明属于生物化学技术领域，涉及一种芋螺毒素αd-gexxa中ntd结构域及其优化序列的制备方法及应用。
背景技术
芋螺毒素是一类由生活在热带或者亚热带海洋浅水区的软体动物芋螺在毒液管中分泌的小肽，能够快速且特异性地作用于神经系统，在临床上已显示了重要的应用价值。
芋螺毒素的表达序列(前肽)一般包括了信号肽。信号肽在进化上相对保守，根据其序列，将目前已知的芋螺毒素分为27个超家族，包括a-,b1-,b2-,b3-,c-,d-,e-,f-,g-,h-,i1-,i2-,i3-,j-,k-,l-,m-,n-,o1-,o2-,o3-,p-,s-,t-,v-,y-(kaas,q.,r.yu,a.h.jin,s.dutertreandd.j.craik,2012:conoserver:updatedcontent,knowledge,anddiscoverytoolsintheconopeptidedatabase.nucleicacidsresearch,40,d325-330)和q-超家族(a.lu,l.yang,s.xuandc.wang,2014:variousconotoxindiversificationsrevealedbyavenomicstudyofconusflavidus.molecular&cellularproteomics:mcp,13,105-118)。成熟肽是芋螺毒素的活性序列，通常含有10-40个左右的氨基酸，且富含半胱氨酸。
一条芋螺毒素前肽可以通过不同的剪切方式形成多条成熟肽(a.lu,l.yang,s.xuandc.wang,2014:variousconotoxindiversificationsrevealedbyavenomicstudyofconusflavidus.molecular&cellularproteomics:mcp,13,105-118)，但不同成熟肽的生物学功能差异仍不得而知。
目前已知功能的芋螺毒素生物活性强，能特异地作用于动物细胞膜上的受体和离子通道，对受体和离子通道的不同亚型具有很高的识别力(terlau,h.andb.m.olivera,2004:conusvenoms:arichsourceofnovelionchannel-targetedpeptides.physiologicalreviews,84,41-68)。根据其作用的受体与离子通道靶点的不同，目前已知功能的芋螺毒素又可分为12个不同的家族(kaas,q.,r.yu,a.h.jin,s.dutertreandd.j.craik,2012:conoserver:updatedcontent,knowledge,anddiscoverytoolsintheconopeptidedatabase.nucleicacidsresearch,40,d325-330)，包括alpha(α)，chi(χ)，delta(δ)，epsilon(ε)，gamma(γ)，iota(ι)，kappa(κ)，mu(μ)，omega(ω)，rho(ρ)，sigma(σ)和tau(τ)家族，同一超家族的芋螺毒素往往具有一个功能活性，少数具备多个家族的功能活性。
烟碱型乙酰胆碱受体(nachrs)是动物界中普遍存在的具有重要生理作用和临床研究意义的跨膜蛋白，是一类配体门控型离子通道受体，由不同的α亚基和β亚基组装成很多种亚型，每种亚型都有截然不同的药理学特征。
烟碱型乙酰胆碱受体大体可分为两类：肌肉型乙酰胆碱受体和神经型乙酰胆碱受体。其中，肌肉型乙酰胆碱受体一般由5个亚基构成，即含2个α1亚基、1个β亚基、1个δ亚基和1个γ或ε亚基，γ或ε亚基取决于其是胎儿的乙酰胆碱受体还是成体的乙酰胆碱受体。哺乳动物的神经型nachrs亚型比肌肉型nachrs亚型复杂得多，至少有8种α亚基、3种β亚基，分别为α2-α7、α9、α10(在雏鸡中存在α8)、以及β2-β4。其中α2,α3和α4可以分别同β2或者β4结合，形成功能性受体，比如α2β2、α3β2、α2β4等。此外，α7和α9可以形成同源多聚体。由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物，要研究和阐明各种各样的nachrs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。但总体来说，作为细胞膜上的变构膜蛋白nachrs，介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nachrs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放(talya,corringerpj,guedind,lestagep,changeuxjp.nicotinicreceptors:allosterictransitionsandtherapeutictargetsinthenervoussystem.natrevdrugdiscov.2009,8(9):733-50)。