本发明涉及一类可被氨肽酶n激活的药物前体化合物。
背景技术
化疗，使用药物来抑制肿瘤生长，是癌症的主要治疗方式。然而，由于生物利用度差和非特异性的肿瘤累积，常规化疗不能规避低治疗效率和毒副作用。因此，提高化疗药物对肿瘤的选择性并改善抗癌药物的治疗效果是癌症化疗的关键挑战。开发可以被独特的肿瘤微环境激活的前药被认为是解决上述问题具有前景的策略。
目前报道的前药大多通过细胞内硫醇，活性氧(ros)，ph变化等激活。其中，酶活性前药对于特定化疗表现出更强的潜力，因为癌症特异性酶是最重要的癌症生物标志物，它们可增强前药对肿瘤选择性疗效。直到最近，一些酶激活的前体药物已经用于体外癌症诊断，除了特定的酶促反应外，体内研究还需要前药具有近红外(nir)“off-on”发射特征，可以在肿瘤部位有效富集，并可在肿瘤细胞中有效激活。然而，目前所报道的酶可激活前药均未在体内显示癌症诊断和特异性化疗。
几十年来，melphalan被临床应用于各种恶性肿瘤，包括黑色素瘤，它通过在dna主沟中引起链间交联来诱导细胞凋亡。但与化疗相关的缺点限制了其广泛使用，包括对癌细胞的相对较差的选择性，狭窄的治疗指数以及对正常细胞和器官的不可接受的损伤。因此，开发基于melphalan的酶激活诊疗前药，具有重要意义。另外，在各种癌症相关酶中，氨肽酶n(apn，ec3.4.11)是一种外肽酶，其优先并有效地水解多肽中的伯胺基团n-末端氨基酸，并且是癌症诊断中具有潜力的标志。尼罗蓝染料，具有nir激发和发射波长，大的摩尔吸光系数，和高的荧光量子产率，因而具有较强的生物成像应用前景。
技术实现要素：
基于在体内具有良好的癌症诊断和特异性化疗的酶可激活前药缺乏的现状，以及考虑到apn优异的肿瘤特异性和水解性能，本发明构建了一类apn敏感性的melphalan类似物前药。诊疗前药对癌症的高度选择性，能够在肿瘤细胞内有效激活。当被特异性激活，前药释放出游离药物melphalan，同时实现荧光“off-on”的变化过程，实现癌症诊断和药物激活的监测。
为此，本发明首先提供一类氨肽酶n激活的药物前体化合物，所述化合物具有如下结构通式ⅰ：
通式ⅰ中：
r1选自h或式i～iii所述基团；
r2是-n[(ch2ch2)mx]2，其中x选自卤素、羟基、巯基和硝基；m为1-4的整数；
r3为o或n；
r4选自卤素、羟基、巯基、氰基和硝基；
r5是在6元环上任意取代的h、c1-6烷基、c1-6烷基任意取代的苯基、c1-6烷基任意取代的萘基、卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、杂环基、卤代烷基、烷基氨基、酰氨基、or8、n(r8)2、(ch2ch2o)nh、(ch2)mcoom和(ch2)mso3m；
r6为o，s，se或te；
r7和r8各自独立的选自c1-8烷基、c1-6烷基磺酸基和c1-6烷基羧酸基。
另一方面，本发明提供上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)通式ⅱ的化合物与通式ⅲ的化合物按摩尔比1:1～2反应，制备通式ⅳ的化合物：
反应时间为12～24h，反应温度为20～40℃，反应溶剂为dmf、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物；催化剂选自1-羟基苯并三唑(hobt)，2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edcl)，4-二甲氨基吡啶(dmap)、n,n'-二异丙基乙胺(dipea)、三乙胺(tea)，吡啶和苯胺；
