一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法与流程

本发明属于snp检测技术领域，特别涉及一种硫代修饰引物及应用该引物的snp检测方法。

背景技术：

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。snp在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

目前snp的常用检测方法是等位基因特异性pcr(alleleapecificpcr，as-pcr)，as-pcr是基于引物3`端碱基与dna模板匹配与否来区分snp位点。理论上，只要末位碱基不配对，那么引物无法有效延伸；但是末位单碱基错配往往不能达到预期的分辨效果。由于pcr反应中dna呈指数级增长，当与引物3`端碱基错配的dna模板在第一个循环有少量的扩增时，其复制出来的dna模板在后续的循环里与原引物的错配就不存在。随着指数级的dna扩增，错配产物的数量也相当可观。达到影响分辨率的程度。

授权公告号为cn103320514b的发明专利公开了一种检测临近snp的多重pcr方法，可以解决扩增抑制问题并提高扩增效率；但是该方法需要设计多对引物，工作量较大，操作较为繁琐。因此，提供一种新的snp检测方法，以提高灵敏性和准确性，防止错配延伸，成为本领域研究人员急需解决的技术问题。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种硫代修饰引物及应用该引物的snp检测方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明一方面提供了一种硫代修饰引物，所述引物的硫代修饰位点为3`端第一和第二个碱基之间的磷酸二酯键。

本发明另一方面提供了一种应用该引物的的snp检测方法，包括如下步骤：

s1：设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述特异性引物包括两条上游引物f1、f2和一条下游引物r，所述f1引物和所述f2引物3`端第一位碱基不同，其余序列均相同；

s2：分别对所述f1引物和所述f2引物进行硫代修饰；

s3：用所述引物对目的基因进行pcr扩增；

s4：对实验结果进行分析。

进一步地，所述pcr的反应体系中使用的dna聚合酶为pfu高保真dna聚合酶。

snp位点的识别，即单个碱基的识别。高保真dna聚合酶比普通taqdna聚合酶对错配碱基的识别能力更强。但是高保真dna聚合酶具有3`-5`核酸外切酶活性，在pcr的过程中会切掉不匹配的碱基；硫代修饰的作用是改变碱基间的连接方式，将碱基间磷酸二酯键中的氧原子换成硫原子，3`-5`核酸外切酶在pcr过程中不能识别该位点，从而不能将不匹配的碱基切除。由此可以提高snp检测的特异性和准确性。

进一步地，所述步骤s3中，分别采用f1引物和f2引物为上游引物、以r引物为下游引物进行实时荧光定量pcr。

进一步地，所述pcr的反应体系中包括如下组分：

模板dna0.2ng/μl、f1引物或f2引物0.5μm、r引物0.5μm、dntp0.2mm、pfu高保真dna聚合酶0.02u/μl以及1×的sybrgreen。

不同种类生物的不同基因片段大小不同，差距可达两个数量级，用量约在0.02～2ng/μl之间。本研究中应用的是人基因组片段，因此模板用量为0.2ng/μl。

进一步地，所述pcr的反应条件如下：

(1)预变性：98℃3min；

(2)扩增：98℃10s，58℃30s，共40个循环；

(3)扩增曲线：95℃15s；60℃15s；95℃15s。

分别以两种上游引物进行扩增，当特异性引物与模板完全匹配时，引物可以正常延伸，产生扩增曲线；当特异性引物与模板不能匹配时，引物不能延伸，不能产生扩增曲线。由此，可以对模板中的snp位点起到检测作用。

上述技术方案可以通过设计分子信标探针替代荧光染料，此时，所述步骤s3包括如下步骤：

s3.1：对目的基因通过as-pcr进行位点识别；

s3.2：分子信标扩增：利用两条分子信标探针对步骤s3.1中得到的扩增产物进行pcr扩增；

s3.3：信号产生：将反向引物结合到步骤s3.2中得到的扩增产物上，进行pcr扩增，使分子信标的荧光基团和淬灭基团分开，从而产生信号。

第一轮pcr用于识别等位基因，产生大量带有等位基因通用标签的pcr产物；第二轮pcr是以分子信标探针作为引物，结合到通用标签序列部分，进行pcr扩增；第三轮pcr通过反向引物扩增，将分子信标的发夹结构打开，使分子信标的荧光基团和淬灭基团分开，从而产生信号。

进一步地，所述f1引物的5`端连接有通用标签1，所述f2引物的5`端连接有通用标签2，所述通用标签1和所述通用标签2的碱基序列如下：

通用标签1：5`gaaggtgaccaagttcatgct3`；

通用标签2：5`gaaggtcggagtcaacggatt3`。

进一步地，两条所述分子信标探针的3`端引物序列分别与通用标签1和通用标签2的序列相同，5`端分别标记fam和hex作为荧光基团，中间均标记dabcyl作为淬灭基团。

进一步地，所述步骤s3中pcr反应体系中包括如下成分：

模板dna0.2ng/μl、f1引物0.5μm、f2引物0.5μm、r引物0.5μm、分子信标beacon-fam0.5μm、分子信标beacon-hex0.5um、dntp0.2mm以及taqdna聚合酶0.02u/μl；