已证实nachrs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，这些疾病包括疼痛、烟酒和毒品成瘾、智障、痴呆、精神分裂症、中枢神经紊乱、癫痫症、帕金森病、精神病、神经肌肉阻滞、重症肌无力、抑郁症、高血压、心率不齐、哮喘、肌肉松弛、中风、乳腺癌和肺癌等(livettbg,sandalldw,keaysd,downj,gaylerkr,satkunanathann,khalilz.therapeuticapplicationsofconotoxinsthattargettheneuronalnicotinicacetylcholinereceptor.toxicon,2006,48(7):810-829)。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nachr激动剂如烟碱，虽然可以缓解上述神经疾病的症状，但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用，且有成瘾性。因此，开发针对nachrs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种来自于中国南海将军芋螺的芋螺毒素αd-gexxa中ntd结构域及其优化序列的制备方法及应用。优化序列为芋螺毒素αd-gexxa的sntd多肽和cntd多肽。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
<ntd多肽>
一种芋螺毒素αd-gexxa的ntd多肽，该ntd多肽为两个具有相同序列的多肽单体通过两个链间二硫键所形成的反向平行的二聚体。该多肽单体的氨基酸序列如seqidno：1所示。该多肽单体的氨基酸序列为dvhrpcqsvrpgrvwgkcsl，每个多肽单体含有两个半胱氨酸(cys)，这两个多肽单体通过两个半胱氨酸的巯基(-sh)形成两个链间二硫键(-s-s-)。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的ntd多肽能够在抑制乙酰胆碱受体中应用。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的ntd多肽也能够在制备用于抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂中应用。
其中，用于抑制乙酰胆碱受体的药物为治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物或治疗癌症的药物。
神经系统疾病为神经痛型、成瘾症型、智障型、痴呆型、精神分裂症型、中枢神经紊乱型、癫痫症型、帕金森病型、精神病型、神经肌肉阻滞型、中毒型、重症肌无力型、抑郁症型、高血压型、高血脂型、炎症型、麻疯病型、心率不齐型、哮喘型、过敏症型、肌肉松弛型、糖尿病型、硬化症型、带状疱疹型、或中风型。癌症为乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤。
优选地，神经痛型为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛；或者，成瘾症型为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾；或者，中毒型为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒；或者，炎症型为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎。
<sntd多肽>
一种芋螺毒素αd-gexxa的sntd多肽，该sntd多肽为两个具有相同序列的多肽单体通过两个链间二硫键所形成的反向平行的二聚体，多肽单体的氨基酸序列如seqidno：2所示。每个多肽单体的氨基酸序列为cqsvrpgrvwgkc，每个多肽单体含有两个半胱氨酸(cys)，这两个多肽单体通过两个半胱氨酸的巯基(-sh)形成两个链间二硫键(-s-s-)。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的sntd多肽能够在抑制乙酰胆碱受体中应用。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的sntd多肽能够在制备用于抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂中应用。
用于抑制乙酰胆碱受体的药物为治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物或治疗癌症的药物。
其中，神经系统疾病为神经痛型、成瘾症型、智障型、痴呆型、精神分裂症型、中枢神经紊乱型、癫痫症型、帕金森病型、精神病型、神经肌肉阻滞型、中毒型、重症肌无力型、抑郁症型、高血压型、高血脂型、炎症型、麻疯病型、心率不齐型、哮喘型、过敏症型、肌肉松弛型、糖尿病型、硬化症型、带状疱疹型、或中风型；或者，癌症为乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤。
优选地，神经痛型为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛；或者，成瘾症型为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾；或者，中毒型为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒；或者，炎症型为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎。
