红曲菌聚酮合酶基因PKS1的重组载体构建及其在重组米曲霉中的表达的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种表达红曲菌聚酮合酶基因pks1基因的重组载体，同时还涉及该重组载体的构建方法，包含该重组载体的重组工程菌及其表达红曲菌聚酮合酶基因pks1基因方法。

背景技术：

由真菌产生的聚酮化合物是一类重要的次级代谢产物，具体是由真菌细胞中的聚酮合酶将低级羧酸通过连续的缩合反应产生的天然产物。这些由不同聚酮合酶所产生的化合物具有一系列复杂的结构，其中已经发现的包括许多具有抑制细菌(如红霉素、四环素)、真菌(如灰黄霉素、两性霉素)、寄生虫(如avermectin、奈马克丁)、癌症(如多柔比星、enediynes)等活性的化合物，有些抗真菌聚酮化合物同时还具有免疫抑制剂的活性(如雷帕霉素、fk506)，它们被广泛地应用于医药、食品、畜牧和农业[1，2]。

红曲菌(又称为红曲霉，monascusspp.)，是东南亚地区传统发酵食品红曲的生产菌种，能够产生大量具有生物活性的聚酮化合物[2]。已知红曲菌基因组中包含有合成不同聚酮化合物的关键基因-聚酮合酶。红曲菌可分泌多种具有生物活性的聚酮化合物，如：红曲色素、莫纳可林k(monacolink)等[3，4]。近年来，随着医药工业与精细化工工业的发展，红曲菌产生的聚酮化合物1-乙酮-2，6，8-三羟基-7-甲基-萘(萘三酚)以其安全性与抗氧化活性受到了越来越多的关注，成为相关产品中重要的可添加成分。因此，开发高产低成本的萘三酚生产菌株成为工业化应用的重要条件。

1-乙酮-2，6，8-三羟基-7-甲基-萘(萘三酚)的结构

然而，通过天然红曲菌来生产萘三酚存在以下三个问题：(1)天然红曲菌生长较缓慢，生长条件较苛刻，最长需要14天才能积累一定量的萘三酚；(2)由于萘三酚能够被天然红曲菌菌株中其他酶类代谢，因此发酵后产生的萘三酚浓度很低，在工业上生产成本较高；(3)由于红曲菌发酵的产物中，各种次级代谢产物的种类较多，因此在后期从众多产物中分离萘三酚较为困难，进一步限制了用红曲菌生产萘三酚的可能性。

通过构建含有pks1基因的基因重组米曲霉，能够有效克服以上三个问题：(1)选择生长周期更短的米曲霉作为宿主菌，能够有效缩短发酵时间，普通的米曲霉生长周期只有5-7天，较红曲菌的生长周期缩短一半；(2)米曲霉作为生产次级代谢产物常用的宿主菌，具有较高的生产能力，能够提高红曲菌聚酮合酶基因的表达量，从而显著增加产物萘三酚的产量，有效降低工业生产的成本；(3)米曲霉宿主菌中自身的次级代谢产物种类少，因此产生较高浓度的萘三酚之后，产物萘三酚较易于分离，进一步降低工业生产的成本。这将是实现聚酮化合物萘三酚高效生产的可行途径，目前尚未见有关于利用重组米曲霉(aspergillusoryzae)来制备萘三酚的方法。

参考文献：

[1]孙宇辉，邓子新.聚酮化合物及其组合生物合成.中国抗生素杂志，200631(1)：6-18.

[2]郭芳，郭东川，李钟庆.红曲菌的色素与产生菌.微生物学杂志.2005，24(6)：11-14.

[3]fengyl，shaoyc，chenfs.monascuspigments.appl.microbiol.biotechnol.2012，96(6)：1421-1440.

[4]hsulc，hsuyw，liangyh，kuoyh，pantm.anti-tumorandanti-inflammatorypropertiesofankaflavinandmonaphiloneafrommonascuspur-pureusntu568.j.agric.foodchem.2011，59(4)：1124-1130.

