本发明属于抗肿瘤肽领域，特别涉及一种线性假多肽及其制备方法以及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)是由机体特定基因编码且在外界诱导下产生的，大量存在于动物、植物及微生物中，是自然界生物体内极其重要的防御体系。它们是一类具有生物学活性的小分子多肽，一般由10～100个氨基酸残基组成。抗菌肽大多具有两亲性并且带有一定量的正电荷(通常为+2～+9)，属于阳离子多肽(theis,t.,stahl,u.cellularandmolecularlifesciences:cmls2004,61,437-455)。世界上第一个被发现的抗菌肽是天蚕素(cecropins)，是boman等在1980年从诱导的惜古比天蚕蛹淋巴液中分离出的，随后人们从各种动植物以及微生物中发现并分离了多种具有抗菌活性的多肽，他们普遍具有抗菌谱广、抗菌效率高等特点，因此这类多肽物质被命名为“antimicrobialpeptides”，中文名为“抗菌肽”。许多抗菌肽已被证明具有显著的靶向抗癌的能力，这类小分子多肽化合物可有效进行组织渗透并选择性地对肿瘤细胞进行杀灭，而对正常细胞则不产毒副作用，因此抗菌肽在抗肿瘤方面具有极大的开发潜力，为癌症的治疗提供了新的方向与机遇。研究表明，抗菌肽能选择性作用于癌细胞，主要原因在于正常细胞与癌细胞细胞膜之间的差异。癌细胞膜表面通常有许多带负电荷的分子，如氧糖基化的黏蛋白、硫酸乙酰肝素、磷脂酰丝氨酸等，而正常哺乳动物细胞的细胞膜主要成分是磷脂和甾醇这一类中性分子，因而带正电荷的抗菌肽可以与带负电荷的肿瘤细胞通过静电作用结合，从而达到选择性作用于肿瘤细胞的效果。另外，有研究发现，胆固醇含量的增加会延长cecropins作用细胞膜并产生离子通道的过程，而真核细胞的细胞膜正好含有丰富的胆固醇，因此可以起到有效保护细胞膜的作用。此外，癌细胞表面有比正常细胞数量更多的微绒毛，这极大地增加了抗菌肽与肿瘤细胞之间相互作用的表面积，也就增加了两者之间相互作用的机会。loloatins抗菌肽家族包含4个成员，即loloatina、b、c和d，它们是在实验室条件下由采集于巴布亚新几内亚南部海滩沿岸大堡礁上的海洋微生物的发酵液中分离出来的一类环十肽抗菌素。研究发现，该家族中的loloatinc[结构式为cyclo-(-l-val-l-orn-l-leu-d-tyr-l-pro-l-trp-d-phe-l-asn-l-asp-l-trp)]不仅对革兰氏阳性菌(g+)表现出和tyrocidinec一致甚至更好的抗菌活性，还对革兰氏阴性菌(g-)escherichiacoli表现出明显的抗菌活性(gerard,j.m.,etal.j.nat.prod.1999,62,80-85)。chen随后的研究发现loloatinc的药核结构为-d-tyr-pro-trp-d-phe-，即该四肽序列结构对loloatinc抑菌活性的发挥起着关键的作用(chenh.preparationandevaluationoftheloloatinsandtheiranalogues.annarbor,mich:umi,2003)。研究结果表明，抗菌肽是通过破坏细菌细胞膜的完整性从而使得膜的穿透性增加而杀死细菌(ghadiri,m.r.etal.,nature,2001,412:452-455；zasloff,m.,nature,2002,415:389-395)。因此，利用计算机辅助药物设计技术，以loloatinc的药核结构作为模板，设计具有更多正电性和α-螺旋结构的多肽，将是寻找具有更好抗肿瘤作用多肽的有效途径。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种线性假多肽。本发明的另一目的在于提供所述线性假多肽的制备方法。本发明还又一目的在于提供所述线性假多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种线性假多肽，所述线性假多肽包含loloatinc的药核序列结构-a1-a2-a3-a4-的生物等电体结构；所述的a1为l-phe(4-nh2)，d-phe(4-nh2)，l-tyr，d-tyr，l-tyr(3-cl)和d-tyr(3-cl)中的一种；其中，l-phe(4-nh2)、d-phe(4-nh2)表示l-phe或d-phe的侧链苯环上的4位被-nh2取代；同理，l-tyr(3-cl)、d-tyr(3-cl)表示l-tyr或d-tyr的侧链苯环上的3位被cl取代(4位是-oh)；所述的a2为l-pro或d-pro；所述的a3为l-ala(4-py)，d-ala(4-py)，l-ala(2-py)，d-ala(2-py)，l-trp和d-trp中的一种；其中，py表示吡啶基(pyridyl)，l-ala(4-py)，d-ala(4-py)表示丙氨酸(l-ala或d-ala)侧链甲基上连接一个吡啶基，连接的位置是在吡啶的4位(吡啶中以n为第1位)；同理，l-ala(2-py)，d-ala(2-py)表示丙氨酸(l-ala或d-ala)侧链甲基上连接一个吡啶基，连接的位置是在吡啶的2位；所述的a4为l-phe，d-phe，l-phg，d-phg，l-phe(4-f)和d-phe(4-f)中的一种；其中，l-phe(4-f)、d-phe(4-f)表示l-phe或d-phe的侧链苯环上的4位被f取代。