<cntd多肽>
一种芋螺毒素αd-gexxa的cntd多肽，该cntd多肽由一个线性多肽通过一个二硫键成环而形成的环状多肽，该线性多肽的氨基酸序列如seqidno：3所示。该线性多肽的氨基酸序列为cqsvrpgrvwgkpgpqsvrpgrvwgkc。该线性多肽的首尾两端各含有一个半胱氨酸(cys)，这两个半胱氨酸的巯基(-sh)形成一个二硫键(-s-s-)，从而形成环状多肽。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的cntd多肽能在抑制乙酰胆碱受体中应用。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的cntd多肽能在制备用于抑制乙酰胆碱受体药物或试剂中的应用。
用于抑制乙酰胆碱受体的药物为治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物或治疗癌症的药物。
其中，神经系统疾病为神经痛型、成瘾症型、智障型、痴呆型、精神分裂症型、中枢神经紊乱型、癫痫症型、帕金森病型、精神病型、神经肌肉阻滞型、中毒型、重症肌无力型、抑郁症型、高血压型、高血脂型、炎症型、麻疯病型、心率不齐型、哮喘型、过敏症型、肌肉松弛型、糖尿病型、硬化症型、带状疱疹型、或中风型；或者，癌症为乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤。
优选地，神经痛型为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛；或者，成瘾症型为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾；或者，中毒型为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒；或者，炎症型为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎。
上述的乙酰胆碱受体为神经型乙酰胆碱受体或肌肉型乙酰胆碱受体。
优选地，神经型乙酰胆碱受体为α9α10乙酰胆碱受体亚型、α3β2乙酰胆碱受体亚型或α4β2乙酰胆碱受体亚型；或者，肌肉型乙酰胆碱受体为α1β1δε乙酰胆碱受体亚型。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明的芋螺毒素αd-gexxa的ntd、sntd和cntd多肽能特异抑制乙酰胆碱受体的能力，在用于制备抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的芋螺毒素αd-gexxa-ntd的制备线路图。
图2为本发明实施例1的芋螺毒素αd-gexxa-ntd的制备过程中每个步骤的洗脱图。其中，x轴坐标为洗脱时间，y轴坐标为214nm的od吸收值，z轴坐标为每个步骤，其中步骤1为线性肽n18的纯化，步骤2为线性肽n6的纯化，步骤3为dtnb活化后的线性肽n6*的纯化，步骤4为氧化形成第一对二硫键的n6-n18二聚体的纯化，步骤5为最终形成两对二硫键的ntd产物的纯化。
图3为本发明实施例5中的5μm芋螺毒素αd-gexxa-ntd抑制不同亚型乙酰胆碱受体的活性测定结果。
图4为本发明实施例2的sntd制备洗脱曲线和对α9α10亚型乙酰胆碱受体电流的抑制结果。其中，x轴坐标为洗脱时间，y轴坐标为214nm的od吸收值，z轴坐标为每个步骤，其中步骤1为线性肽sn18的纯化，步骤2为线性肽sn6的纯化，步骤3为dtnb活化后的线性肽sn6*的纯化，步骤4为氧化形成第一对二硫键的sn6-sn18二聚体的纯化，步骤5为最终形成两对二硫键的sntd产物的纯化。
图5为本发明实施例3的cntd制备洗脱曲线和对α9α10亚型乙酰胆碱受体电流的抑制结果。其中，x轴坐标为洗脱时间，y轴坐标为214nm的od吸收值，z轴坐标为每个步骤，其中步骤1为线性肽cntd的纯化，步骤2形成二硫键的cntd产物的纯化。
图6为本发明实施例4的cntd-rq制备洗脱曲线和对α9α10亚型乙酰胆碱受体电流的抑制结果。其中，x轴坐标为洗脱时间，y轴坐标为214nm的od吸收值，z轴坐标为每个步骤，其中步骤1为线性肽cntd-rq的纯化，步骤2形成二硫键的cntd-rq产物的纯化。
图7为本发明实施例5的芋螺毒素αd-gexxa的ntd、sntd、cntd抑制不同亚型乙酰胆碱受体的活性测定结果。其中，横坐标表示不同的乙酰胆碱亚型，纵坐标为相对于没有毒素条件下的电流幅度。
图8为本发明实施例5的芋螺毒素ntd抑制乙酰胆碱受体人源α9α10亚型和鼠源α1β1δε亚型的剂量依赖曲线图。其中，横坐标是所加ntd的浓度对数值，纵坐标表示相对于没有毒素条件下的电流幅度。
图9为本发明实施例5的芋螺毒素cntd抑制乙酰胆碱受体人源α9α10亚型和鼠源α1β1δε亚型的剂量依赖曲线图。其中，横坐标是所加cntd的浓度对数值，纵坐标表示相对于没有毒素条件下的电流幅度。
具体实施方式
本发明提供了来自于中国南海将军芋螺的芋螺毒素αd-gexxa的ntd、sntd和cntd多肽及其制备和应用。