(2)具有通式iv的化合物脱乙脂制备通式v的化合物，反应时间为1～4h，反应温度为50～100℃，反应为1～5nnaoh，etoh、meoh或其混合体系。
(3)通式iv的化合物与具有结构通式v的化合物按摩尔比1:1～2反应制备具有结构通式i的化合物：
反应时间为12～24h，反应温度为20～40℃，反应溶剂为dmf、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物，催化剂选自hobt，hatu、hbtu、edcl，dmap、dipea、tea，吡啶和苯胺。
该发明巧妙地融合了肿瘤荧光诊断与靶向化疗。apn是一种在癌细胞中过表达的特异性蛋白水解酶，前药的激活是通过apn引起的酶促反应实现的。该发明中，基于尼罗蓝的诊疗前药，对apn显示出高度的敏感性和选择性。该类前药未被激活之前，通过pet效应，melphalan能淬灭前药的荧光，当前药由于apn的水解作用释放出melphalan，前药分子的荧光得以恢复，从而达到癌症诊断和前药激活的监测。该应用基于荧光分析来区分具有不同apn活性的细胞，这为癌症的诊断提供了有希望的平台。再一方面，本发明提供所述一类基于尼罗蓝母体诊疗前药在apn相关恶性肿瘤治疗中的应用。根据提出的机制，在apn阴性细胞中，前药释放游离melphalan的过程被阻滞，细胞毒性得以减弱。在apn阳性细胞中，细胞对诊疗前药的摄取增强，并能得到有效地激活，从而呈现出更高的细胞毒性。此外，基于尼罗蓝诊疗前药的荧光诊断在携带黑素瘤肿瘤的小鼠模型中得到证实。通过静脉注射后，该诊疗前药有效地在高apn活性或浓度的肿瘤部位积聚。与melphalan相比，诊疗前药表现出优良的肿瘤抑制效果。此外，小鼠的体重在治疗过程中保持稳定，表明该类前药对动物没有明显的全身毒性。因此，该类诊疗前药有希望用于apn高活性肿瘤的化疗，同时对活体动物具有优异的生物安全性。
基于此，本发明进一步提供所述的氨肽酶n激活的药物前体化合物在制备肿瘤诊断治疗制剂中的应用。具体地描述，所述的肿瘤为apn相关肿瘤。更为具体地，所述的肿瘤诊断治疗制剂是生物样品识别标记制剂或肿瘤诊断治疗药物。
综上描述，本发明所述的氨肽酶n激活的药物前体化合物荧光激发和发射波长大于630nm，具有优异的近红外荧光染料特性；化合物中专一性靶向基团的引入，保证其在体外对酶apn具有灵敏和选择性响应，并能够特异性识别癌症细胞及组织中过量表达的酶apn，具有良好的特异性，可以对癌症细胞进行识别和筛选；相对于游离melphalan能对apn过表达细胞产生选择性和更高的毒性。进一步经过实验证明，本发明所述的氨肽酶n激活的药物前体化合物经尾静脉注射，能对小鼠肿瘤进行成像，达到恶性肿瘤诊断的目的；并且能对小鼠肿瘤模型进行治疗，相对于游离melphalan具有更好的治疗效率和更低的全身毒性。鉴于此，本发明所述的一类基于尼罗蓝母体诊疗前药可用于不同apn浓度和活性细胞的识别，并可用于动物活体成像和apn相关恶性肿瘤的治疗。并且，本发明所述的化合物原料易得，制备简单，易产业化。
附图说明
图1是化合物nbfmel在不同溶剂中的紫外吸收光谱图。
图2是化合物nbfmel在不同溶剂中的荧光发射光谱。
图3是化合物nbfmel对apn的荧光响应性图。
图4是化合物nbfmel对apn的选择性响应图，图中：1、对照；2、rna；3、dna；4、丙氨酸；5、谷氨酸；6、天冬氨酸；7、丝氨酸；8、结氨酸；9、组氨酸；10、精氨酸；11、谷胱甘肽；12、人血清蛋白；13、球蛋白g；14、血红蛋白；15、胰凝乳蛋白酶；16、组蛋白；17、谷氨酰转肽酶；18、apn。
