本发明属于基因工程领域，涉及利用基因工程技术制备萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记的表面展示目的蛋白或酶的重组枯草芽孢杆菌芽孢的方法，特别是枯草芽孢杆菌芽孢表面展示免疫保护性抗原或催化酶的重组芽孢。
背景技术：
：：枯草芽孢杆菌在营养缺乏时以处于休眠状态的芽孢存在。芽孢具有耐受高温、干燥、化学药物、酸碱的能力，在极端环境中能长期存活，并且能通过动物消化道屏障。枯草芽孢杆菌芽孢对动物具有益生功能，作为人类食品和动物饲料的添加剂被广泛应用，具有良好安全记录。一些枯草芽孢杆菌已建立了可操作的遗传系统，其芽孢的结构、分化及萌发过程已阐明。芽孢由20余种蛋白构成的外层衣壳包围，如cota、cotb、cotc、cote、cotf、cotg和cotx等[1]。这些衣壳蛋白基因缺失或突变不会导致芽孢特性的明显改变。基于芽孢的以上特征，利用基因重组技术使芽孢衣壳蛋白与外源蛋白融合表达并将其展示在芽孢表面，建立的芽孢表面展示技术用来制备具有不同功能的重组芽孢[2-4]。利用芽孢表面展示技术制备表面展示目的蛋白或酶的重组芽孢具有多种生物学活性和功能。如展示病原细菌或病毒免疫保护性抗原的重组芽孢，在通过动物消化道时能诱导动物产生系统和局部保护性免疫反应[2-5]；表面展示特殊功能的酶的重组芽孢[6]，可用于降解环境中的污染物治理环境污染，或作为动物饲料添加酶降解大分子营养成分、提高饲料的利用率。但利用传统芽孢表面展示技术制备的重组芽孢在应用环境中，如在动物肠道、污染环境或动物饲料中，能萌发成营养细胞[7,8]，导致重组芽孢的免疫诱导作用或催化活性丧失，使用价值下降。此外，重组芽孢中含有用于重组菌株筛选的抗生素抗性基因标记，存在一定的安全风险。枯草芽孢杆菌芽孢的萌发受一系列基因表达产物调控，如gera，gerb及gerk操纵子基因等。因此，当这些基因的缺失或突变时，枯草芽孢杆菌芽孢不能萌发形成营养细胞，称为萌发缺陷的芽孢[9]。此外，枯草芽孢杆菌细胞中含有位点特异的重组酶xer，能识别并切割特异性的核苷酸序列[10]。xer酶对染色体上特异序列识别并切割，并导致基因切除重组。本发明的目的在于建立一种制备萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记、表面展示目的蛋白或具有酶促活性的重组芽孢，提高重组芽孢使用安全性和效果。文献[1]driksa(1999)bacillussubtilissporecoat.microbiolmolbiolrev63:1-20[2]maurielloem,ducleh,isticator,cangianog,hongha,etal.(2004)displayofheterologousantigensonthebacillussubtilissporecoatusingcotcasafusionpartner.vaccine22:1177-1187.13.[3]isticator,cangianog,tranht,ciabattinia,medaglinid,etal.(2001)surfacedisplayofrecombinantproteinsonbacillussubtilisspores.jbacteriol183:6294-6301.[4]kimjh,leecs,kimbg(2005)spore-displayedstreptavidin:alivediagnostictoolinbiotechnology.biochembiophysrescom.331:210–214[5]ningd,lengx,liq,xuw(2011)surface-displayedvp28onbacillussubtilissporesinduceprotectionagainstwhitespotsyndromevirusincrayfishbyoraladministration.japplmicrobiol111:1327-1336.[6]kwonks,junghcpanjg(2007)transgalactosylationinawater-solventbiphasicreactionsystemwithβ-galactosidasedisplayedonthesurfacesofbacillussubtilisspore.applenvironmicrobiol.73(7):2251–2256.[7]casulag,cuttingsm(2002)bacillusprobiotics:sporegerminationinthegastrointestinaltract.applenvironmicrobiol68:2344-2352[8]ful,liw,duh,daiwandxuz(2008)oralvaccinationwithenvelopeproteinvp28againstwhitespotsyndromevirusinprocambarusclarkiiusingbacillussubtilisasdeliveryvehicles.lettapplmicrobiol46:581–586[9]hinck,nagorskak,iwanickia,wegrzyng,serorsjandobuchowskim(2006)expressionofgenescodingforgeraandgerksporegerminationreceptorsisdependentontheproteinphosphataseprpe.applenvironmicrobiol.188(12):4373–4383[10]blooraeandrockym.cranenburghrm(2006)anefficientmethodofselectablemarkergeneexcisionbyxerrecombinationforgenereplacementinbacterialchromosomes.applenvironmicrobiol72(4)2520–2525。技术实现要素：为解决现有芽孢表面展示技术制备的重组芽孢在应用过程中存在萌发成营养细胞和携带抗生素抗性基因的问题，本发明提供一种制备萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记、表面展示目的蛋白或具有酶促活性的重组芽孢的方法。