<ntd多肽>
一种芋螺毒素αd-gexxa的ntd多肽，该ntd多肽为两个具有相同序列的多肽单体通过两个链间二硫键所形成的反向平行的二聚体。该多肽单体的氨基酸序列如seqidno：1所示。该多肽单体的氨基酸序列为dvhrpcqsvrpgrvwgkcsl，每个多肽单体含有两个半胱氨酸(cys)，这两个多肽单体通过两个半胱氨酸的巯基(-sh)形成两个链间二硫键(-s-s-)。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的ntd多肽能够在抑制乙酰胆碱受体中应用。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的ntd多肽也能够在制备用于抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂中应用。
其中，用于抑制乙酰胆碱受体的药物为治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物或治疗癌症的药物。
神经系统疾病为神经痛型、成瘾症型、智障型、痴呆型、精神分裂症型、中枢神经紊乱型、癫痫症型、帕金森病型、精神病型、神经肌肉阻滞型、中毒型、重症肌无力型、抑郁症型、高血压型、高血脂型、炎症型、麻疯病型、心率不齐型、哮喘型、过敏症型、肌肉松弛型、糖尿病型、硬化症型、带状疱疹型、或中风型。癌症为乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤。
优选地，神经痛型为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛；或者，成瘾症型为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾；或者，中毒型为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒；或者，炎症型为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎。
<sntd多肽>
一种芋螺毒素αd-gexxa的sntd多肽，该sntd多肽为两个具有相同序列的多肽单体通过两个链间二硫键所形成的反向平行的二聚体，多肽单体的氨基酸序列如seqidno：2所示。每个多肽单体的氨基酸序列为cqsvrpgrvwgkc，每个多肽单体含有两个半胱氨酸(cys)，这两个多肽单体通过两个半胱氨酸的巯基(-sh)形成两个链间二硫键(-s-s-)。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的sntd多肽能够在抑制乙酰胆碱受体中应用。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的sntd多肽能够在制备用于抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂中应用。
用于抑制乙酰胆碱受体的药物为治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物或治疗癌症的药物。
其中，神经系统疾病为神经痛型、成瘾症型、智障型、痴呆型、精神分裂症型、中枢神经紊乱型、癫痫症型、帕金森病型、精神病型、神经肌肉阻滞型、中毒型、重症肌无力型、抑郁症型、高血压型、高血脂型、炎症型、麻疯病型、心率不齐型、哮喘型、过敏症型、肌肉松弛型、糖尿病型、硬化症型、带状疱疹型、或中风型；或者，癌症为乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤。
优选地，神经痛型为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛；或者，成瘾症型为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾；或者，中毒型为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒；或者，炎症型为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎。
<cntd多肽>
一种芋螺毒素αd-gexxa的cntd多肽，该cntd多肽由一个线性多肽通过一个二硫键成环而形成的环状多肽，该线性多肽的氨基酸序列如seqidno：3所示。该线性多肽的氨基酸序列为cqsvrpgrvwgkpgpqsvrpgrvwgkc。该线性多肽的首尾两端各含有一个半胱氨酸(cys)，这两个半胱氨酸的巯基(-sh)形成一个二硫键(-s-s-)，从而形成环状多肽。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的cntd多肽能在抑制乙酰胆碱受体中应用。
上述的芋螺毒素αd-gexxa的cntd多肽能在制备用于抑制乙酰胆碱受体药物或试剂中的应用。
用于抑制乙酰胆碱受体的药物为治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物或治疗癌症的药物。