所述pcr的反应条件如下：

(1)预变性：94℃5min；

(2)扩增：94℃20s，58℃30s，共36个循环。

将三轮pcr所需的试剂合在一个反应体系中，通过上述反应条件，即可通过一次pcr达到三轮pcr的效果。

本发明的有益效果如下：本发明提供了一种硫代修饰引物及应用该引物的snp检测方法，pcr过程中采用高保真dna聚合酶，提高了对特异性引物的识别能力，同时对引物进行硫代修饰，避免了高保真酶将不匹配的碱基切下来，提高检测方法的特异性；实时定量检测中，通过扩增曲线可以判定是否有非特异性扩增，利用△ct判定分型结果，可以避免终点定量因非特异性扩增造成假阳性的问题，具有较高的准确度和灵敏性；该方法还可以借助分子信标探针替代核酸染料，并将三步pcr扩增合为一步反应，以此达到同样的效果，可以提高该方法的可行性，为实验操作提供了多种选择。

附图说明

图1为实验例1中扩增曲线1的示意图；

图2为实验例1中扩增曲线2的示意图；

图3为实验例1中扩增曲线1与扩增曲线2的对比情况；

图4为实验例2中扩增结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种利用碱基错配扩增的snp检测方法，包括如下步骤：

s1：以人基因组snp位点rs642431为目的基因,设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述位点碱基序列如下：

所述引物的碱基序列如下：

f1：5`cggcacaccagtgtgtgtct*t3`；

r：5`attctgggaaccagggaagatgtgg3`；

其中f1引物经过硫代修饰，硫代修饰的位点为3`端倒数第一和倒数第二个碱基之间的磷酸二酯键；

s2：用所述引物对目的基因进行pcr扩增，具体反应体系如下；

模板dna10ng、f1引物0.5μm、r引物0.5μm、dntp0.2mm、pfu高保真dna聚合酶1u以及2.5μl的sybrgreen(20×)，补充ddh2o至终体积50μl；

反应条件如下：

(1)预变性：98℃3min；

(2)扩增：98℃10s，58℃30s，共40个循环；

(3)扩增曲线：95℃15s；60℃15s；95℃15s；

s3：对实验结果进行分析。

实施例2

一种利用碱基错配扩增的snp检测方法，包括如下步骤：

s1：以人基因组snp位点rs642431为目的基因(碱基序列同实施例1),设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述引物的碱基序列如下：

f2：5`cggcacaccagtgtgtgtct*g3`；

r：5`attctgggaaccagggaagatgtgg3`；

其中f2引物经过硫代修饰，硫代修饰的位点为3`端倒数第一和倒数第二个碱基之间的磷酸二酯键；

s2：用所述引物对目的基因进行pcr扩增，具体反应体系如下；

模板dna10ng、f2引物0.5μm、r引物0.5μm、dntp0.2mm、pfu高保真dna聚合酶1u以及2.5μl的sybrgreen(20×)，补充ddh2o至终体积50μl；

反应条件如下：

(1)预变性：98℃3min；

(2)扩增：98℃10s，58℃30s，共40个循环；

(3)扩增曲线：95℃15s；60℃15s；95℃15s；

s3：对实验结果进行分析。

实施例3

一种利用碱基错配扩增的snp检测方法，包括如下步骤：

s1：以人基因组snp位点rs645112为目的基因,设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物和分子信标探针，所述位点碱基续列如下：

其中f1引物和f2引物的5`端分别连接有通用标签1和通用标签2，连接有通用标签的引物序列如下：

f1`：5`gaaggtgaccaagttcatgcttggaaaacagaagcactaagttctt3`；

f2`：5`gaaggtcggagtcaacggatttggaaaacagaagcactaagttctg3`。

r：5`cacaaagatgatagaaattaagatttcaatggc3`；

两条分子信标探针的3`端引物序列分别与通用标签1和通用标签2的序列相同，所述分子信标探针的碱基序列如下：

beacon-fam：fam-5`acgcgaagttaagacctatgcgcgt3`(dabcyl)gaaggtgaccaagttcatgct-磷酸化；

beacon-hex：hex-5`acgcgaagttaagacctatgcgcgt3`(dabcyl)gaaggtcggagtcaacggatt-磷酸化。

s2：用所述引物和分子信标探针对目的基因进行pcr扩增，具体反应体系如下；

模板dna10ng、f1引物0.5μm、f2引物0.5μm、r引物0.5μm、分子信标beacon-fam0.5μm、分子信标beacon-hex0.5μm、dntp0.2mm以及taqdna聚合酶1u，补充ddh2o至终体积50μl；

反应条件如下：

(1)预变性：94℃5min；

(2)扩增：94℃20s，58℃30s，共36个循环。

s3：对实验结果进行分析。

实验例1

提取目的基因，分别按照实施例1和实施例2中提供的方法对目的基因进行snp检测，并分别进行多个平行实验；以实施例1的多个平行实验生成扩增曲线1，以实施例2的多个平行实验生成扩增曲线2，并进行比较。

实验结果如图1～3所示，由于f1引物与模板能匹配，而f2引物与模板不能匹配，因此以f2作为上游引物的pcr扩增受到抑制，其扩增曲线的ct值比以f1为上游引物时更大，并且△ct＞3，因此认为该位点为纯合。

实验例2

提取目的基因，按照实施例3中提供的方法对目的基因进行snp检测，并进行多次平行实验，对结果进行分析。实验结果如图4所示，靠近y轴的数据点最多，占所有数据点中的一半，靠近x轴的数据点和趋向坐标中间的数据点的数量接近。表明该snp位点上g的纯合子较多，t的纯合子以及g-t杂合子也有检出。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。