本发明所采用的技术方案是：一种表面展示目的蛋白或酶的萌发缺陷和无抗生素抗性基因的重组芽孢制备方法：构建含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白与目的蛋白或酶融合表达的重组基因、两侧有枯草芽孢杆菌位点特异的重组酶xer识别和切除序列的抗生素抗性基因标记、以控制芽孢萌发的关键基因为整合片段将融合表达重组基因整合于染色体的重组载体；将重组载体转化枯草芽孢杆菌，通过同源重组将重组基因整合于染色体上控制芽孢萌发基因中使其插入失活，并通过切除重组和负筛选获得无抗生素抗性基因的重组菌株；诱导重组菌株细胞产生萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记以及表面展示目的蛋白或酶的重组芽孢。本发明中所述枯草芽孢衣壳蛋白包括cota，cotb，cotc，cote，cotg，cotx等芽孢衣壳结构蛋白。整合片段是控制芽孢萌发关键基因的编码序列，所述关键基因选自gera、gerb和gerk操纵子中所有基因。枯草芽孢杆菌位点特异的重组酶xer识别和切割序列是如seqidno.25所示的nif序列，所述抗生素抗性基因指能用于枯草芽孢杆菌重组菌株细胞筛选的基因。本发明中枯草芽孢杆菌重组菌株是整合性重组载体转化枯草芽孢杆菌，并依次通过正筛选和负筛选后得到的菌株。枯草芽孢杆菌包括能被整合性重组质粒转化、有位点特异的重组酶xer的产芽孢菌株。如bacillussubtilisstr.168及其衍生菌株(bacillusgeneticstockcenter，departmentofbiochemistry，theohiostateuniversity，west12thavenue，columbus,ohio，43210，usa)。本发明涉及本发明所构建的整合性重组质粒中，以芽孢衣壳蛋白基因cota(genbankid:936023)、cotb(genbankid:936870)、cotc(genbankid:939543)、cote(genbankid:939508)、cotf(genbankid:936671)、cotg(genbankid:936865)、cotx(genbankid:936417)等与目的蛋白或酶基因进行重组，将目的蛋白或酶融合表达并表面展示于芽孢表面；以控制芽孢萌发的基因geraa(genbankid:935953)、gerab(genbankid:935948)、gerac(genbankid:935951)、gerba(genbankid:936814)、gerbb(genbankid:936827)、gerbc(genbankid:936819)、gerka(genebankid:938285)、gerkb(genbankid:938282)和gerkc(genbankid:938287)以及具有类似功能的基因，作为融合表达衣壳蛋白和目的蛋白或酶的重组基因整合于染色体的整合位点；以两侧有枯草芽孢杆菌xer重组酶识别和切割的序列nif(5’-acttcctagaatatatattatgtaaact-3’(seqidno.25),bloorae,cranenburghrm.applenvironmicrobiol.2006,72(4):2520-2525)的抗生素抗性基因作为重组枯草芽孢杆菌的筛选标记。本发明涉及整合性重组载体转化枯草芽孢杆菌，得到的转化子通过在相应的抗生素存在条件下进行正筛选和无抗生素存在条件下进行负筛选，得到的对抗生素敏感重组菌株。通过诱导重组菌株形成萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记、表面展示目的蛋白或酶的重组芽孢。本发明方法可用于制备以枯草芽孢杆菌芽孢为载体的动物口服重组芽孢疫苗、特异污染物降解酶或动物饲料添加酶等。与本领域已知的方法相比，本发发明方法制备的重组芽孢具有安全和高效的特点和优势。附图说明图1整合性平台载体pjs1700和pjs1837的构建。(a)整合性平台载体pjs1700构建流程和结构示意图。gerkb5'和gerkb3'分别表示控制枯草芽孢杆菌芽孢萌发关键基因gerkb编码序列的5'端和3'端dna片断；apr和emr，分别表示氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因，分别用于筛选escherichiacolidh5α和bacillussubtilis168(trp-)中的转化子；红霉素抗性基因(emr)两端添加枯草芽孢杆菌位点特异重组酶xer识别和切割的序列nif；cotb，含cotb基因的启动子序列和编码序列，但不含终止密码子。oric为大肠杆菌复制子。(b)整合性平台载体pjs1837结构示意图。geraa5'和geraa3'分别表示控制枯草芽孢杆菌芽孢萌发关键基因geraa编码序列中的5'端和3'端dna片断；apr和kmr,分别表示氨苄青霉素抗性基因和卡拉霉素抗性基因，分别用于e.colidh5α或b.subtilis168(trp-)转化子的筛选；卡那霉素抗性基因(kmr)两端添加枯草芽孢杆菌位点特异重组酶xer识别和切割的序列nif；cotc，含cotc基因的启动子序列和编码序列，但不含终止密码子。(c)整合性平台载体pjs1900g构建流程和结构示意图。gerbb5'和gerbb3'分别表示控制枯草芽孢杆菌芽孢萌发关键基因gerbb编码序列的5'端和3'端dna片断。(d)整合性平台载体的鉴定。m，标准分子量dna片段；1,以gerkb-1和em-nif1为引物pcr鉴定pjs1700，扩增产物为gerkb5’-emr(1.6kb)；2，以cotb-1和gerkb-2为引物pcr鉴定pjs1700，扩增产物为cotb-gerkb3’(1.6kb)；3，以geraa-1和km-nif1为引物pcr扩增pjs1837，扩增产物为geraa5’-kmr(1.65kb)；4，以cotc-1和geraa-2为引物pcr鉴定pjs1837，扩增产物为cotc-gerkb3’(1.2kb)；5，以gerbb-1和em-nif1为引物pcr鉴定pjs1900g，扩增产物为gerbb5’-emr(1.7kb)；6，以cotb-1和gerbb-2为引物pcr鉴定pjs1900g，扩增产物为cotb-gerkb3’(1.7kb)。图2融合表达并展示绿色荧光蛋白gfp和枯草芽孢杆菌脂肪酶lipa的整合载体。(a)融合表达并展示gfp和lipa的整合性重组载体结构示意图。