其中，神经系统疾病为神经痛型、成瘾症型、智障型、痴呆型、精神分裂症型、中枢神经紊乱型、癫痫症型、帕金森病型、精神病型、神经肌肉阻滞型、中毒型、重症肌无力型、抑郁症型、高血压型、高血脂型、炎症型、麻疯病型、心率不齐型、哮喘型、过敏症型、肌肉松弛型、糖尿病型、硬化症型、带状疱疹型、或中风型；或者，癌症为乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤。
优选地，神经痛型为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛；或者，成瘾症型为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾；或者，中毒型为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒；或者，炎症型为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎。
上述的乙酰胆碱受体为神经型乙酰胆碱受体或肌肉型乙酰胆碱受体。
优选地，神经型乙酰胆碱受体为α9α10乙酰胆碱受体亚型、α3β2乙酰胆碱受体亚型或α4β2乙酰胆碱受体亚型；或者，肌肉型乙酰胆碱受体为α1β1δε乙酰胆碱受体亚型。
因为ntd、sntd、cntd能够抑制的乙酰胆碱受体包括神经型乙酰胆碱受体或肌肉型乙酰胆碱受体。其中，神经型乙酰胆碱受体为hα9α10乙酰胆碱受体亚型、hα3β2乙酰胆碱受体亚型和hα4β2乙酰胆碱受体亚型；肌肉型乙酰胆碱受体为α1β1δε乙酰胆碱受体亚型。所以可以被用来制成抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂，如制成治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物，或者治疗癌症的药物等。
神经系统疾病特指与乙酰胆碱受体相关的神经系统疾病，例如：神经痛型的神经系统疾病、成瘾症型的神经系统疾病、智障型的神经系统疾病、痴呆型的神经系统疾病、精神分裂症型的神经系统疾病、中枢神经紊乱型的神经系统疾病、癫痫症型的神经系统疾病、帕金森病型的神经系统疾病、精神病型的神经系统疾病、神经肌肉阻滞型的神经系统疾病、中毒型的神经系统疾病、重症肌无力型的神经系统疾病、抑郁症型的神经系统疾病、高血压型的神经系统疾病、高血脂型的神经系统疾病、炎症型的神经系统疾病、麻疯病型的神经系统疾病、心率不齐型的神经系统疾病、哮喘型的神经系统疾病、过敏症型的神经系统疾病、肌肉松弛型的神经系统疾病、糖尿病型的神经系统疾病、硬化症型的神经系统疾病、带状疱疹型的神经系统疾病、或中风型的神经系统疾病等。
其中，神经痛型的神经系统疾病表现为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛等症状。
成瘾症型的神经系统疾病表现为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾等症状。
中毒型的神经系统疾病表现为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒等。
炎症型的神经系统疾病表现为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎等。
癌症特指与乙酰胆碱受体相关的癌症，例如：乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤等。
以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：芋螺毒素αd-gexxa的ntd制备(化学合成法)
发明人在研究中发现：芋螺毒素αd-gexxa的ntd(αd-gexxa-ntd)对乙酰胆碱受体也具有抑制作用，例如，对α9α10乙酰胆碱受体亚型具有比较强的抑制作用。因此，有必要对芋螺毒素αd-gexxa成熟肽的n端进行化学合成。
图1为本发明实施例1的芋螺毒素αd-gexxa-ntd的制备线路图。如图1所示，为了得到反平行的ntd二聚体，首先化学合成两个多肽，这两个多肽序列是αd-gexxa中1-20的氨基酸序列。第一条多肽(n6)第六位半胱氨酸巯基(-sh)没有被保护，而第18位半胱氨酸巯基被acm(acetamidomethyl，乙酰胺基甲基)保护(-s-acm)。第二条多肽(n18)第六位半胱氨酸巯基被acm保护(-s-acm)，而第18位半胱氨酸巯基没被保护(-sh)。在这两条多肽合成过程中，为避免体外氧化折叠时发生二硫键错配，在二聚体中形成链间二硫键的第19位半胱氨酸(cys)被替换为丝氨酸(ser)。
在本实施例中，αd-gexxa-ntd的具体制备步骤如下：
(1)n6的第六位半胱氨酸巯基被dtnb(5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoicacid)，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸))活化：1μg/μl的n6与1mmdtnb在150mmpbs，ph＝7.3，室温避光反应15分钟后用0.1％tfa终止，反应产物经hplc纯化和质谱鉴定分子量，获取折叠正确的产物(n6的第六位半胱氨酸巯基(-sh)被dtnb活化，成为-s*，整个肽链以n6*进行表示)；