图5是化合物nbfmel对不同apn活性细胞荧光响应图，图中：
(a)～(f)、(g)～(l)和(m)～(r)分别为c8161，ht1080，c8161+乌苯美司，ht1080+乌苯美司，mb-mda-231，hct116细胞的荧光通道图、明场通道图和叠加通道图。
图6是化合物nbfmel对b16/bl6细胞系细胞毒性实验结果。
图7是化合物nbfmel对mda-mb-231细胞系细胞毒性实验结果。
图8是化合物nbfmel对小鼠b16/bl6肿瘤模型进行成像(a)，以及化合物nbfmel在体内的组织分布(b)。
图9是对b16/bl6肿瘤小鼠中静脉注射nbfmel，mel，pbs后肿瘤体积随时间变化图。
图10是对b16/bl6肿瘤小鼠中静脉注射nbfmel，mel，pbs后小鼠的体重随时间变化图。
图11是对b16/bl6肿瘤小鼠中静脉注射nbfmel，mel，pbs后小鼠的存活率随时间变化图。
具体实施方式
本发明首先提供一类氨肽酶n激活的药物前体化合物，所述化合物具有如下结构通式ⅰ：
通式ⅰ中：
r1选自h或式i～iii所述基团；优选为h。
r2是-n[(ch2ch2)mx]2，其中x选自卤素、羟基、巯基和硝基，优选卤素，尤其优选cl；m为1-4的整数，优选1、2或3；在本发明中式i的表述中，r2取代可以为所标记苯环上的任意位置，优选对位取代。
r3为o或n；优选r3为n。
r4选自卤素、羟基、巯基、氰基和硝基；优选r4为卤素，尤其优选f。
r5是在相应6元环上任意取代的h、c1-6烷基、c1-6烷基任意取代的苯基、c1-6烷基任意取代的萘基、卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、杂环基、卤代烷基、烷基氨基、酰氨基、or8、n(r8)2、(ch2ch2o)nh、(ch2)mcoom和(ch2)mso3m；所述任意取代，表示不限定取代基的个数及取代位置，优选的是单取代；最为优选的r5是h。
r6为o，s，se或te；优选为o。
r7和r8各自独立的选自c1-8烷基、c1-6烷基磺酸基和c1-6烷基羧酸基，优选c1-4烷基，尤其优选甲基或乙基。
上述各技术特征的优选可以组合，以构成本发明的优选技术方案。作为最优的技术实施方案，本发明所述的化合物为：
本发明另一方面提供了所述氨肽酶n激活的药物前体化合物的制备方法，具体实施方式中，所述方法包括下述步骤：
(1)通式ⅱ的化合物与通式ⅲ的化合物按摩尔比为1:1.2、于25℃反应12h，制备式iv的化合物，反应溶剂为二氯甲烷，催化剂为hobt，edcl或dmap；
(2)通式iv的化合物脱乙脂制备具有通式v的化合物，反应时间为1h，反应温度为80℃，反应为1nnaoh、etoh体系。
(3)通式iv的化合物与通式v的化合物按摩尔比1:1反应制备具有通式1的化合物；反应时间为12～24h，反应温度为25℃。
本发明所述的制备方法中溶剂均优选除水溶剂。
本发明上述的制备方法中提纯方法采用常规方法，没有特别限制，优选二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂色谱柱分离、重结晶或两者结合。并且所得染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，已达到需要纯度；
本发明上述的制备方法中所使用的原料均可市售或本领域内公知的方法制备得到。