技术实现要素：

本发明的第一个目的是克服现有技术中的不足，提供一种表达红曲菌(monascusruber)聚酮合酶基因pks1的重组载体，采用该表达载体的米曲霉表达系统能够表达红曲菌聚酮合酶基因pks1。

本发明的第二个目的是提供一种表达红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组载体的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种表达红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组载体的重组米曲霉菌种。

本发明的第四个目的是提供一种利用重组工程菌诱导表达红曲菌聚酮合酶基因pks1的方法。

为实现上述目的，发明人首次通过基因工程构建了含有红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组米曲霉。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2015年01月04日，保藏号为cgmccno.10276。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种表达红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组载体的构建方法，包括以下步骤；

(1)提取红曲菌(monascusruber)ccam070120的总rna，反转录为cdna，以该cdna为模板，用序列表中seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列为上、下游引物进行pcr，扩增出序列表中seqidno.7所示3112bp的红曲菌聚酮合酶基因pks1全基因第一部分片段；用序列表中seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列为上、下游引物进行pcr，扩增出序列表中seqidno.8所示2376bp的红曲菌聚酮合酶基因pks1全基因第二部分片段；用序列表中seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列为上、下游引物进行pcr，扩增出序列表中seqidno.9所示2585bp的红曲菌聚酮合酶基因pks1全基因第三部分片段；

(2)红曲菌聚酮合酶基因pks1构建至米曲霉表达载体：将红曲菌聚酮合酶基因pks1的三个基因片段连接至载体ptayagsarg3p，获得含有红曲菌聚酮合酶基因pks1全长的重组质粒ptayagsarg3p-pks1，红曲菌聚酮合酶基因pks1全部序列全长8073bp，如seqidno.10所示。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种利用重组工程菌诱导表达红曲菌聚酮合酶基因pks1的方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求4重组工程菌接种在2-3ml的察氏培养基(ph＝5.5)中预培养，150-250转/分钟，25-32℃培养24小时；

(2)按1-5％(v/v)的接种量将权利要求6中步骤(1)的经预培养的菌液转接至50ml察氏培养基中，150-250转/分钟，25-32℃条件下培养24-120小时，诱导重组米曲霉表达红曲菌聚酮合酶基因pks1；

(3)诱导培养结束后，离心收集菌体，超声破碎，然后在8000rpm条件下离心取上清液，即获得产物萘三酚溶液。

本发明方法具有以下优点：

(1)选择生长周期更短的米曲霉作为宿主菌，能够有效缩短发酵时间，普通的米曲霉生长周期只有5-7天，较红曲菌的生长周期缩短一半；

(2)米曲霉作为生产次级代谢产物常用的宿主菌，具有较高的生产能力，能够提高红曲菌聚酮合酶基因的表达量，从而显著增加产物萘三酚的产量，有效降低工业生产的成本；

(3)米曲霉宿主菌中自身的次级代谢产物种类少，因此产生较高浓度的萘三酚之后，产物萘三酚较易于分离，进一步降低工业生产的成本。

生物材料样品的保藏信息：

保藏的生物材料样品：米曲霉pks-1(aspergillusoryzaepks-1)；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：cgmcc)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)；

保藏日期：2015年01月04日；

保藏登记号：cgmccno.10276。

附图说明

图1为红曲菌聚酮合酶基因pks1的pcr产物凝胶电泳图。

泳道m为dna标准分子量marker；泳道1是红曲菌聚酮合酶基因pks1中第一部分片段的pcr产物凝胶电泳结果；泳道2是红曲菌聚酮合酶基因pks1中第二部分片段的pcr产物凝胶电泳结果；泳道3是红曲菌聚酮合酶基因pks1中第三部分片段的pcr产物凝胶电泳结果。

图2为含有红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组米曲霉转化子pcr验证电泳图谱。泳道m为dna标准分子量marker；泳道1-2号分别为m1、m2号转化子的pcr的产物电泳图谱。

图3为含有红曲菌聚酮合酶基因pks1的质粒ptayagsarg3p-pks1构建策略图。

图4为各个转化子在不同诱导时间红曲菌聚酮合酶后的重组米曲霉中的据酮化合物产量。1#为空白对照菌株，为3#、6#、9#、13#、14#、15#、16#、17#、19#与21#为其他转化子。深色图例表示聚酮化合物萘三酚的含量，浅色图例表示嗜氮酮。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1红曲菌(monascusruber)聚酮合酶基因pks1的克隆

