本发明涉及药物纯化
技术领域：
，具体涉及一种环孢菌素a粗品的制备方法及其用于高效制备高纯度环孢菌素a的方法。
背景技术：
环孢菌素a是一种含有11个氨基酸的环状多肽化合物，是一种作用很强的免疫抑制剂，广泛应用于肾脏、肝脏、心脏和肺等实体器官移植后的抗排异治疗。它还可以用于治疗成人的特应性皮炎，及用来治疗一些自身免疫疾病。目前，环孢菌素a主要通过微生物发酵的方法获得。发酵完成的发酵液中，除了含有环孢菌素a以外，还含有b、c、d、g、h等其他几种环孢菌素以及培养基成分、各种菌体代谢物等其它杂质。现有技术对环孢菌素a提纯的主要工艺路线为先用有机溶剂提取，然后通过不同类型的柱层析或结合结晶进行分离纯化。us5656459公开了经特定含量范围的非活性成分组成的培养基静态发酵后，发酵液用甲醇萃取得到一次残留物，一次残留物脱色后经乙酸乙酯萃取得到二次残留物，二次残留物经硅胶柱层析纯化，用正己烷/氯仿/甲醇洗脱得到三次残留物，最后再用树脂柱纯化，甲醇洗脱获得环孢菌素a。该方法经两次常规萃取得到环孢菌素a粗品，柱层析前粗品杂质种类和含量较多，需两次柱层析纯化，且使用毒性较大的氯仿和甲醇做洗脱剂，生产成本高、环境不友好，不适用于工业化生产。wo20010064935公开了将发酵液用甲醇萃取后，浓缩液中加入明矾搅拌3小时，过滤，滤饼用环己烷溶解，浓缩后得到纯度为59.8％的环孢菌素a粗品，粗品再经凝胶过滤、柱层析和结晶纯化得到环孢菌素a产品。cn200510108097.9公开了向发酵液中直接加丙酮、过滤，减压浓缩，再用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干后用丙酮/水/正己烷三相萃取两次，再用丙酮/水于-5℃结晶3天，硅胶60进行柱层析纯化，活性炭脱色，最后在-15℃条件下重结晶得到纯度大于98.5％的产品，总收率55.1％-64.9％。该工艺需多次萃取，其中丙酮/水/正己烷三相萃取时难于分层，使用的硅胶60填料价格昂贵，且第一次结晶需要3天，整个工艺耗时长。cn200910253905.9公开了一种大孔吸附树脂柱和硅胶柱层析相结合的分离方法。向发酵液中加naoh溶液调节ph至中性，加入有机溶剂提取环孢菌素a。依次用大孔吸附树脂层析和硅胶柱层析纯化，收集纯度合格的环孢菌素a洗脱液，最后经结晶纯化，获得纯度大于98.5％的成品，总收率65.3-70.1％。该方法需两次柱层析，溶剂用量大，生产成本高，不适合工业化生产。另有其他数十篇文献公开了环孢菌素a的分离纯化方法。如专利us597638公开了一种利用高压二氧化碳作为流动载体通过硅胶柱层析获得环孢菌素a的方法；《中国抗生素杂志，2008，5，276-280》使用大孔吸附树脂结合高速逆流色谱分离纯化；us5382655公开了一种用氯仿、二氯甲烷和乙醇作为流动相分离纯化环孢菌素a的硅胶柱层析方法等等。总结现有技术中的分离纯化方法可知，发酵液用有机溶剂萃取后，需经硅胶柱层析联合其他层析或结晶纯化，或使用特殊设备的层析分离才能获得比较高纯度的环孢菌素a。这是因为前期分离提取获得的粗品中含有较多的杂质，如wo20010064935中公开，粗品的纯度为59.8％。现有技术一般采用在发酵液经浸提、萃取后，通过预层析纯化来提高粗品的纯度，但获得的粗品纯度并不理想，市售的环孢菌素a粗品的纯度约为65％，且此时柱层析上样量很低，生产成本高。因此，为了高效获得高纯度的环孢菌素a，开发新的、易于操作的前期纯化工艺，减少杂质含量，利于后续获得高纯度产品，具有非常重要的意义。技术实现要素：本发明的目的就是为了克服纯化分离环孢菌素a发酵液时杂质多，分离难度大，现有纯化方法复杂、耗时长、中间体粗品质量低、柱层析环孢菌素a上样量低的不足。提供一种操作简单地获取较高纯度的环孢菌素a粗品及利用该粗品高效制备高纯度的环孢菌素a的方法。解决了现有工艺复杂、步骤繁琐、纯化方法耗时长、硅胶及洗脱溶剂用量大、环境不友好、不利于工业化大生产的问题。