本发明上述的制备方法中合成的化合物均采用高分辨质谱，核磁共振氢谱和核磁共振碳谱来确认结构。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“c1-6烷基”包括c1-4烷基、c1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
实施例1
诊疗前药化合物nbfmel的合成，按照下述合成路线：
(1)中间体3的合成
将化合物2(12mmol)、hobt(12mmol)、edcl(12mmol)，溶解在10ml二氯甲烷中，搅拌30min，将化合物1(10mmol)，dmap(12mmol)的溶解在10ml二氯甲烷中，缓慢加入上述体系。反应过程中，控制反应温度在25℃，反应体系充氮气保护、加快速磁力搅拌，反应持续时间12h。反应完成后，以石油醚：乙酸乙酯＝20：1为洗脱剂，用200-300目硅胶柱分离得到白色固体中间体3(71.3％)。
(2)中间体4的合成
将中间体3(6mmol)溶解溶于乙醇(30ml)中并加入1nnaoh(8ml)。混合物在80℃搅拌1小时。然后，暂停加热并使用1nhcl中和，旋转蒸发除掉溶剂后，得到粗产物后，以二氯甲烷：甲醇＝50：1为洗脱剂，用200-300目硅胶柱分离得到白色固体中间体4(89.6％)。
(3)化合物nbfmel的合成
将中间体5(6mmol)、edcl(6mmol)、hobt(6mmol)用溶解在15ml二氯甲烷，搅拌30min；然后将中间体4(5mmol)、dmap(6mmol)溶解在5ml二氯甲烷中，慢慢加入上述体系中，控制反应温度在25℃，反应体系充氮气保护、加快速磁力搅拌，反应持续时间12h。反应完成后，以二氯甲烷：甲醇＝15：1为洗脱剂，用200-300目硅胶柱分离得到蓝色固体化合物nbfmel(40.60％)。
1hnmr(500mhz,meod)δ8.92(d,j＝8.1hz,1h),8.37(d,j＝8.1hz,1h),7.93(t,j＝7.6hz,1h),7.88(d,j＝9.4hz,1h),7.83(t,j＝7.4hz,1h),7.29(dd,j＝9.4,2.4hz,1h),7.16(dd,j＝8.1,5.5hz,2h),6.95(dt,j＝13.2,4.1hz,5h),6.91(d,j＝2.4hz,1h),6.53(d,j＝8.2hz,2h),3.76–3.66(m,7h),3.62(d,j＝5.4hz,4h),3.60–3.54(m,5h),3.13(t,j＝6.4hz,2h),2.96(dd,j＝13.7,7.0hz,1h),2.91–2.80(m,2h),2.03(s,1h),1.90–1.81(m,2h),1.53–1.41(m,4h),1.34(t,j＝7.0hz,11h),1.28(s,4h).13cnmr(126mhz,meod)δ＝169.16,164.71,162.77,159.43,155.68,153.33,149.77,140.02,135.10,134.17,133.04,132.57,131.90,131.62,131.00,125.61,124.85,124.18,116.73,116.50,108.30,97.08,94.56,55.86,47.08,45.71,40.40,40.30,37.97,35.43,30.84,30.04,29.62,28.12,27.70,27.60,13.01.19fnmr(377mhz,cd3od)δ＝-118.65.tofms:m/zcalcdforc48h57cl2fn7o3+:868.3878,found:868.3914.