pjs1700-gfp融合表达cotb-gfp并展示gfp；pjs1837-gfp融合表达cotc-gfp并展示gfp；pjs1700-lipa融合表达cotb-lipa并展示lipa；pjs1837-lipa融合表达cotc-lipa并展示lipa；pjs1900g-gfp融合表达cotg-gfp并展示gfp；pjs1900g-gfp融合表达cotg-lipa并展示lipa；(b)融合表达gfp和lipa整合载体的pcr鉴定。1,以cotb-1和gfp-k为引物pcr鉴定pjs1700-gfp，扩增产物为cotb-gfp重组片段(1.8kb)；2,以cotc-1和gfp-k为引物pcr鉴定pjs1837-gfp，扩增产物为cotc-gfp(1.4kb)；3,以cotb-1和lipa-k为引物pcr鉴定pjs1700-lipa，扩增产物为cotb-lipa(1.4kb)；4，以cotc-1和lipa-k为引物pcr鉴定pjs1834-lipa，扩增产物为cotc-lipa(1.8kb)；5,以cotg-1和gfp-k为引物pcr鉴定pjs1900g-gfp，扩增产物为cotg-gfp(1.7kb)；6,以cotg-1和lipa-k为引物pcr鉴定pjs1900g-gfp，扩增产物为cotg-gfp(1.7kb)。图3芽孢萌发缺陷、表面展示gfp或lipa重组枯草芽孢杆菌菌株的构建流程。融合表达并展示gfp和lipa的整合载体转化b.subtilisstr.168,分别通过同源重组、正筛选、切除重组和负筛选得到芽孢萌发缺陷、表面展示gfp或lipa的无抗生素抗性标记的重组枯草芽孢杆菌菌株。图4重组枯草芽孢杆菌菌株的pcr鉴定。1,以cotb-1和gerkb-2为引物pcr鉴定重组菌株dr1700-gfp(emr)，扩增产物为cotb-gfp-gerkb3’(2.31kb)；2,以em-nif1和gerkb-1为引物pcr鉴定重组菌株dr1700-gfp(emr)，扩增产物为gerkb5’-emr(1.6kb)；3,以cotc-1和geraa-2为引物pcr鉴定dr1837-gfp重组菌株，扩增产物为cotc-gfp-geraa3’(1.85kb)；4，以km-nif1和geraa-1为引物pcr鉴定dr1837-gfp重组菌株，扩增产物为geraa5’-kmr(1.65kb)；5,以cotb-1和gerkb-2为引物pcr鉴定dr1700-lipa(emr)重组菌株，扩增产物为cotb-lipa-gerkb3’(2.35kb)；6,以em-nif1和gerkb-1为引物pcr鉴定dr1700-lipa(emr)重组菌株，扩增产物为gerkb5’-emr(1.6kb)；7,以cotc-1和geraa-2为引物pcr鉴定dr1837-lipa(kmr)重组菌株，扩增产物为cotc-lipa-geraa3’(1.9kb)；8,以km-nif1和geraa-1为引物pcr鉴定dr1837-lipa(kmr)重组菌株，扩增产物为geraa5’-kmr(1.65kb)；9，以gerbb-1和em-nif1为引物，pcr鉴定dr1900g-gfp(emr)，扩增产物为gerbb5’-emr(1.7kb)；10，以cotg-1和gerbb-2为引物，pcr鉴定dr1900g-gfp(emr)，扩增产物为cotg-gfp-gerbb3’(2.4kb)；11，以gerbb-1和em-nif1为引物，pcr鉴定dr1900g-lipa(emr)，扩增产物为gerbb5’-emr(1.7kb)；12，以cotg-1和gerbb-2为引物，pcr鉴定dr1900g-lipa(emr)，扩增产物为cotg-lipa-gerbb3’(2.3kb)。图5重组枯草芽孢杆菌对相应抗生素的敏感性分析。分别将正筛选和负筛选后得到的重组菌株接种于含相应抗生素的lb平板上，37℃培养。得到对相应抗生素敏感的重组菌株dr1700-gfp(ems)、dr1837-gfp(kms)、dr1700-lipa(ems)、dr1837-lipa(kms)、dr1900g-gfp(ems)和dr1900g-lipa(ems)。图6无抗生素抗性基因标记的重组枯草芽孢杆菌的鉴定。1,以cotb-1和gerkb-2为引物pcr鉴定重组菌株dr1700-gfp(ems)，扩增产物为cotb-gfp-gerkb3’(2.31kb)；2,以em-nif1和gerkb-1为引物pcr鉴定重组菌株dr1700-gfp(ems)，无特异性扩增产物；3,以cotc-1和geraa-2为引物pcr鉴定dr1837-gfp(kms)重组菌株，扩增产物为cotc-gfp-geraa3’(1.85kb)；4，以km-nif1和geraa-1为引物pcr鉴定dr1837-gfp(kms)重组菌株，无特异性扩增产物；5,以cotb-1和gerkb-2为引物pcr鉴定dr1700-lipa(ems)重组菌株，扩增产物为cotb-lipa-gerkb3’(2.35kb)；6,以em-nif1和gerkb-1为引物pcr鉴定dr1700-lipa(ems)重组菌株，无特异性扩增产物；7,以cotc-1和geraa-2为引物pcr鉴定dr1837-lipa(kms)重组菌株，扩增产物为cotc-lipa-geraa3’(1.9kb)；8,以km-nif1和geraa-1为引物pcr鉴定dr1837-lipa(kms)重组菌株，无特异性扩增产物；9，以gerbb-1和em-nif1为引物，pcr鉴定dr1900g-gfp(ems)，无特异性扩增产物；10，以cotg-1和gerbb-2为引物，pcr鉴定dr1900g-gfp(ems)，扩增产物为cotg-gfp-gerbb3’(2.4kb)；11，以gerbb-1和em-nif1为引物，pcr鉴定dr1900g-lipa(ems)，无特异性扩增产物；12，以cotg-1和gerbb-2为引物，pcr鉴定dr1900g-lipa(ems)，扩增产物为cotg-lipa-gerbb3’(2.3kb)。图7重组芽孢萌发能力分析。诱导重组菌株dr1700-gfp(ems)、dr1837-gfp(kms)、dr1700-lipa(ems)、dr1837-lipa(kms)、dr1900g-gfp(ems)和dr1900g-lipa(ems)形成成熟芽孢，将纯化和定量后的重组芽孢接种于无抗生素的lb平板，37℃培养30h。图8重组菌株dr1700-gfp(ems)、dr1837-gfp(kms)和dr1900g-gfp(ems)芽孢表面展示gfp的鉴定。b可见光观察芽孢(10×100油镜)；f荧光观察芽孢(10×100oil)。图9重组菌株dr1700-lipa(ems)、dr1837-lipa(kms)和dr1900g-lipa(ems)芽孢脂肪酶活性分析。