所述的假多肽分别在n-端和c-端进一步延伸，结构式为h-a1′-a1-a2-a3-a4-a4′-oh；所述的a1′为l-asn或l-asp；所述的a4′为l-asn或l-asp。所述的线性假多肽优选为选自如下任一序列：(1)h-asp-d-tyr-pro-ala(4-py)-d-phg-asn-oh；(2)h-asp-d-tyr(3-cl)-pro-trp-d-phg-asn-oh；(3)h-asp-d-tyr(3-cl)-pro-ala(4-py)-d-phg-asn-oh；(4)h-asn-d-phe(4-nh2)-pro-trp-d-phe-asn-oh；(5)h-asn-d-phe(4-nh2)-pro-ala(2-py)-d-phg-asp-oh；(6)h-asp-d-tyr(3-cl)-pro-trp-d-phe-asn-oh；(7)h-asp-d-tyr(3-cl)-pro-ala(4-py)-d-phe(4-f)-asn-oh。所述的线性假多肽的制备方法为采用固相多肽合成法，可以采用手工操作制备，也可以采用多肽合成仪制备，比如利用美国应用系统生物公司生产的pioneer多肽合成仪制备；所述线性假多肽的合成为氨基酸的装配从c端到n端逐个进行，由人工控制或自动合成仪设定控制，具体合成步骤为：首先称取0.1mmol结合了第一个氨基酸asp-otbu侧链羧基的rinkamide树脂，装柱，用20％体积比的二氯甲烷(dcm)二甲基甲酰胺(dmf)溶液溶胀30min，然后用30％体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(fmoc)，dmf清洗3次。将9-芴甲氧羰基(fmoc)保护的氨基酸溶于三吡咯基膦氧苯骈三唑六氟合磷盐(pybop)，羟基苯骈三唑(hobt)和二异丙基乙基胺(dipea)，溶解后的溶液上柱循环偶合反应30～60min，dmf清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤直到制备结束；制备完成后，抗菌肽经如下步骤从树脂上剪切：取下反应后的树脂肽，加入切肽试剂(一般为95％(v/v)三氟醋酸，2.5％(v/v)二氯甲烷，2.5％(v/v)三乙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得线性假多肽。所述的线性假多肽的制备方法还包括将上述获得的线性假多肽进行纯化的步骤：采用反相高效液相法(rp-hplc)进行纯化，洗脱液为甲醇-0.1％(v/v)三氟醋酸水溶液，收集洗脱峰，冷冻干燥，得到纯化后的线性假多肽。所述的线性假多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤为恶性肿瘤，包括肝癌、结肠癌和乳腺癌等。所述的线性假多肽的浓度为0.69mg/ml～2.76mg/ml。一种抗肿瘤药物，包括上述线性假多肽。所述的抗肿瘤药物还可以含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体。所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。所述的抗肿瘤药物可以进一步制成注射剂、片剂、粒剂或胶囊等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明根据loloatinc药核结构的生物等电体，设计合成具有抗肿瘤作用的多肽，利用mmt法检测了系列线性假多肽对hepg2、mcf-7、caco-2癌细胞的增殖抑制活性。结果表明，本发明所设计合成的线性假多肽均有对三种肿瘤细胞的增殖抑制活性，其中，以hr-tl1-06对乳腺癌mcf-7细胞的增殖抑制作用最好，其ic50值为1.381±0.226mg/ml。此外，本发明还检测了hr-tl1-06对乳腺癌mcf-7细胞生长周期以及细胞凋亡的调控作用，实验表明，hr-tl1-06能够将mcf-7细胞阻滞在g0/g1期，并且促进其凋亡。(2)本发明线性假多肽用于制备抗肿瘤药物，特别是治疗肝癌、直肠癌、乳腺癌的药物，具有广谱、不易产生耐药性的优点。(3)本发明线性假多肽的制备方法反应条件温和、容易实现自动化、操作简便安全、产品纯度高、总收率高。