为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：本发明首先提供一种环孢菌素a粗品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、将环孢菌素发酵液过滤，菌渣用乙醇解析后浓缩，驱除全部乙醇或部分乙醇，得浓缩物；(2)、浓缩物加碱液处理得处理液；(3)、处理液用有机溶剂萃取，脱色，浓缩后结晶得环孢菌素a粗品。其中，所得粗品纯度在90％以上。提取液中加入碱液处理，发生的皂化反应可去除大量油脂等杂质，同时也利于萃取分层。结晶后获得的环孢菌素a粗品较现有技术中常用的作为上样液的提取液中间体更稳定，有利于保存。在一种优选实施方式中，步骤(2)中所述碱液选自naoh溶液、koh溶液或na2co3溶液，优选naoh溶液；在一种优选实施方式中，步骤(2)中所述碱液浓度为0.5-1.5n，优选1n；在一种优选实施方式中，步骤(2)中所述加碱液处理为加碱液至ph＝9.5～11.5，并于50～60℃水浴中搅拌2小时，优选60℃。在一种优选实施方式中，步骤(3)中所述有机溶剂为乙酸乙酯，乙酸乙酯与处理液的体积比为3-4∶1。在一种优选实施方式中，步骤(3)中所述脱色为，加入萃取液体积2-4％(w/v)的活性炭，搅拌2小时，过滤、洗涤得脱色液。在一种优选实施方式中，步骤(3)中所述结晶的方法为，浓缩后的残留物中加入丙酮，残留物与丙酮的重量体积比为0.8-1.5∶1，-5℃至-18℃下放置结晶20小时以上。利用本发明所得环孢菌素a粗品可制得纯度99.5％以上的环孢菌素a。一般发酵液经过溶剂浸提，多次萃取或一次大孔树脂分离纯化，所得环孢菌素a中间体经柱层析纯化时，上柱容量为每克层析介质的20-45mg总亿，柱层析收率为60％左右，而用柱层析纯化本发明所得的环孢菌素a粗品，上柱容量可达每克层析介质的50-75mg总亿，柱层析收率可达80％以上。收集环孢菌素a组分大于98.5％层析流份，浓缩，结晶，高收率地得到满足要求的高纯度环孢菌素a精品。与现有技术相比，本发明取得的意料不到的技术效果如下：1、本发明将提取液经简单的后处理纯化，大幅提升了环孢菌素a粗品的纯度，操作简单，节约设备和溶剂，环境友好，成本低，非常适合工业化生产，且获得的产品易于储存；2、利用本发明提供的环孢菌素a粗品可高收率地获得高纯度的环孢菌素a成品，纯度可达99.5％以上，提高了药品的质量和安全性。附图说明图1是本发明实施例1所得环孢菌素a粗品的晶体扫描图。图2是本发明实施例1所得环孢菌素a粗品的hplc谱图。具体实施方式为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但具体的实施方式并不意味着对本发明有任何限制。本发明用到的仪器如下：采用日本日立s-4800型扫描电子显微镜对晶型进行sem分析，操作电压为15.0kv，电流10μa，工作距离10.3mm。样品在进行观察之前在真空下进行表面喷金处理，真空度10pa，喷金时间60s。高效液相色谱(hplc)谱图数据采自于高效液相色谱仪：agilent1260；色谱柱：c18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈∶水∶磷酸∶甲基叔丁基醚＝490∶460∶1∶50紫外检测波长：210nm；柱温：80℃；流速：1.5ml/min；进样量：20ul。本发明所用溶剂均可市售购得。实施例1环孢菌素a粗品的制备将5l环孢菌素a发酵液过滤得菌渣，65℃干燥4小时，所得干菌渣中加入2.5l乙醇溶液，搅拌4小时，过滤，滤渣中加入2l乙醇再次浸提，操作同第一次浸提。过滤，合并两次浸提液，60℃下减压浓缩，得浓缩物。向所得浓缩物中加入1n的naoh溶液至ph约为10，60℃水浴下搅拌2小时，加入500ml乙酸乙酯萃取，分离出有机相，有机相中加入10g活性炭脱色，搅拌1小时，过滤，滤液减压浓缩，残留物中加入60ml丙酮，搅拌均匀，加入0.5g环孢菌素a晶种，-10℃环境下放置结晶20小时，过滤，干燥，得环孢菌素a粗品，总收率81.3％，纯度为92.0％。该粗品晶体扫描图见图1，hplc谱图见图2。实施例2环孢菌素a粗品的制备取5l环孢菌素a发酵液，过滤得菌渣，65℃干燥4小时得干菌渣。将所得干菌渣加入到2.5l乙醇溶液中，搅拌4小时，过滤，滤渣中加入2l乙醇再次浸提，操作同第一次浸提。