4-硝基苯比色法测定、重组芽孢脂肪酶活性。wt为野生型b.subtilis168芽孢。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。本发明实施例中涉及的由发明人保存的生物材料，均可向公众提供20年。本发明实施例中所用基因扩增引物见表1：表1.本发明所用引物序列实施例1以gerkb为整合位点的无抗生素抗性基因萌发缺陷且表面展示绿色荧光蛋白(gfp)的重组枯草芽孢杆菌芽孢的制备1.分子生物学操作1.1枯草芽孢杆菌染色体的提取离心收集10mlbacillussubtilis168(trp-)培养物，加0.5mlte悬浮沉淀。每个微量离心管加入30μl溶菌酶(100mg/ml)，于37℃反应1h；加入50μl10％的十二烷基磺酸钠(sds)与20μl20mg/ml的蛋白酶k，震荡均匀，于37℃反应2h，加入等体积的苯酚和氯仿抽提后取上清，加入2倍体积的乙醇，室温2h后，12,000g离心10min，弃上清液后以75％乙醇500μl洗dna沉淀物，以去除无机盐离子。待dna沉淀物干燥后，加入30～50μlte或ddh2o溶解dna，于-20℃下保存备用。1.2分子生物学技术操作所有质粒的构建采用sambrook等(《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的标准分子生物学技术进行，用于本发明的所有回收dna片段均采用上海生工生物工程有限公司凝胶回收试剂盒分离纯化。所有pcr产物克隆片段均经上海生工生物工程有限公司测序。pcr试剂、限制性内切酶和连接酶均采用宝生物工程(大连)有限公司，酶切及连接反应体系及条件按照产品说明书进行设置。1.3pcr扩增用于基因扩增的引物由上海生工生物技术有限公司合成，为便于扩增产物的克隆部分引物5’端添加限制性内切酶识别位点，pcr反应体系中含10mmtris·cl(ph8.3)，50mmmgcl2，上下游引物各100pm，200μmdntps，50ng模板dna，2.5udna聚合酶。pcr反应程序根据不同引物及产物特征设置。2.细菌的转化2.1escherichiacolidh5α的转化e.colidh5α感受态细胞的制备和转化采用sambrook等(《分子克隆实验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述方法进行。取一个e.colidh5α单菌落转移到含20mmol/lmgso4的sob中，37℃培养约3h；培养物转移至预冷的离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃；5000rpm4℃离心10分钟，弃上清；加20ml预冷fsb悬浮细胞，继续冰浴10min；5000rpm4℃离心10min，弃上清。加2ml冰预冷的fsb重悬沉淀140μl二甲基亚砜(dmso)，混匀后置冰上15分钟，再加140μldmso，分装保存于-70℃冰箱。取5μl连接产物加入感受态细胞中，混匀冰浴30min，42℃热激90秒，冰浴1-2分钟；加0.8mlsoc培养基，37℃温育45～60min；5000rpm离心5min，弃上清后加100μlsoc培养基悬浮细胞，并转移到含相应抗生素的lb平板中，涂布均匀后，37℃培养12-16h。培养基及主要试剂配制fsb缓冲液：至终浓度10mm乙酸钾，45mmmncl2，10mmcacl2，100mmkcl，3mm氯化六氨合高钴，10％甘油。lb培养基：1％胰化蛋白胨,0.5％酵母提取物,1％nacl。sob培养基：2％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％nacl，2.5mmkcl，10mmmgcl2。soc培养基：1lsob培养基中加20ml1m灭菌的葡萄糖。固体培养基：以上相应液体培养基中添加1.5％琼脂糖2.2b.subtilis168(trp-)的转化b.subtilis168细胞接种于lb平板，37℃培养2天。取一个单菌落接于5mlgmⅰ溶液，在30℃100rpm振荡培养过夜。次日取2ml转接到18mlgmⅰ中，37℃200rpm振荡培养3.5h。再取10ml转接到90mlgmⅱ中，37℃100rpm振荡培养90min，离心收集菌体。用10ml上清液悬浮菌体，并加30％的灭菌甘油至10％，混匀后按每管0.5ml分装，-70℃保存。转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入适量dna(1μg/ml)。于37℃缓慢振荡(80rpm)保温30min后涂含相应抗生素平板，于37℃培养过夜。主要试剂的配制10×最低盐溶液：14gk2hpo4，6gkh2po4，2g(nh4)2so4，1g柠檬酸钠，0.2gmgso4.7h2o，加水至100ml。l-色氨酸溶液：2mg/mll-色氨酸，避光保存。gmⅰ溶液：1×最低盐溶液95ml，1ml50％葡萄糖，0.4ml5％水解酪蛋白，1ml10％酵母提取物，2.5mll-色氨酸溶液。gmⅱ溶液：1×最低盐溶液97.5ml，1ml50％葡萄糖，80μl5％水解酪蛋白，40μl10％酵母提取物，0.5ml0.5mmgcl2，0.5ml0.1mcacl2，0.5mll-色氨酸溶液。3.以gerkb为整合位点整合性载体的构建3.1以gerkb为整合位点的整合性平台载体的构建以gerkb-1和gerkb-2为引物，b.subtilis168染色体为模板，pcr扩增gerkb基因片段，t4dna聚合酶补平后克隆于pjs313(ndei酶切位点被破坏的puc18质粒,《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)中pvuii位点，得到的重组质粒为pjs1484。以gerkb-p和gerkb-s为引物，pjs1484为模板，反转pcr扩增产物以psti和saci酶切；以含有nif序列的em-nif1和em-nif2为引物，pmutin4质粒(laboratoiregenetiquemicrobienne,inra,domainedevilvert,jouy-en-josas78350,france)为模板，pcr扩增emr基因；以cotb-1和cotb-2为引物，pcr扩增包含启动子的cotb基因。以纯化cotb基因和emr基因混合物为模板，em-nif2和cotb-2为引物，pcr扩增重组片段emr-cotb，扩增产物正向克隆于pmd-18t(购自宝生物工程(大连)有限公司)载体中，转化e.colidh5α得到重组质粒pjs1692。