附图说明图1为线性假多肽hr-tl1-06的质谱图。图2为线性假多肽hr-tl1-06的二级质谱图。图3为线性假多肽hr-tl1-06对mcf-7细胞周期的影响图；其中，a图为流式细胞仪直方图；b为依据直方图a的定量计算结果。图4为线性假多肽hr-tl1-06对mcf-7细胞凋亡的影响图；其中，a图为流式细胞仪四象散点图；b为依据四象散点图a的定量计算结果。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明线性假多肽是在对来自海洋微生物代谢物loloatinc抗菌药核序列结构研究的基础上，以计算机辅助药物设计技术为工具设计，由固相多肽合成法合成的。其中，-a1-a2-a3-a4-为线性假多肽的核心结构，也即是loloatinc药核结构的生物等电体，四个氨基酸残基为l-构型或d-构型；a1为l-phe(4-nh2)或d-phe(4-nh2)或l-tyr或d-tyr或l-tyr(3-cl)或d-tyr(3-cl)；其中，括号内“4-nh2”表示l-phe或d-phe的侧链苯环上的4位被氨基取代；同理，“3-cl”表示l-tyr或d-tyr的侧链苯环上的3位被氯原子取代(4位是羟基)；a2为l-pro或d-pro；a3为l-ala(4-py)或d-ala(4-py)或l-ala(2-py)或d-ala(2-py)或l-trp或d-trp；其中，括号内“4-py”表示l-ala或d-ala的侧链甲基上连接一个吡啶基(pyridyl)，连接的位置是在吡啶的4位(吡啶中以n为第1位)；同理，“2-py”表示l-ala或d-ala的侧链甲基上连接一个吡啶基，连接的位置是在吡啶的2位(吡啶中以n为第1位)；a4为l-phe或d-phe或l-phg(l-苯甘氨酸)或d-phg或l-phe(4-f)或d-phe(4-f)；其中，括号内“4-f”表示l-phe或d-phe的侧链苯环上的4位被氟原子取代。本发明中的线性假多肽可以分别在n-端和c-端进一步延伸，结构式为h-a1′-a1-a2-a3-a4-a4′-oh。其中，所述a1′为l-asn和l-asp中的一种；所述a4′为l-asn和l-asp中的一种。本发明中的线性假多肽的制备方法采用固相多肽合成法，可以采用手工操作制备，也可以采用多肽合成仪制备，比如利用美国应用系统生物公司生产的pioneer多肽合成仪制备。线性假多肽的序列结构及产率见表1。表1线性假多肽的序列结构及总收率*注：py代表pyridyl，即吡啶基。实施例1线性假多肽的制备及分离纯化1、线性假多肽hr-tl1-01的氨基酸序列见表1。(1)本实施例采用固相多肽合成法。具体步骤如下：氨基酸的装配从c端到n端逐个进行，由人工控制。首先称取0.1mmol结合了第一个氨基酸asp-otbu侧链羧基的rinkamide树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)，装柱，用20％体积比的二氯甲烷(dcm)二甲基甲酰胺(dmf)溶液溶胀30min，然后用30％体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(fmoc)，dmf清洗3次。将9-芴甲氧羰基(fmoc)保护的氨基酸即fmoc-d-phg-oh、三吡咯基膦氧苯骈三氮唑六氟合磷(pybop)，羟基苯骈三唑(hobt)和二异丙基乙基胺(dipea)溶解于dmf，溶液上柱循环偶合反应30～60分钟，dmf清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤，依次偶合ala(4-py)，pro，d-tyr和asp，制备结束。(2)制备完成后，线性假多肽hr-tl1-01经如下步骤从树脂上剪切：取下反应后的树脂肽，加入切肽试剂(其成分为95％(v/v)三氟醋酸，2.5％(v/v)二氯甲烷，2.5％(v/v)三乙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得线性假多肽chr-l1-01粗品。(3)线性假多肽hr-tl1-01粗品的纯化采用反相高效液相法(rp-hplc)，洗脱液为甲醇-0.1％(v/v)三氟醋酸水溶液，采用梯度洗脱，收集各洗脱峰馏分，室温下旋转蒸发除去甲醇，水溶液经冷冻干燥，得28.0mg假多肽hr-tl1-01纯品，总收率为26.1％。产品经质谱分析鉴定：线性假多肽hr-tl1-01的理论分子量c38h44n8o11+h([m+h]+)为789.3208,实验值789.3206；esi-ms/ms：碎片峰m/z511.2303为{pro-ala[3-(4-pyridyl)]-d-phg-asn+h}+；碎片峰m/z674.2938为{d-tyr-pro-ala[3-(4-pyridyl)]-d-phg-asn+h}+；碎片峰m/z524.2155为[m-(d-phg-asn)+h]+；碎片峰m/z657.2687为[m-asn+h]+。