实施例2
化合物nbfmel的光物理性质测试
将实施例1中所制备的化合物nbfmel分别加入到氯仿，1,4-二氧六环，dmso，甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，四氢呋喃，pbs，丙酮中，制备为5μm的溶液，然后分别进行紫外吸收光谱和荧光发射光谱的测试。测试所使用的仪器分别是agiilent8453紫外分光光度计和agiilentcaryecliipse荧光分光光度计。所测得的紫外吸收光谱如图1，荧光发射光谱如图2。从图1与图2可以看出：化合物nbfmel最大吸收和发射波长大于630nm处于红外区，具有良好的光物理性能，适用于生物成像应用。
实施例3
化合物nbfmel在体外对apn的响应性
使用实施例1中制备的化合物nbfmel加入到apn浓度分别为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50ng/ml的体系中，平衡1小时后，以635nm为激发波长，用酶标仪(varioskanlux,thermo,usa)扫描测试体系的荧光光谱(图3)。图3表明，随着apn浓度的增加，荧光强度逐渐增强，说明参测化合物对apn具有良好的响应性。
实施例4
化合物nbfmel在体外对apn的选择性
使用实施例1中制备的化合物nbfmel加入存在不同底物(rna，dna，丙氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，丝氨酸，缬氨酸，组氨酸，精氨酸，谷胱甘肽，人血清蛋白，球蛋白g，血红蛋白，胰凝乳蛋白酶，组蛋白，谷氨酰转肽酶，apn)的体系中时，平衡1小时后，以635nm为激发波长，用酶标仪(varioskan-lux,thermo,usa)测试在680处的荧光强度(图4)。图4表明，化合物nbfmel对apn具有良好的选择性，而其它底物没有明显的干扰。
实施例5
化合物nbfmel对不同apn活性细胞的选择性成像
使用实施例1中制备的化合物nbfmel对癌症细胞与非癌症细胞识别的激光共聚焦成像图(图5)。化合物nbfmel(2.5μm)分别对已经孵育好的c8161细胞，ht1080细胞，mb-mda-231细胞，hct116细胞(细胞培养密度105cells/ml，皿底70-80％覆盖)培养皿中，37℃，5％co2条件下孵育染色5min，然后使用pbs震荡漂洗1min×3，再加入无血清培养基。选择代表性区域使用olympusfv1000-ix81激光共聚焦显微镜成像，激发波长635nm，接收波段655-755nm，重复实验3次。(a)～(f)、(g)～(l)和(m)～(r)分别为c8161，ht1080，c8161+乌苯美司，ht1080+乌苯美司，mb-mda-231，hct116细胞的荧光通道图、明场通道图和叠加通道图。通过对(a)、(b)、(e)、(f)的荧光强度对比发现，apn过表达细胞c8161，ht1080细胞的有强的荧光信号，而对apn低表达细胞mb-mda-231，hct116只有微弱的荧光信号，表明化合物nbfmel可以对癌症细胞和非癌症细胞区分。(c)、(d)分别为c8161，ht1080细胞酶活性抑制后的实验组，激光共聚焦显微镜成像并没有观察到明显荧光，表明化合物nbfmel的荧光变化依赖于apn的含量和活性。
实施例6
使用实施例1中制备的化合物nbfmel进行细胞毒性实验结果
选取apn过表达细胞b16/bl6，和apn过表达细胞mb-mda-231为研究对象，以mtt为实验方法，实验时间为24h，测定570nm、630nm处的吸光值，计算细胞存活率，并以细胞的存活率来表征化合物nbfmel对细胞毒性的大小。结果如图6和图7所示，表明，与mb-mda-231相比化合物nbfmel对b16/bl6具有相对更高的毒性。在apn过表达细胞中，相对于mel，nbfmel具有更高的毒性。当apn活性被抑制后，nbfmel的细胞毒性得到抑制。实验结果表明，nbfmel可以选择性地杀死apn过表达细胞。
实施例7
使用实施例1中制备的化合物nbfmel对小鼠b16/bl6肿瘤模型进行成像
将化合物nbfmel通过尾静脉注射进去体内，观察肿瘤部位荧光强度随时间的变。(a)～i为肿瘤apn活性未抑制组，(a)～ii为肿瘤apn活性抑制组。激发波长665nm，接收波段700±10nm。实验结果如图8所示，表明化合物nbfmel对活体内对肿瘤进行良好的成像效果。(b)为化合物nbfmel在体内的组织分布。实验结果表明，化合物nbfmel具有良好的肿瘤的富集效率。
实施例8
使用实施例1中制备的化合物nbfmel对小鼠b16/bl6肿瘤模型的治疗效果
结果如图9～11所示，图9是在b16/bl6肿瘤小鼠中静脉注射nbfmel，mel，pbs后肿瘤体积的变化。图10是用nbfmel，mel，pbs处理后的b16/bl6肿瘤小鼠的体重变化。图11是分别用nbfmel，mel，pbs处理组的存活率曲线。实验结果表明，nbfmel对肿瘤具有明显的抑制作用，而且，相对于mel，具有更高的治疗效率和更低的毒副作用。