(2)n6的第六位半胱氨酸与n18的第18位半胱氨酸形成第一对二硫键：0.4μg/μln6*和0.3μg/μln18，在150mmpbs，ph＝7.3，室温避光反应15分钟后用0.1％tfa终止，反应产物经hplc纯化和质谱鉴定分子量，获取折叠正确的产物(n6-n18)；
(3)n6-n18二聚体进一步氧化形成ntd二聚体：n6-n18二聚体溶于75％乙酸和150mm盐酸中，加i2至终浓度为2mm，避光反应10min，氧化形成ntd，反应完成后加入维生素c终止反应，反应产物经hplc纯化和质谱鉴定分子量，获取折叠正确的产物(ntd)。
由图1可知，该ntd多肽是由两个具有相同序列的多肽单体通过两个链间二硫键所形成的反向平行的二聚体，第一个多肽单体的第6位半胱氨酸的巯基(-sh)与第二个多肽单体的第18位半胱氨酸的巯基(-sh)形成一个链间二硫键，第一个多肽单体的第18位半胱氨酸的巯基(-sh)与第二个多肽单体的第6位半胱氨酸的巯基(-sh)形成一个链间二硫键。
本发明实施例1的芋螺毒素αd-gexxa-ntd的洗脱图如图2所示。
实施例2，sntd具体制备步骤如下：
(1)sn6的第6位半胱氨酸的巯基被dtnb活化：1μg/μl的sn6与1mmdtnb在150mmpbs，ph7.3，室温避光反应15分钟后用0.1％tfa终止，反应产物经hplc纯化和质谱鉴定分子量，获取折叠正确的产物(sn6第6位半胱氨酸被dtnb活化成sn6*)；sn6即图1的n6去掉首尾两端(dvhrp和sl)，即为cqsvrpgrvwgkc。
(2)sn6的第六位半胱氨酸与sn18的第18位半胱氨酸形成第一对二硫键：0.4μg/μlsn6*和0.3μg/μlsn18，在150mmpbs，ph7.3，室温避光反应15分钟后用0.1％tfa终止，反应产物经hplc纯化和质谱鉴定分子量，获取折叠正确的产物(sn6-sn18)；
(3)sn6-sn18二聚体进一步氧化形成sntd二聚体：sn6-sn18二聚体溶于75％乙酸和150mm盐酸中，加i2至终浓度为2mm，避光反应10min，氧化形成sntd，反应完成后加入维生素c终止反应，反应产物经hplc纯化和质谱鉴定分子量，获取折叠正确的产物(sntd)。
该sntd多肽是由两个具有相同序列的多肽单体通过两个链间二硫键所形成的反向平行的二聚体，这两个多肽单体的首尾两端均为半胱氨酸，第一个多肽单体的首端半胱氨酸的巯基(-sh)与第二个多肽单体的末端半胱氨酸的巯基(-sh)形成一个链间二硫键，第一个多肽单体的末端半胱氨酸的巯基(-sh)与第二个多肽单体的首端半胱氨酸的巯基(-sh)形成一个链间二硫键。
实施例3，cntd具体制备步骤如下：
合成一个27个氨基酸的线性肽，粗肽先经过hplc纯化，纯化后的多肽溶解于50mmtris·hcl,ph8.1,多肽浓度为0.075μg/μl，在4℃空气氧化24h，反应完成后加入0.1％tfa调酸终止，反应产物经hplc纯化和质谱鉴定分子量，获取折叠正确的产物(cntd)。
实施例4，cntd的突变体cntd-rq具体制备步骤如下：
合成一个27个氨基酸的线性肽，粗肽先经过hplc纯化，纯化后的多肽溶解于50mmtris·hcl,ph8.1,多肽浓度为0.075μg/μl，在4℃空气氧化24h，反应完成后加入0.1％tfa调酸终止，反应产物经hplc纯化和质谱鉴定分子量，获取折叠正确的产物(cntd-rq)。
实施例5：芋螺毒素αd-gexxa-ntd，sntd，cntd，cntd-rq多肽的生物学活性测定
为了测定芋螺毒素αd-gexxa-ntd，sntd，cntd多肽对乙酰胆碱受体亚型(nachrsubtype)的选择性，本发明采用电生理实验测试二者对爪蟾卵母细胞表达的人源神经型乙酰胆碱受体α9α10亚型、α7亚型、α3β2亚型、α3β4亚型、α4β2亚型、α4β4亚型和鼠源肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε的作用。
图3为本发明实施例5的芋螺毒素αd-gexxa-ntd抑制不同亚型乙酰胆碱受体的活性测定结果。
电生理实验的具体步骤如下所示：将乙酰胆碱受体的不同亚型分别表达在非洲爪蟾的卵母细胞表面，用双电极电压钳方法纪录加入乙酰胆碱时引起的乙酰胆碱受体开放所产生的电流。加入不同浓度的ntd、cntd时，乙酰胆碱受体产生的电流会受到不同程度的抑制。将抑制程度对ntd、cntd的浓度作图，用以下方程拟合即可得到半抑制浓度ic50和hill系数：
ex＝emaxxnh/(xnh+ic50nh)
电生理实验的测试结果如下表1和图4至图9所示。
表1
表1的h表示human，即乙酰胆碱受体为人源。由图4至图9的数据可知，芋螺毒素ntd、sntd和cntd可以与多种乙酰胆碱受体亚型相互作用，其中对hα9α10、hα3β2、hα4β2和α1β1δε乙酰胆碱受体亚型均具有较强的拮抗作用，对α3β4、α4β4和α7乙酰胆碱受体亚型的作用很弱。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>同济大学伍伦贡大学
<120>芋螺毒素αd-gexxa中ntd结构域及其优化序列的制备方法及应用
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2025