过滤，合并两次浸提液，60℃下减压浓缩，得浓缩物。向所得浓缩物中加入1n的koh溶液至ph约为9.5，置于60℃水浴中搅拌2小时，加入500ml乙酸乙酯萃取，分离出有机相，有机相中加入10g活性炭脱色，搅拌1小时，过滤，用100ml乙酸乙酯淋洗活性炭，滤液减压浓缩，残留物中加入60ml丙酮，搅拌均匀，加入0.5g环孢菌素a晶种，-10℃环境下放置结晶20小时，过滤，干燥，得环孢菌素a粗品，总收率80.1％，纯度90.8％。实施例3环孢菌素a粗品的制备取5l环孢菌素a发酵液，过滤得菌渣，65℃干燥4小时得干菌渣。干菌渣中加入2.5l乙醇，搅拌4小时，过滤，滤渣中加入2l乙醇再次浸提，操作同第一次浸提。过滤，合并两次浸提液，60℃下减压浓缩，得浓缩物。向所得浓缩物中加入1n的na2co3溶液至ph约为11.5，置于60℃水浴中搅拌2小时，加入500ml乙酸乙酯萃取，分离出有机相，有机相中加入10g活性炭脱色，搅拌1小时，过滤，用100ml乙酸乙酯淋洗活性炭，滤液减压浓缩，残留物中加入55ml丙酮，搅拌均匀，加入0.5g环孢菌素a晶种，-10℃环境下放置结晶20小时，过滤，干燥，得环孢菌素a粗品，总收率80.2％，纯度为91.3％。实施例4环孢菌素a粗品的制备将5l环孢菌素a发酵液过滤得菌渣，65℃干燥4小时，所得干菌渣中加入2.5l乙醇溶液，搅拌4小时，过滤，滤渣中加入2l乙醇再次搅拌浸提，过滤，合并两次浸提液，60℃下减压浓缩，得浓缩物。向所得浓缩物中加入0.5n的naoh溶液至ph约为10，65℃水浴下搅拌2小时，加入600ml乙酸乙酯萃取，分离出有机相，有机相中加入10g活性炭脱色，搅拌1小时，过滤，滤液减压浓缩，残留物中加入70ml丙酮，搅拌均匀，加入0.5g环孢菌素a晶种，-10℃环境下放置结晶20小时，过滤，干燥，得环孢菌素a粗品，总收率83.3％，纯度91.1％。实施例5将200l环孢菌素a发酵液过滤得菌渣，65℃干燥4小时，所得干菌渣中加入100l乙醇溶液，搅拌4小时，过滤，滤渣中加入80l乙醇再次搅拌浸提，过滤，合并两次浸提液，60℃下减压浓缩至无冷凝液滴出，得浓缩物。向所得浓缩物中加入1n的naoh溶液至ph约为10，65℃水浴下搅拌2小时，加入20l乙酸乙酯萃取，分离出有机相，有机相中加入400g活性炭脱色，搅拌1小时，过滤，滤液减压浓缩，残留物中加入2.9l丙酮，搅拌均匀，加入20g环孢菌素a晶种，-10℃环境下放置结晶20小时，过滤，干燥，得环孢菌素a粗品，总收率81.2％，纯度91.5％。对比实施例取5l环孢菌素a发酵液，除不加碱液处理外，其他操作同实施例1，发现结晶条件下放置结晶20小时后无晶体生成，减压浓缩去除丙酮得残留物粗品。将所得残留物粗品和实施例1所得粗品按下述步骤经硅胶柱层析纯化：装层析填料160g，上样，用乙酸乙酯/石油醚混合溶剂洗脱，收集环孢菌素a组分大于98.5％的层析流份。减压浓缩得产品。纯化结果见表1。其中，上柱容量为每克层析填料对应的环孢菌素a的上样量。表1参数实施例1所得粗品对比实施例所得残留物粗品粗品是否结晶是否上样容量(mg/g)7425上样量(g)11.844.0所得产品质量(g)9.722.45收率(％)82.1％61.3％对比实验表明，实施例1浸提后的浓缩物中加碱液处理可以除去大量杂质，萃取脱色后可经结晶获得粗品，而本实施例中常规不加碱液处理的浓缩物经过同样的纯化工艺后，无法结晶。进一步经柱层析纯化时，实施例1所得粗品的上柱容量远远大于本实施例所得残留物粗品的上柱容量，收集含相同范围的环孢菌素a组分的流份，层析收率也大幅提高。实施例6环孢菌素a精品的制备将实施例1粗品经硅胶柱层析纯化收集的环孢菌素a组分大于98.5％的流份减压浓缩，加入丙酮溶解至40mg/ml，置于-15℃结晶20小时。过滤，80℃减压干燥7小时，得到环孢菌素a精品，收率91.3％，纯度99.5％。需要指出的是，上述几个较佳实施例是对本发明技术方案作的进一步非限制的详细说明，仅为说明本发明的技术构思和特点。其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12