以psti和saci酶切pjs1692，回收emr-cotb重组片段与相同酶切的pjs1484反转pcr产物连接，得到整合性平台载体命名为pjs1700(见本发明附图说明和附图1)。该平台质粒含有枯草芽孢杆菌xer位点特异重组酶识别序列nif的红霉素抗性基因(emr)筛选标记、含启动子序列但无终止密码子的芽孢衣壳蛋白基因cotb、以及作为整合平台的gerkb基因片段。在cotb基因下游有多克隆位点ndei、xbai、bamhi、kpni和saci，便于表面展示目的蛋白或酶的基因克隆。3.2以gerkb为整合位点融合表达cotb-gfp的整合性载体构建以gfp-n和gfp-k为引物，pbad-gfpuf(clontechlaboratories,inc.,1020eastmeadowcircle,paloalto,ca94303-4230,usa)为模板，pcr扩增gfp基因片段，以ndei/kpni酶切，回收产物克隆克隆于pjs1700载体中，转化e.colidh5α得到重组质粒pjs1700-gfp(见本发明附图说明和附图2)。该质粒中含有emr-cotb-gfp重组片段，在枯草芽孢杆菌细胞中cotb启动子控制下表达融合蛋白cotb-gfp。4.芽孢融合表达cotb-gfp的重组枯草芽孢杆菌菌株制备将整合性质粒pjs1700-gfp转化b.stubtilis168，以0.4μg/ml的红霉素(em)筛选转化子。通过重组载体上的gerkb片段与染色体上同源基因片段同源重组，将重组片段emr-cotb-gfp插入控制芽孢萌发的重要基因gerkb的编码序列中整合于染色体上，导致该基因插入失活(见本发明附图说明和附图3)。转化子分别以特异引物pcr鉴定(见本发明附图说明和附图4)，鉴定后的重组菌株分别命名为dr1700-gfp(emr)。5.无红霉素抗性基因的重组枯草芽孢杆菌菌株制备为获得无抗生素抗性基因标记的重组菌株dr1700-gfp(ems)，将重组菌株dr1700-gfp(emr)通过无抗生素抗性lb培养24-30h(8-12代，切除重组频率约为3％)。将传代细菌在无抗生素lb平板上单菌落培养，并通过影印技术将菌落转移至含0.4μg/mlem的lb平板上，利用枯草芽孢杆菌xer重组酶对emr两侧的nif序列进行切除重组，筛选对红霉素敏感的菌落(ems)(见本发明附图说明和附图3和图5)。鉴定后将其命名为重组菌株dr1700-gfp(ems)(见本发明附图说明和附图6)。6.萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记及表面展示gfp的重组芽孢的制备以dsm培养基诱导重组菌株dr1700-gfp(ems)形成芽孢。dsm培养基的配制：0.8％肉汤营养液(difco),0.1％kcl,0.025％mgso4·7h2o,1.0mmca(no3)2,10μmmncl2,1.0μmfeso4)。取重组菌株dr1700-gfp(ems)单菌落接种于3mldsm培养基中，37℃震荡培养40h，5000rpm离心10min收集芽孢，重悬于1ml无菌水中。以终浓度为10mg/ml溶菌酶37℃处理30min破坏营养细胞，5000rpm离心10min沉淀芽孢，加1ml水重悬芽孢。取5μl纯化后的重组芽孢涂布与lb(1％tryptone,0.5％yeastextract,1％nacl)培养基平板上，37℃培养。观察发现重组芽孢不能萌发形成营养细胞(见本发明附图说明和附图7)。取10μl芽孢悬液涂于载玻片上，盖上盖玻片，利用装置在leicadfc300fx荧光显微镜上的leicaqwinlite图像分析软件辅助的leicadfc300fx冷ccd数码摄像头进行拍摄。gfp荧光通过sapphiregfp滤光片组件(激发光滤光片bf470/40,dichromaticmirror:500,发射光滤片:bp525/50)观察，拍摄快门速度为270ms。观察结果显示重组芽孢表面具有强烈的绿色荧光(见本发明附图说明和附图8)。实施例2以geraa为整合位点的无抗生素抗性基因标记表面展示gfp蛋白的重组枯草芽孢杆菌芽孢的制备1.分子生物学操作及细菌转化与实施例1中1.和2.所述方法相同。2.以geraa为整合位点的整合性载体的构建2.1以geraa为整合位点的整合性平台载体的构建以geraa-1和geraa-2为引物，b.subtilis168染色体为模板，pcr扩增geraa基因片段，t4dna聚合酶补平后克隆于pjs313(ndei酶切位点被破坏的puc18质粒,《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)中pvuii位点，得到的重组质粒为pjs1482。pjs1482质粒中的geraa片段中存在psti和saci酶切位点。以含nif序列的km-nif1和km-nif2引物，pub110(molecular,cellular,anddevelopmentalbiology,universityofcolorado,boulder,co80309,usa)质粒为模板，pcr扩增卡那霉素抗性基因(kmr)；以cotc-1和cotc-2为引物，pcr扩增含启动子的cotc基因。以纯化后的cotc基因和kmr基因片段混合物为模板，km-nif2和cotc-2为引物，pcr扩增kmr-cotb重组片段，扩增产物正向克隆于pmd-19t(宝生物工程(大连)有限公司)载体中，转化e.colidh5α得到重组质粒pjs1834。以psti和saci酶切pjs1834，回收kmr-cotc重组片段，与相同酶切pjs1482连接，得到整合性平台载体命名为pjs1837(见本发明附图说明和附图1)。该平台载体含两端有枯草芽孢杆菌xer位点特异重组酶识别序列nif的卡那霉素抗性基因(kmr)、含启动子序列但无终止密码子的芽孢衣壳蛋白基因cotc、以及作为重组基因整合于染色体geraa基因中的整合片段。在cotc基因下游有ndei、xbai、bamhi、kpni和saci多克隆位点，便于表面展示目的蛋白或酶的基因克隆。2.2以geraa为整合位点融合表达cotc-gfp的整合性载体构建以gfp-n和gfp-b为引物，pbad-gfpuf(clontechlaboratories,inc.,1020eastmeadowcircle,paloalto,ca94303-4230,usa)为模板，pcr扩增gfp基因片段，以ndei和kpni酶切，回收产物gfp片段克隆克隆于pjs1837平台质粒中，转化e.colidh5α得到重组质粒pjs1837-gfp(见本发明附图说明和附图2)。