本发明属于以免疫刺激添加剂，例如化学佐剂为特征技术领域，尤其涉及一种非结构蛋白nsp4、重组杆状病毒液及其制备方法、粘膜佐剂。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：制备安全、高效的粘膜疫苗是当代疫苗发展的一个新趋势，多数蛋白抗原通过粘膜免疫途径接种时诱导的机体免疫应答不足是粘膜疫苗存在的最主要问题。提高粘膜免疫的效果,重点在于免疫佐剂及抗原呈递系统的优化，而疫苗佐剂是制约新型疫苗发展的最主要瓶颈之一。理想的佐剂显著减少抗原使用的剂量，有效诱导机体产生早期、高效和持久的免疫应答，并具有良好的安全性。因此，发现具有潜在佐剂活性的化合物组分，继而筛选和优化，并对佐剂的作用特点及作用机制进行研究，是研发安全、高效的粘膜疫苗，有效防控粘膜感染所致传染病的一个关键环节。目前的粘膜免疫佐剂研究中，以霍乱毒素(choleratoxin,ct)和大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxinsproducedbyescherichiacoli,lt)为代表的细菌肠毒素是研究广泛，也最为有效的增强粘膜免疫应答的免疫刺激分子。ct和lt强有力的粘膜佐剂活性已被大量实验证明，然而两者的固有毒性却阻碍了它们在人体的应用。经滴鼻免疫的lt和ct可能在脑内聚集，从而引发神经毒性的相关研究。随后对ct和lt的一系列减毒突变体或者亚单位进行的研究虽然证实了这些减毒突变体类似的粘膜佐剂活性，但总的来讲其佐剂效应都较全蛋白明显减弱。
综上所述，现有技术存在的问题是：以霍乱毒素(ct)和大肠杆菌不耐热肠毒素(lt)强有力的粘膜佐剂效应都较全蛋白明显减弱。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种非结构蛋白nsp4、重组杆状病毒液及其制备方法、粘膜佐剂。
本发明是这样实现的，一种轮状病毒非结构蛋白nsp4，所述轮状病毒的非结构蛋白nsp4的序列为seqidno：1。
本发明的另一目的在于提供一种由所述轮状病毒非结构蛋白nsp4得到的重组杆状病毒液。
本发明的另一目的在于提供一种所述重组杆状病毒液的制备方法，所述重组杆状病毒液的制备方法包括：
(1)利用基因合成的方法人工合成轮状病毒nsp4基因序列，将鉴定正确的重组质粒pfastbac-nsp4作为供体质粒，将nsp4基因转座到重组acbacmid上，用m13引物鉴定转座的成功后将阳性克隆命名为bac-nsp4；
(2)抽提重组bacmids，在脂质体介导下，将重组杆粒bac-nsp4转染对数生长期昆虫细胞sf9，普通光学显微镜下观察，待细胞存活率降到约30％时，收集培养基上清，3000r/min离心10min，收集上清，即为p1代重组杆状病毒液；
(3)提取病毒基因组，用nsp4基因引物进行pcr鉴定，确定所获得的杆状病毒是携带了目的基因nsp4的重组杆状病毒；用p1代病毒感染新的sf9细胞，获得p2代病毒液。
本发明的另一目的在于提供一种所述重组杆状病毒液的滴度测定方法，所述重组杆状病毒液的滴度测定方法包括：用噬斑的方法检测重组杆状病毒的滴度，将病毒10倍系列稀释后接种于6孔板中的sf9细胞，病毒吸附1.5h后，弃病毒稀释液，每孔加入2ml含中性红的噬斑培养基，27℃倒置培养，出斑后经结晶紫染色，按照噬斑测定病毒滴度公式计算出重组杆状病毒的滴度；
滴度＝1/稀释倍数×空斑数×1/接种量；滴度单位为：pfu/ml；接种量单位为ml。
本发明的另一目的在于提供一种所述重组杆状病毒液的类病毒颗粒的包装及纯化方法，所述重组杆状病毒液的类病毒颗粒的包装及纯化方法包括：重组杆状病毒acmnpv-nsp4按moi＝5感染sf9细胞，27℃培养72h；以2000r/min离心10min收集细胞，去除培养基，用pbs回溶沉淀，于－80℃反复冻融3次，加入np40裂解液，静置4℃反应30min后，12000r/min离心30min，收集上清液；将上清液轻轻铺到连续蔗糖密度梯度(20％～50％上部，180000r/min4℃离心6h，弃上清，用pbs缓冲液回溶沉淀，即为纯化后的蛋白溶液。
