本发明涉及一种超声波辅助制备羧甲基茯苓多糖（cmp）的新方法，属于高分子多糖制备技术领域。
背景技术
由于天然存在的茯苓多糖水溶性差，临床应用上受到限制，可通过化学修饰，提高糖链的负电性，进而增加或赋予茯苓多糖的抗肿瘤、抗氧化等生物活性。羧甲基化是常用的多糖修饰方法，经过羧甲基化修饰后的茯苓多糖，其物理特性得到相应改善(取代度、溶解性、粘度、电负性等)，同时生物活性进一步提高。
超声波是一种振动频率在20khz-50khz的机械振动波，是通过所产生的空化效应、振动作用等对天然产物有效成分进行提取的一种可行手段。超声波在多糖提取技术领域的研究居多，申请号cn201610770884.8（马齿苋多糖的提取方法）中提到利用超声波技术提取马齿苋多糖，所得多糖得率提高。申请号cn201611101889.8（金花茶花多糖的超声波提取方法）中将金花茶溶液加入到超声波提取器中，显著提高了多糖得率和抗氧化活性。申请号cn201510822152.4（一种茯苓中多糖的提取工艺）中提到，利用超声波辅助提取茯苓多糖的方法，工艺步骤简单，耗时短，并具有推广应用的价值。超声波技术在多糖提取中的应用已经取得了诸多成效，然而在多糖的取代方面，却应用甚少。目前，在羧甲基茯苓多糖的制备整个过程中，从头至尾仍旧沿用传统的反应设备，反应效率低，羧甲基化程度低，如hamuro等人（1971）利用液固相震荡设备制备cmp，需要大量的有机溶剂作为反应介质，且生产成本高，反应效率低；如申请号cn200710053548.2（羧甲基茯苓多糖的工业化生产）中，在制备cmp过程中，采用搅拌方式进行连续化反应，工艺过程复杂，在反应前处理阶段需要95%的酒精浸提16h，耗时费力；随着超声波技术的广泛应用，也有研究利用超声波技术制备改性多糖，如申请号cn200810120231.0（一种取代茯苓多糖的合成方法）中，虽然引入了超声波辅助制备取代茯苓多糖，但是却并未有很好的效果，该方法存在有机溶剂和反应试剂用量高，羧甲基效率低等问题。
技术实现要素：
针对现有制备方法存在的缺陷，本发明旨在提供一种行之有效地制备方法，利用超声波技术辅助制备羧甲基茯苓多糖。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
将去皮切片干燥后过60～100目的茯苓粉分散于55%～85%的乙醇体系中，于超声波提取仪中溶胀；溶胀完成后，加入茯苓粉干重50%～90%的氢氧化钠，50℃～70℃水浴锅内反应0.5h～1.5h，然后依次加入茯苓粉干重70%～95%氯乙酸和50%～90%的氢氧化钠，50℃～70℃水浴锅内反应3h～7h，冷却至室温，用冰醋酸调节ph值至5～6，抽滤；用55%～85%乙醇溶液洗涤固体部分，直至硝酸银检测无白色沉淀；烘干，粉碎可得cmp。
作为本发明的进一步方案，所述超声波的超声功率为24w-120w。
作为本发明的进一步方案，所述超声波的超声时间为10min-40min。
作为本发明的进一步方案，所述超声波的超声温度为30℃-70℃。
作为本发明的进一步方案，所述茯苓粉与85%乙醇溶液（g:ml）为1:4-1:8。
作为本发明的进一步方案，所述碱化和醚化的反应方式为搅拌。
具有工艺流程如图1所示。
本发明所述的制备方法，有益之处在于：
本发明条件容易实现，相比酒精溶胀制备方式，采用本发明制备所得cmp取代度可以达到了0.80左右，溶解度可以达到0.84。
由图3红外光谱图看出，1180cm-1和1049cm-1处的c-o-c和c-o吸收峰强度增加，超声可以使多糖发生降解，更多的活性基团暴露，羧甲基取代更易发生，因而本发明所得cmp取代度和溶解度均增加；从图4和图5对比可以看出，超声波使多糖发生降解，但并未改变多糖结构，并且超声波对dpph·、abts+、羟基自由基的清除能力增强。
附图说明
图1为羧甲基茯苓多糖的工艺流程图；
图2为酒精溶胀所得茯苓多糖的红外图谱；
图3为超声提取所得茯苓多糖的红外图谱；
图4为两种提取方式所得茯苓多糖的紫外图谱；
图5为两种提取方式所得茯苓多糖的气相色谱；
图6为两种提取方式所得茯苓多糖的抗氧化活性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.超声波辅助制备羧甲基茯苓多糖
称取60目茯苓粉16.00g，加入80ml85%乙醇溶液，至于超声波提取仪中，60℃水浴超声分散30min，超声功率120w，分散结束后，加入5.44g的氢氧化钠，搅拌反应1h，反应温度50℃；依次加入15.12g氯乙酸和5.44g氢氧化钠，搅拌反应6h，反应温度60℃。冷却至室温，冰醋酸调节ph至5～6；抽滤后用80%乙醇溶液洗涤，直至硝酸银检测无白色沉淀；40℃烘干，磨碎，过筛即得成品，测定ds=0.78，溶解度=0.84。
2.酒精溶胀制备羧甲基茯苓多糖
称取60目茯苓粉16.00g，加入80ml85%乙醇溶液，60℃水浴搅拌分散30min，分散结束后，加入5.44g的氢氧化钠，搅拌反应1h，反应温度50℃；依次加入15.12g氯乙酸和5.44g氢氧化钠，搅拌反应6h，反应温度60℃。冷却至室温，冰醋酸调节ph至5～6；抽滤后用80%乙醇溶液洗涤，直至硝酸银检测无白色沉淀；40℃烘干，磨碎，过筛即得成品，测定ds=0.52，溶解度=0.72。
3.测定羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度（d·s）
d·s按照铜盐络合物滴定法测定，测定方法如下：称取样品0.625g，加入1ml无水乙醇，静置数分钟后，加入50ml蒸馏水，溶解，然后加入20mlnh4cl缓冲溶液，用hcl或naoh调节ph至6.0～7.0，准确加入50ml0.05mol/lcuso4定容至250ml，静置，4000r/min离心10min，取上清液50ml，用pan做指示剂，用edta标液平行滴定，至溶液有紫红色变为绿色即可，记录所用滴定液为v1，相同条件下做空白试验记为v0。根据公式计算代测样品取代度。
其中：b为ch3coo-含量；w为称样量，g；cedta为标定后edta的浓度，mol/l
4.溶解度测定
溶解度测定依照本实验室方法，即称取样品1.0g左右，加30ml蒸馏水溶解，10000r/min离心10min，取上清液冻干，称重，记为m1。
其中s为溶解度，m1为上清液冻干后重量，g；m0为称取样品的重量，g。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。