该质粒中含有kmr-cotc-gfp重组片段，在枯草芽孢杆菌芽孢中融合表达重组蛋白cotc-gfp。3.芽孢融合表达cotc-gfp的重组枯草芽孢杆菌菌株构建将整合性载体pjs1837-gfp转化b.stubtilis，以10μg/ml的km筛选转化子。通过重组质粒上的geraa片段与染色体上同源基因片段双交换重组，将重组片段kmr-cotc-gfp插入控制芽孢萌发的重要基因geraa的编码序列中并整合于染色体上，导致geraa插入失活(见本发明附图说明和附图3)。转化子分别以特异引物通过pcr鉴定(见本发明附图说明和附图4)，鉴定后的重组菌株分别命名为dr1837-gfp(kmr)。4.无卡那霉素抗性基因标记重组枯草芽孢杆菌菌株的筛选与实施例1中5.所述方法相同。将传代细菌在无抗生素平板上单菌落培养,并通过影印平板将平板菌落转移至含10μg/mlkm的lb平板上，利用枯草芽孢杆菌xer重组酶对kmr两侧的nif序列进行切除重组，筛选对卡拉霉素敏感的菌落(kms)(见本发明附图说明和附图3和图5)。通过pcr对其抗性基因进行鉴定(见本发明附图说明和附图6)，并将重组菌株命名为dr1837-gfp(kms)。5.萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记及表面展示gfp的重组芽孢制备以实施例1中6.所述方法制备并鉴定dr1837-gfp(kms)菌株重组芽孢的萌发能力(见本发明附图说明和附图7)和表面展示gfp(见本发明附图说明和附图8)。实施例3以gerbb为整合位点无抗生素抗性基因标记表面展示gfp的重组枯草芽孢杆菌芽孢的制备1.分子生物学操作及细菌转化与实施例1中1.和2.所述方法相同。2.以gerbb为整合位点整合性载体的构建2.1以gerbb为整合位点的整合性平台载体的构建以gerbb-1和gerbb-2为引物，b.subtilis168染色体为模板，pcr扩增gerbb基因片段，t4dna聚合酶补平后克隆于pjs313(ndei酶切位点被破坏的puc18质粒,《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)中pvuii位点，得到的重组质粒为pjs1881g。以gerbb-p和gerbb-s为引物，pjs1881g为模板，反转pcr扩增产物以psti和saci酶切；以含有nif序列的em-nif1和em-nif2为引物，pmutin4质粒(laboratoiregenetiquemicrobienne,inra,domainedevilvert,jouy-en-josas78350,france)为模板，pcr扩增emr基因；以cotg-1和cotg-2为引物，pcr扩增包含启动子的cotg基因。以纯化cotg基因和emr基因混合物为模板，em-nif2和cotg-2为引物，pcr扩增重组片段emr-cotg，扩增产物正向克隆于pmd-18t(购自宝生物工程(大连)有限公司)载体中，转化e.colidh5α得到重组质粒pjs1804g。以psti和saci酶切pjs1804g，回收emr-cotb重组片段与相同酶切的pjs1881g反转pcr产物连接，得到整合性平台载体命名为pjs1900g(见本发明附图说明和附图1)。该平台质粒含有枯草芽孢杆菌xer位点特异重组酶识别序列nif的emr筛选标记、含启动子序列但无终止密码子的芽孢衣壳蛋白基因cotg、以及作为整合平台的gerbb基因片段。在cotg基因下游有多克隆位点ndei、xbai、bamhi、kpni和saci，便于表面展示目的蛋白或酶的基因克隆。2.2以gerbb为整合位点融合表达cotg-gfp的整合性载体构建以gfp-n和gfp-k为引物，pbad-gfpuf(clontechlaboratories,inc.,1020eastmeadowcircle,paloalto,ca94303-4230,usa)为模板，pcr扩增gfp基因片段，以ndei/kpni酶切，回收产物克隆克隆于pjs1900g体中，转化e.colidh5α得到重组质粒pjs1900g-gfp(见本发明附图说明和附图2)。该质粒中含有emr-cotb-gfp重组基因，在枯草芽孢杆菌细胞中cotg启动子控制下表达融合蛋白cotg-gfp。3.芽孢融合表达cotg-gfp的重组枯草芽孢杆菌菌株构建将整合性载体pjs1900g-gfp转化b.stubtilis，以0.4μg/ml的em筛选转化子。通过重组质粒上的gerbb片段与染色体上同源基因片段双交换重组，将重组基因片段emr-cotg-gfp插入控制芽孢萌发的重要基因gerbb的编码序列中并整合于染色体上，导致gerbb插入失活(见本发明附图说明和附图3)。转化子分别以特异引物通过pcr鉴定(见本发明附图说明和附图4)，鉴定后的重组菌株分别命名为dr1900g-gfp(emr)。4.无红霉素抗性基因标记重组枯草芽孢杆菌菌株的筛选与实施例1中5.所述方法相同。将传代细菌在无抗生素平板上单菌落培养，并通过影印平板将平板菌落转移至含0.4μg/mlem的lb平板上，利用枯草芽孢杆菌xer重组酶对emr两侧的nif序列进行切除重组，筛选对红霉素敏感的菌落(ems)(见本发明附图说明和附图3和图5)。通过pcr对其抗性基因进行鉴定(见本发明附图说明和附图6)，并将重组菌株命名为dr1900g-gfp(ems)。5.萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记及表面展示gfp的重组芽孢制备以实施例1中6.所述方法制备并鉴定dr1900g-gfp(ems)菌株重组芽孢的萌发能力(见本发明附图说明和附图7)和表面展示gfp(见本发明附图说明和附图8)。实施例4以gerkb为整合位点的无抗生素抗性基因标记表面展示脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌芽孢的制备1.分子生物学操作及细菌转化与实施例1中1.和2.所述方法相同。2.以gerkb为整合位点融合表达cotb-lipa的整合性质粒的整合载体构建根据bacillussubtilis168染色体上的脂肪酶基因lipa(genbankid:938861)序列合成引物lipa-n和lipa-k。