本发明的另一目的在于提供一种由所述轮状病毒的非结构蛋白nsp4制备的粘膜佐剂。
本发明的另一目的在于提供一种由所述粘膜佐剂制备的粘膜疫苗。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：轮状病毒(rotavirus，rv)的非结构蛋白nsp4，作为一个既具有类肠毒素活性，又可作为tlr配体的蛋白分子。rvnsp4是一个分子量为28kd的多功能糖蛋白，它含有编码175个氨基酸的唯一开放读码框(orf)，其中第114到135氨基酸残基序列相对保守，具有类似肠毒素活性。可诱发新生小鼠腹泻症状，与病毒的致病性密切相关。虽然具有肠毒素活性，但rvnsp4这种肠毒素效应具有严格的时间和剂量依赖性，对绝大多数非新生的动物模型和人类都不能引起腹泻症状，如果作为粘膜佐剂应用于疫苗相对于传统细菌毒素应会具有更好的安全性。
本发明的bac-to-bac杆状病毒表达系统作为一种成熟的真核表达体系，具有安全性高、容量大、快速高效等优点，是一种理想的表达系统，也是一种有效的vlp构建工具。另外，bac-to-bac杆状病毒表达系统经过优化后，可根据蓝白斑进行筛选，不存在野生型和非重组型病毒交叉污染的问题，因此不需要再通过空斑来纯化病毒，这使其在疫苗研究中更具有优势。本发明利用bac-to-bac杆状病毒表达系统表达轮状病毒非结构蛋白nsp4，经蔗糖密度梯度离心纯化后，电镜观察可见大量形态规则，大小约为24～30nm的病毒样颗粒。
附图说明
图1是本发明实施例提供的重组杆状病毒液的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的icr小鼠免疫后ova特异性igg产生情况示意图；
图3是本发明实施例提供的icr小鼠免疫后ova特异性肠道siga产生情况示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明以杆状病毒系统表达重组rvnsp4病毒蛋白作为一种粘膜佐剂，既是对具有潜在佐剂活性分子的效应验证，也包含了对新型粘膜佐剂开发及转化的前期研究，具有重要的理论意义和研究价值。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的轮状病毒非结构蛋白nsp4的序列为seqidno：1。
本发明实施例提供的基于轮状病毒的非结构蛋白nsp4的粘膜佐剂。
如图1所示，本发明实施例提供的重组杆状病毒液的制备方法包括以下步骤：
s101：利用基因合成的方法人工合成轮状病毒nsp4基因序列，将鉴定正确的重组质粒pfastbac-nsp4作为供体质粒，将nsp4基因转座到重组acbacmid上，用m13引物鉴定转座的成功后将阳性克隆命名为bac-nsp4；
s102：抽提重组bacmids，在脂质体介导下，将重组杆粒bac-nsp4转染对数生长期昆虫细胞sf9，普通光学显微镜下观察，待细胞存活率降到约30％时，收集培养基上清，3000r/min离心10min，收集上清，即为p1代重组杆状病毒液；
s103：提取病毒基因组，用nsp4基因引物进行pcr鉴定，确定所获得的杆状病毒是携带了目的基因nsp4的重组杆状病毒；用p1代病毒感染新的sf9细胞，获得p2代病毒液。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作详细的描述。
表达系统材料：重组杆状病毒包装系统，包括昆虫细胞sf9、大肠杆菌dh10，重组质粒pfastbac。
1.重组杆状病毒的包装