用trizol试剂按照试剂盒说明提取红色红曲菌(monascusruber)ccam070120的总rna。取5.0μg的总rna，根据说明书使用反转录试剂盒(promega公司)将总rna反转录成cdna。以该cdna为模板，用序列表中seqidno.1和seqidno.2所示核苷酸序列为上游引物和下游引物，进行pcr，扩增出序列表中seqidno.7所示的3112bp的红曲菌基因聚酮合酶基因pks1的第一部分片段(见图1)；以该cdna为模板，用序列表中seqidno.3和seqidno.4所示核苷酸序列为上游引物和下游引物，进行pcr，扩增出序列表中seqidno.8所示的2376bp的红曲菌基因聚酮合酶基因pks1的第二部分片段(见图1)；以该cdna为模板，用序列表中seqidno.5和seqidno.6所示核苷酸序列为上游引物和下游引物，进行pcr，扩增出序列表中seqidno.9所示的2585bp的红曲菌基因聚酮合酶基因pks1的第三部分片段(见图1)。

实施例2红曲菌聚酮合酶基因pks1构建至曲霉表达载体

根据说明书采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(axygen公司)回收序列表中seqidno.7、seqidno.8与seqidno.9所示的三个pcr产物，通过酶连试剂盒连接至米曲霉表达载体ptayagsarg3p，转化到大肠杆菌top10的感受态细胞中，涂布于含100μg/ml氨苄霉素(invitrogen公司)的lb平板上，37℃倒置培养12-16小时，菌落生长至直径为0.5-2mm。挑取上述平板上的单克隆子，从中提取质粒，经测序证实该质粒含有红曲菌基因聚酮合酶基因pks1序列全长。红曲菌聚酮合酶基因pks1全部序列如seqidno.10所示，共8073bp(见图2)，全长质粒命名为ptayagsarg3p-pks1。提取大肠杆菌中ptayagsarg3p-pks1质粒，即得到含有红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组载体。构建策略见图3。

实施例3含有红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组载体转化进米曲霉宿主

将米曲霉接种于50ml察氏培养基中，28℃与150rpm条件下培养24小时，然后通过离心获得菌体，重悬于5ml无菌水中，加入1.5mg的破壁酶(invitrogen公司)，在30℃条件下静止3小时。取1.0-5.0mg的ptayagsarg3p-pks1质粒，加入上述的菌体溶液中，在40℃下静止1小时。然后涂布于精氨酸缺陷型培养基平板上，在28℃下培养2-4天，28-30℃倒置培养直至重组菌出现。而后将重组菌再次在精氨酸缺陷型培养基平板上划线，分离出单菌落。

实施例4含有红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组米曲霉转化子的pcr鉴定

提取实施例3中所获得的转化子的胞内dna，以该dna为模板，用seqidno.1和seqidno.6所示核苷酸序列为上、下游引物进行pcr，以检测外源dna的插入。原始米曲霉胞内dna为模板的pcr作为阴性对照。pcr扩增条件为95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸8min，循环30次。pcr能扩增出8.1kbdna条带。对pcr产物进行核苷酸测序，结果与seqidno.10一致，说明获得了含有红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组米曲霉转化子。

实施例5诱导米曲霉转化子的红曲菌聚酮合酶pks1基因表达

(1)将经过实施例4鉴定的含有米曲霉转化子的红曲菌聚酮合酶基因pks1的重组米曲霉，转接至5ml，ph＝5.5的察氏培养基中，150转/分钟，28℃培养24小时；

(2)按1％(v/v)的接种量将上述预培养的菌液转接至50ml察氏培养基中，250转/分钟，25℃培养120小时；

(3)将步骤(2)培养的菌液收集后离心除去部分发酵上清液，然后超声破碎，再次离心取上清液，即获得红曲菌聚酮合酶pks1的产物溶液，检测代谢产物(见图4)。

步骤(2)中培养的转速也可以是150-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是25-32℃中的任意一值；培养时间也可以是24-120小时中的任意一值。

察氏培养基为3g/l蔗糖，2g/l硝酸钠，1g/l磷酸氢二钾，0.5g/l氯化钾，0.5g/l七水合硫酸镁，0.01g/l硫酸亚铁，自然ph。