为便于克隆，上游引物lipa-n添加了ndei位点，下游引物lipa-k添加了kpni位点，以lipa-n和lipa-k:为引物，以bacillussubtilis168(trp-)染色体为模板，pcr扩增lipa基因编码序列片段。pcr产物大小为709bp，以限制性内切酶ndei和kpni酶切，酶切产物回收后，克隆于本发明实施例1中2所述的整合性平台载体pjs1700(见本发明附图说明和附图1)中，得到的重组载体命名为pjs1700-lipa(见本发明附图说明和附图2)。该整合性载体中含有emr-cotb-lipa重组片段，在枯草芽孢杆菌芽孢中融合表达重组蛋白cotb-lipa。3.芽孢表面展示lipa的重组枯草芽孢杆菌菌株构建。将整合性质粒pjs1700-lipa转化b.stubtilis，以0.4μg/ml的em筛选转化子。通过重组质粒上的gerkb片段与染色体上同源基因片段同源重组，将重组片段emr-cotb-lipa插入控制芽孢萌发的重要基因gerkb的编码序列中并整合于染色体上，导致gerkb插入失活(见本发明附图说明和附图3)。转化子分别以特异引物通过pcr鉴定(见本发明附图说明和附图4)，鉴定后的重组菌株分别命名为dr1700-lipa(emr)。4.无红霉素抗性基因标记重组枯草芽孢杆菌菌株的筛选与实施例1中5.所述方法相同。将传代细菌细胞以适当的浓度稀释有涂布与无抗生素lb平板上培养形成单菌落,并通过影印平板将平板菌落转移至含0.4μg/mlem的lb平板上，利用枯草芽孢杆菌xer重组酶对emr两侧的nif序列进行切除重组，筛选对红霉素敏感的菌落(ems)(见本发明附图说明和附图3和图5)。通过pcr对其抗性基因进行鉴定(见本发明附图说明和附图6)，并将重组菌株命名为dr1700-lipa(ems)。5.萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记及表面展示lipa的重组芽孢以实施例1中6.所述方法制备dr1700-lipa(ems)重组芽孢并分析重组芽孢的萌发能力(见本发明附图说明和附图7)。显微镜观察计数芽孢，调整芽孢的浓度，使终浓度约为2×1010个/ml。用下述方法分析重组芽孢表面展示脂肪酶活性(见本发明附图说明和附图9)。反应液的配制：1mm4-硝基苯基月桂酸酯,5％(v/v)异丙醇,0.6％(v/v)tritonx-100，50mmpbs缓冲液(ph7.0)。重组芽孢脂肪酶水解反应：在50ml具塞锥形瓶中，加入1×1010个重悬重组芽孢，加反应液至20ml，于37℃摇床中，200rpm，每间隔30min取2ml反应混和物。阴性对照脂肪酶水解反应：在50ml具塞锥形瓶中，加入1×1010个野生型b.subtilis168芽孢，加反应液至20ml，于37℃摇床中，200rpm，每间隔30min取2ml反应混和物。芽孢脂肪酶活性测定：一定时间间隔取出的2ml反应混和物8000rpm离心5min，沉淀芽孢，取2ml上清液于比色皿中，同时取2ml反应液于另一比色皿中作空白对照；以分光光度计测定405nm的光吸收值。重组芽孢及对照菌株芽孢脂肪酶活性测定结果见本发明附图说明和附图9。实施例5以geraa为整合位点无抗生素抗性基因标记表面展示脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌芽孢的制备1.分子生物学操作及细菌转化与实施例1中1.和2.所述方法相同。2.以geraa为整合位点融合表达cotc-lipa的整合性构建以本发明专利实施例4中2.所述方法制备脂肪酶基因lipa片段，以限制性内切酶ndei和kpni酶切，酶切产物回收后，克隆于本发明实施例2中2所述以geraa为整合性平台载体pjs1837中，重组质粒命名为pjs1837-lipa(见本发明附图说明和附图2)。该整合性载体中含有kmr-cotc-lipa重组片段，在枯草芽孢杆菌芽孢中融合表达重组蛋白cotc-lipa(见本发明附图说明和附图2)。3.芽孢融合表达cotc-lipa的重组枯草芽孢杆菌菌株构建将整合性质粒pjs1837-lipa转化b.stubtilis，以10μg/ml的km筛选转化子。通过重组质粒上的geraa片段与染色体上同源基因片段进行同源重组，将重组片段kmr-cotc-lipa插入控制芽孢萌发的重要基因geraa的编码序列中并整合于染色体，导致geraa插入失活(见本发明附图说明和附图3)。转化子分别以特异引物通过pcr鉴定，鉴定后的重组菌株分别命名为dr1837-lipa(kmr)(见本发明附图说明和附图4)。4.无卡拉霉素抗性基因标记的重组枯草芽孢杆菌菌株筛选与实施例1中5.所述方法相同。将传代细菌细胞以适当的浓度稀释后涂布于无抗生素lb平板上培养形成单菌落，通过影印平板将平板菌落转移至含10μg/mlkm的lb平板上，利用枯草芽孢杆菌xer重组酶对kmr两侧的nif序列进行切除重组，筛选对卡拉霉素敏感的菌落(kms)(见本发明附图说明和附图3和图5)。通过pcr对其抗性基因进行鉴定(见本发明附图说明和附图6)，并将重组菌株命名为dr1837-lipa(kms)。5.萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记及表面展示lipa的重组芽孢。以本发明专利实施例1中6.所述方法制备dr1837-lipa(kms)重组芽孢，分析重组芽孢的萌发能力(图7)。以本发明专利实施例4中5.所述之方法分析重组芽孢表面展示脂肪酶活性。dr1837-lipa(kms)重组芽孢脂肪酶活性测定结果见本发明附图说明和附图9。实施例6以gerbb为整合位点无抗生素抗性基因标记表面展示脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌芽孢1.分子生物学操作及细菌转化与实施例1中1.和2.所述方法相同。2.以gerbb为整合位点融合表达cotg-lipa的整合性构建以本发明专利实施例4中2.所述方法制备脂肪酶基因lipa片段，以限制性内切酶ndei和kpni酶切，酶切产物回收后，克隆于本发明实施例3中2.所述以gerbb为整合性平台载体pjs1900g中，重组质粒命名为pjs1900g-lipa(见本发明附图说明和附图2)。该整合性载体中含有emr-cotg-lipa重组片段，在枯草芽孢杆菌芽孢中融合表达重组蛋白cotc-lipa(见本发明附图说明和附图2)。3.芽孢融合表达cotg-lipa的重组枯草芽孢杆菌菌株构建将整合性质粒pjs1900g-lipa转化b.stubtilis，以0.4μg/ml的em筛选转化子。