2、参考上述线性假多肽hr-tl1-01的合成方法合成hr-tl1-02，hr-tl1-03，hr-tl1-04、hr-tl1-05、hr-tl1-06和hr-tl1-07(氨基酸序列见表1)。其中，线性假多肽hr-tl1-06的质谱图如图1所示，hr-tl1-06的二级质谱图如图2所示。上述合成过程中涉及到的l-phe(4-nh2)、d-phe(4-nh2)、l-tyr(3-cl)、d-tyr(3-cl)、l-ala(4-py)、d-ala(4-py)、l-ala(2-py)、d-ala(2-py)、l-phe(4-f)或d-phe(4-f)均为n端由fmoc保护的氨基酸，购自上海吉尔生化科技有限公司。实施例2线性假多肽的抗肿瘤细胞增殖抑制活性检测以下实施例中所使用的人乳腺癌细胞株mcf-7细胞，人克隆结肠腺癌细胞caco-2，人肝癌细胞hepg2购于中国科学院上海细胞所。采用mmt法检测待测线性假多肽对hepg2、mcf-7、caco-2细胞的增殖抑制活性。首先取对数生长期的hepg2、mcf-7、caco-2细胞接种于96孔板中，接种密度为1×104个/孔，培养过夜。当细胞融合度达到70％以上时加药处理，实验设置对照组(以dmxaa为对照)、空白组(以不添加任何药物为空白对照)以及不同浓度给药组。将所有线性假多肽肽化合物从10mg/ml开始依次进行梯度稀释，每组设3个复孔。孵育48h后，每个孔加入10μl的mtt溶液，放置在37℃，5％的co2培养箱中继续培养，注意加mtt溶液时避光操作。孵育4h后，将每个孔内的溶液吸弃，注意不要将结晶体吸走，最后每孔再加100μl的dmso(二甲基亚砜)溶液，避光放在摇床上震摇15min，然后用酶标仪检测570nm处的od值，计算细胞存活率，重复3次。检测结果列于表2。表2线性假多肽对不同肿瘤细胞的增殖抑制活性*注：dmxaa为5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸。表2中，ic50值越小，表示线性假多肽的抗肿瘤细胞增殖抑制作用的能力越强。实施例3hr-tl1-06对mcf-7细胞周期的影响本实施例用于检测hr-tl1-06对细胞周期的影响，使用的人乳腺癌细胞株mcf-7细胞购自中国科学院上海细胞所。具体的检测步骤为：取对数期的mcf-7细胞接种于六孔板中，密度为2.5×105个/ml。按实验要求分组，分别设置对照组(不添加药物)、低剂量组(0.69mg/ml)、中剂量组(1.38mg/ml)和高剂量组(2.76mg/ml)。加药后继续培养48h。随后，培养液于2000g离心5min，收集细胞，用冷的pbs缓冲液(35mm磷酸缓冲液/0.15mol/lnacl,ph7.0)洗细胞两次，加入1ml冷的70％(v/v)乙醇(-20℃)，立即混匀，过夜固定。再于2000g离心5min，沉淀细胞，弃上清。配制pi染液，配方如下(一个样品为例)：表3pi染液试剂体积pbs缓冲液0.50mlpi(碘化丙啶)染液(5mg/ml)25μl0.1％rnasea10μl终体积0.535ml每管加入表3中配置的pi染液0.5ml，重悬细胞，37℃避光温浴30min。用流式细胞仪检测dna含量(ex＝488nm，em＝620nm)。检测结果见图3。由图可见，hr-tl1-06能够将mcf-7细胞周期阻滞在g0/g1期。实施例4hr-tl1-06对mcf-7细胞凋亡的调控本实施例用于检测hr-tl1-06对mcf-7细胞凋亡的调控，使用的细胞购自中国科学院上海细胞所。具体的检测步骤是：取对数期的mcf-7细胞接种于6孔板，细胞密度为1×105个/ml。按实验要求分组，分别设置对照组(不添加药物)、低剂量组(0.69mg/ml)、中剂量组(1.38mg/ml)和高剂量组(2.76mg/ml)。加药并培养48h，2000g离心5min，收集细胞。用4℃预冷的pbs缓冲液洗涤离心细胞2次，2000g离心5min。然后用500μlbindingbuffer(购自上海索宝生物科技有限公司)重悬细胞，加入5μlannexinv-fitc(annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒，购于上海前生生物科技有限公司)，混匀、避光静置5min。加入100μlpi(碘化丙啶)，混匀，避光静置5min。300目筛网过滤，用流式细胞仪检测annexinv-fitc及pi的荧光强度(ex＝488nm，em＝525nm；ex＝488nm，em＝620nm)。检测结果见图4。由图可见，hr-tl1-06能够调控mcf-7细胞凋亡，并呈剂量依赖性。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12