利用基因合成的方法人工合成轮状病毒nsp4基因序列，将鉴定正确的重组质粒pfastbac-nsp4作为供体质粒，参考bac-to-bac杆状病毒表达系统操作手册，将nsp4基因转座到重组acbacmid上，用m13引物鉴定转座的成功后将阳性克隆命名为bac-nsp4。
抽提重组bacmids，在脂质体介导下，将重组杆粒bac-nsp4转染对数生长期昆虫细胞sf9，普通光学显微镜下观察，待细胞存活率降到约30％时，收集培养基上清，3000r/min离心10min，收集上清，即为p1代重组杆状病毒液。提取病毒基因组，用nsp4基因引物进行pcr鉴定，确定所获得的杆状病毒是携带了目的基因nsp4的重组杆状病毒。用p1代病毒感染新的sf9细胞，即可获得p2代病毒液，以此类推。
2.重组杆状病毒滴度的测定
用噬斑的方法检测重组杆状病毒的滴度，将病毒10倍系列稀释后接种于6孔板中的sf9细胞，病毒吸附1.5h后，弃病毒稀释液，每孔加入2ml含中性红的噬斑培养基，27℃倒置培养，出斑后经结晶紫染色，按照噬斑测定病毒滴度公式计算出重组杆状病毒的滴度。
滴度(pfu/ml)＝1/稀释倍数×空斑数×1/接种量(ml)。
3.类病毒颗粒的包装及纯化
重组杆状病毒acmnpv-nsp4按moi＝5感染sf9细胞，27℃培养72h。以2000r/min离心10min收集细胞，去除培养基，用pbs回溶沉淀，于－80℃反复冻融3次，加入np40裂解液，静置4℃反应30min后，12000r/min离心30min，收集上清液。将上清液轻轻铺到连续蔗糖密度梯度(20％～50％)上部，180000r/min4℃离心6h，弃上清，用pbs缓冲液回溶沉淀，即为纯化后的蛋白溶液。
下面结合实验对本发明的应用效果做详细的描述。
本发明以杆状病毒系统表达携带nsp4的病毒样颗粒研究nsp4的佐剂活性，探索了nsp4与ova滴鼻共免疫小鼠的剂量范围。设置5μg和20μg两个剂量组，实验结果发现：icr小鼠经免疫后的ova+nsp4免疫组无论nsp4低剂量组，还是高剂量组，血清igg抗体水平均高于ova单独免疫组(图2)；肠匀浆液siga水平较ova单独免疫组也有一定水平的增高(图3)。
nsp4高剂量组cd4+、cd69+、cd8+cd69+淋巴细胞构成百分比的平均数相比ova免疫组也有分别有11％，5％和3％的增加。提示nsp4可能同时在体液免疫和细胞免疫方面均增强了针对ova的特异性免疫应答。
以ova作为特异刺激原，体外刺激脾细胞48h后，包被于96孔板的ifn-γ和il-4抗体捕获分泌相应细胞因子的细胞，显色后利用elispot计数仪对得到的结果进行计数分析，以实验孔减去阴性对照孔斑点数之差作为有效斑点数，各组有效斑点平均数见表1。各实验免疫组的ifn-γ和il-4分泌细胞数均高于阴性对照组(p<0.05)；ova+nsp4(5μg)低剂量组和ova+nsp4(20μg)高剂量组免疫小鼠组特异性分泌ifn-γ的脾细胞平均数还高于ova组(p<0.05)，而上述3组间分泌il-4的脾细胞平均数未显示出统计学差异。
表1：免疫小鼠分泌ifn-γ和il-4的脾淋巴细胞elispot计数
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>昆明学院
<120>非结构蛋白nsp4、重组杆状病毒液及制备、粘膜佐剂
<141>2018-07-17
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>689
<212>dna
<213>轮状病毒(rotavirus)
<400>1
atggataagcttgccgacctcaactacacattgagtgtaatcactttaatgaatgacaca60
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