通过重组质粒上的gerbb片段与染色体上同源基因片段进行同源重组，将重组基因片段(emr-cotg-lipa)整合于染色体上，并且重组基因片段插入控制芽孢萌发的重要基因gerbb的编码序列中并整合于染色体，导致gerbb插入失活(见本发明附图说明和附图3)。转化子分别以特异引物通过pcr鉴定，鉴定后的重组菌株分别命名为dr1900g-lipa(emr)(见本发明附图说明和附图4)。4.无红霉素抗性基因标记的重组枯草芽孢杆菌菌株筛选与实施例1中5.所述方法相同。将传代细菌细胞以适当的浓度稀释后涂布于无抗生素lb平板上培养形成单菌落，通过影印平板将平板菌落转移至含0.4μg/mlem的lb平板上，利用枯草芽孢杆菌xer重组酶对emr两侧的nif序列进行切除重组，筛选对红霉素敏感的菌落(ems)(见本发明附图说明和附图3和图5)。通过pcr对其抗性基因进行鉴定(见本发明附图说明和附图6)，并将重组菌株命名为dr1900g-lipa(ems)。5.萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记及表面展示lipa的重组芽孢。以本发明专利实施例1中6.所述方法制备dr1900g-lipa(kms)重组芽孢，分析重组芽孢的萌发能力(图7)。以本发明专利实施例4中5.所述之方法分析重组芽孢表面展示脂肪酶活性。dr1900g-lipa(ems)重组芽孢脂肪酶活性测定结果见本发明附图说明和附图9。sequencelisting<110>中国科学院水生生物研究所<120>一种表面展示目的蛋白或酶的萌发缺陷和无抗生素抗性基因的重组芽孢制备方法<130><160>25<170>patentinversion3.3<210>1<211>50<212>dna<213>人工序列<400>1gagtttacataatatatattctaggaagtcggattaggccgtttgtcctc50<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<400>2catatgggatgattgatcatctgaagat28<210>3<211>56<212>dna<213>人工序列<400>3ccggagtttacataatatatattctaggaagtccggttcaaaataaatgcattccc56<210>4<211>36<212>dna<213>人工序列<400>4catatggtgttttttatgctttttatactctacaac36<210>5<211>54<212>dna<213>人工序列<400>5gagtttacataatatatattctaggaagtcctctgcctttggagacagtgtccc54<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6catatggtcgtcgcagtggtggtgcg26<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7gacctcattggaacaaacagag22<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8caatgacactgacgacaatgacc23<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<400>9gtgatcggccatctcatgcgcc22<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<400>10gagcatacaggcaaattgctggg23<210>11<211>39<212>dna<213>人工序列<400>11gagagacacactgcaggacaacctctcccaaaatccgag39<210>12<211>36<212>dna<213>人工序列<400>12gagagacacagagctccgccaatggcagttgtggtg36<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列<400>13gagttaatgcttggcaatgcg21<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gggtaacctgcaagctgacc20<210>15<211>36<212>dna<213>人工序列<400>15gagagacacactgcagaattctgtgtcccggtcaag36<210>16<211>37<212>dna<213>人工序列<400>16gagagacacagagctcaggacaacagcaacattcgtc37<210>17<211>50<212>dna<213>人工序列<400>17ggacttcctagaatatatattatgtaaactccgttaatgcgccatgacag50<210>18<211>54<212>dna<213>人工序列<400>18cccgggagtttacataatatatattctaggaagtgacgaaactgcaaaatatcc54<210>19<211>50<212>dna<213>人工序列<400>19gacttcctagaatatatattatgtaaactcgaaaagtgccacctgacgtc50<210>20<211>54<212>dna<213>人工序列<400>20cccgggagtttacataatatatattctaggaagtagctccttggaagctgtcag54<210>21<211>33<212>dna<213>人工序列<400>21gagatatacatatggctagcaaaggagaagaac33<210>22<211>36<212>dna<213>人工序列<400>22gagatataggtaccgcaggtcgactctagaggatcc36<210>23<211>31<212>dna<213>人工序列<400>23gagagacatatgtcggtcgtgtcggccatcc31<210>24<211>34<212>dna<213>人工序列<400>24ggagagaggtaccttaactcggtctcagtgccag34<210>25<211>28<212>dna<213>人工序列<400>25acttcctagaatatatattatgtaaact28当前第1页12当前第1页12