本发明涉及一种依诺肝素钠生产方法，属于医药领域。
背景技术：
肝素(heparin)是一种天然的抗凝血物质，最初是由美国医学生j.mclean于1916年在测定体内血促凝血物质的效价时，意外地发现肝的提取物不仅不能促进血液凝固，反而阻止凝血，从而发现了其中含有的肝素，它是由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸组成的一类长链多糖。在各国药典中，肝素仅规定作为抗凝血药物。如今已知，肝素具有多种生物活性，可以提供广泛的临床应用。肝素除了具有抗凝活性及抗血栓活性外，近几年来还发现其具有抑制平滑肌细胞增生、抗炎症、抗肿瘤等生物活性。
肝素类产品的来源一般是从动物组织（如肝脏、小肠、肺等）中提取，它可以激活抗凝血酶，加速抗凝血酶在凝血连锁中抑制丝氨酸蛋白酶的速率，从而作为一种抗凝血的药物被广泛应用。但长期使用会产生许多负面影响，如出血和诱导血小板减少、骨质疏松等副作用。这些缺点限制了肝素在临床上的应用。因此，人们研制出了新型抗凝血药物，低分子量肝素。这类药物具有链短、结合部位少，生物利用度高，且半衰期长等优点，因而具有很好的医疗前景。
依诺肝素钠属于低分子肝素，其具有抗血栓作用强、出血危险性小、生物利用度高，体内半衰期长，副作用小等优点，是目前抗血栓、抗凝血的主要治疗药物，其市场占有率达到肝素类药物的2/3以上。
依诺肝素钠的制备方大多采用直接从肝素钠通过成盐、酯化、氧化、超滤、干燥等步骤获得。在生产过程中，起始物料肝素钠的质量对依诺肝素钠终产品有很大影响，因为，肝素钠的结构与组成复杂，不同的生物体来源、甚至相同的生物体来源而批次不同，生长环境不同都会影响其结构和组成，导致其在结构确认和质量标准控制上存在一定的不确定性，而原料对后期依诺肝素钠成品的分子量分布有直接影响，因而从起始原料开始就需要进行严格的控制，这样才能更有效保证产品质量。同时，依诺肝素钠的制备过程一般采用甲醇溶剂，此种二类溶剂毒性大环境不友好，更重要的是得到的成品经甲醇析晶后粒径很细且发腻，过滤操作困难，部分成品残留在母液之中，影响收率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种依诺肝素钠生产方法，从原始物料开始（大分子肝素钠）进行特定条件的工艺处理，并选择合适的溶剂，可以得到满足欧洲药典标准的依诺肝素钠成品，且环境污染小，收率高，并能高效完美的控制最终所得成品的分子量和效价。
具体包括以下步骤：
（1）肝素钠预处理：对肝素钠进行洗脱处理得到肝素钠精品。
（2）肝素苄索氯铵盐制备：向步骤（1）得到的肝素钠精品中加入水中溶解得到肝素钠水溶液，加入苄索氯铵水溶液，反应一段时间后进行过滤和烘干得到肝素苄索氯铵盐。
（3）肝素苄基酯制备：将步骤（2）得到的肝素苄索氯铵盐加入二氯甲烷，再加入氯化苄，反应后用乙醇搅拌沉淀，过滤洗涤干燥。
（4）肝素苄基酯降解：将步骤（3）得到的肝素苄基酯溶解于水中，加入相对于氢氧化钠水溶液进行反应，加入乙醇沉淀。
（5）脱色以及冷冻干燥：将步骤（4）得到的产物利用活性炭脱色之后，再利用双氧水脱色得到的溶液利用乙醇沉淀，分离沉淀，冷冻干燥即得成品。
肝素钠预处理的具体步骤如下：将deae改性后的微球匀浆后注入玻璃层析柱，将大分子肝素钠溶解于乙醇中，溶清后将其注入玻璃层析柱中，注入完毕后将阀门切换至流动相b，将装填好的肝素钠用流动相b进行冲洗，停止洗脱后，按洗脱要求将a、b两相调制适当比例开始冲洗层析柱，紫外检测器监测目标产物，当第一个目标产物峰出现时开始收集，至目标峰消失后停止收集，第二个目标峰弃用，将收集到的目标组分加入溶剂进行沉淀，最后将沉淀物用水溶解并经过滤膜过滤，冷冻干燥得肝素钠精品。其中，收集的目标产物中三糖和五糖序列比值在4-5之间，微球的粒径为40-60um，流动相a为20mmol/l的tristan-hcl溶液；流动相b为：流动相a组分+1mol/lnacl，肝素钠精品进一步的与苄索氯铵缩合、再与氯化苄酯化后经碱降解以及一系列水溶冻干步骤后合成依诺肝素钠成品。
几乎所有公开专利对依诺肝素钠的研究都显示其分子量会影响到成品效价，但是鲜有研究证明其对成品效价究竟会产生什么样的影响。申请人通过创造性的研究发现：依诺肝素钠的效价只是表象上和分子量具有相关性，但真正影响其效价的是其结构单元中的多糖序列排布，因为排布同时会影响到效价和分子量，所以早期人们会理所当然的认为效价和分子量相关。
依诺肝素钠的成品效价指标包括fⅹa因子、fⅱa因子及他们的比值大小，申请人通过实验分离出的多糖片段发现：fⅹa因子主要受三糖序列控制，而fⅱa因子却受五糖序列控制，因此只要控制好三糖序列和五糖序列的比率便能完美控制成品的效价。但是现有的生产技术在成品制备过程中很难控制二者的比率，原因是大分子肝素钠（起始物料）中的两种糖序列的比率及排布具有极度的不规则性（肝素钠是由不同生物体提供的，因此不具备质量均一性），导致后面的裂解过程杂乱无章，所以最终的结果就是同一个工艺却生产出差异较大的成品。为了解决这一问题，申请人将购入的起始物料（大分子肝素钠）通过特殊的工艺进行预处理，所收集到的目标产物中三糖序列和五糖序列比值在4-5之间，其它不符合要求的组分弃去。再投入合成反应中，最终所得成品的分子量及效价均可以被完美的控制。
通过控制上述工艺步骤，对原始物料进行预处理，使目标产物中三糖序列和五糖序列比值在4-5之间，能够高效完美的控制最终所得成品的分子量和效价。
同时，在依诺肝素钠的制备方法中，现有技术中通常采用的均是二类溶剂甲醇进行酯化降解和脱色后的沉淀，该类溶剂毒性大，环境不友好，更重要的是申请人通过实验发现，得到的成品经甲醇析晶后粒径很细且发腻，过滤操作困难，部分成品残留在母液之中，影响收率；利用乙醇代替甲醇作为析晶溶剂，不仅环境污染小，而且经车间放大试验，可操作性强，最主要是在乙醇中析出的中间体肝素苄基酯和成品依诺肝素钠性状和可操作性都得到改善，有限解决了难过滤的难题，减轻了环保压力，降低了临床用药风险，有助于实现项目原料药的大批量生产。
本发明首先对原料肝素钠进行预处理，之后进行相应的成盐、酯化、降解、脱色以及冷冻干燥，并在酯化降解和脱色后的沉淀步骤中利用乙醇代替现有技术的甲醇，减少了环境污染，增加了产品质量和可操作性。
具体实施方式
实例：
（1）肝素钠预处理：将deae（二乙基胺乙基纤维素）改性后的微球（40-60um）按一定比例匀浆后注入玻璃层析柱，压实后再用250l纯化水进行平衡，检测柱效，达到要求后平衡结束。将1.0kg大分子肝素钠溶解于225l乙醇中，溶清后将其注入玻璃层析柱中，注入完毕后将阀门切换至流动相b。将装填好的依诺肝素钠用流动相b进行冲洗，将乙醇洗脱干净，检测电导率至目标值后停止洗脱，耗用流动相b约150l。按洗脱要求将a、b两相调制适当比例开始冲洗层析柱，紫外检测器监测目标产物，当第一个目标产物峰出现时开始收集，至目标峰消失后停止收集，第二个目标峰弃用。
流动相a：20mmtris-hcl；流动相b:a+1mnacl；流速：20ml/min；检测波长：232nm。
将收集到的目标组分加入乙醇或甲醇沉淀，最后将沉淀物用纯化水溶解并经过滤膜过滤，冷冻干燥得肝素钠精品，与苄索氯铵缩合、再与氯化苄酯化后经碱降解以及一系列水溶冻干步骤后合成依诺肝素钠成品。
通过严格控制上述工艺步骤，对原始物料进行预处理，使目标产物中三糖序列和五糖序列比值在4-5之间，能够高效完美的控制最终所得成品的分子量和效价。
（2）肝素苄索氯铵盐制备：向步骤（1）得到的肝素钠精品中加入水中溶解得到肝素钠水溶液，加入苄索氯铵水溶液，两种溶液的体积比为：1:2-1:3，反应一段时间后进行过滤和烘干得到肝素苄索氯铵盐；
（3）肝素苄基酯制备：将步骤（2）得到的肝素苄索氯铵盐加入8-12质量倍数的二氯甲烷，加入3-5质量倍数的氯化苄，反应后用乙醇搅拌沉淀，过滤洗涤干燥；
（4）肝素苄基酯降解：将步骤（3）得到的肝素苄基酯溶解于水中，加入相对于肝素苄基酯0.1-0.15质量倍数的氢氧化钠水溶液进行反应，加入乙醇沉淀；
（5）脱色以及冷冻干燥：将步骤（4）得到的产物利用活性炭脱色之后，再利用双氧水脱色得到的溶液利用乙醇沉淀，分离沉淀，冷冻干燥即得成品。
先前的具体实施例是本发明实践的说明。在不脱离本发明范围的情况下进行的各种改进和改变对本领域普通技术人员是显而易见的，也视为本发明的保护范围。