一、技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种从萝卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法。
二、
背景技术：
萝卜又名莱菔、土人参，为十字花科萝卜属二年或一年生蔬菜作物，普遍种植于我国低海拔地区。萝卜富含其他蔬菜少有的萝卜苷及其降解产物莱菔素，且种子含油量高，是提取油脂、天然色素及其他抗氧化活性物质的好原料，深受消费者喜爱。具体地说，萝卜作为一种十字花科植物，其中普遍含有硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶(又称黑芥子酶)，含量则因品种、部位及生长阶段等的差异而不同，而在种子中的含量最高。在硫代葡萄糖苷酶的作用下，硫代葡萄糖苷水解生成的莱菔素具有抗氧化、抗菌除草、抗细胞突变等强烈的生物学活性，并且对肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前胃癌有明显的阻断作用，是一种具有市场潜力和经济价值的天然活性物质。
现有对于硫代葡萄糖苷的提取及其酶解条件的研究已不胜枚举，然而对于水解硫代葡萄糖苷生成莱菔素的关键酶——硫代葡萄糖苷酶的提取却鲜有报道。硫代葡萄糖苷酶是以蛋白复合体的形式长久存在于细胞中，是一种非常稳定的胞内酶。虽然硫代葡萄糖苷在无酶作用下也会发生降解，但其降解产物十分复杂，而在硫代葡萄糖苷酶的特异性催化作用下则可以专一性地生成莱菔素，故该酶的提取直接影响到后期制备莱菔素的效率。因此，研发一种行之有效的从萝卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法，将具有可观的社会价值和经济效益。
现有提取硫代葡萄糖苷酶的方法，如申请号为201510121728.4，名称为“辣根中黑芥子酶的提取工艺”的发明专利，公开的黑芥子酶的提取方法为：以新鲜辣根为原料，首先将其切成薄片，加入磷酸盐缓冲液打浆，然后通过水浴搅拌、纱布过滤除去滤渣、离心得到粗酶液，最后向粗酶液中加入乙醇自然沉淀过夜并离心得到黑芥子酶提取物。该方法的主要缺点是：①磷酸盐缓冲液虽然ph变化比较小，但其容易与常见的钙、镁等离子形成沉淀而降低缓冲效果，而提取的底物又是成分复杂的天然植物，故其缓冲作用会受到干扰；②在提取过程中没有加入具有保护性的试剂来维持酶的活力，则在提取过程中，酶分子可能受到外界环境变化的影响而变性，从而使提取到的酶活力发生损耗；③仅仅通过乙醇作为沉淀剂而得到酶提取物，缺少进一步的分离纯化步骤，所得产品中杂质含量较高。又如2007公开的刘月萍撰写的硕士论文《黑芥子酶提取分离、性质及固定化研究》，该论文介绍了制备黑芥子酶的工艺是：利用西兰花种子作为原料，经过tris-hcl缓冲液抽提、乙醇沉淀的提取步骤后，先用deae-sepharase离子交换柱层析纯化，再用superdextm-200凝胶过滤柱层析纯化，从而得到较纯的黑芥子酶。该方法的主要缺点是：①没有对种子中含有的大量脂质进行脱脂处理，使得提取酶的过程受到干扰，最终得到的酶活力不高；②在沉淀黑芥子酶的时候加入2倍体积的乙醇，离心分离之后却没有对乙醇进行回用，造成乙醇损失，生产成本高；③后期的两套柱层析系统操作复杂，生产周期较长，生产量小，且成本高，不适合于规模化生产和工业化应用。
三、
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有提取硫代葡萄糖苷酶方法的不足，提供一种从萝卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法，具有使用常规工业化生产设备，生产条件温和，操作方便，分离效率高，产品纯度高，硫代葡萄糖苷酶质量高等特点。
本发明的原理是：萝卜籽中含有大量的油脂，其包裹在萝卜籽粉表面将会阻碍硫代葡萄糖苷酶的提取，而萝卜籽在自然萌芽的过程中会逐渐消耗油脂以提供生长动力，故可采取使其萌芽的天然方式对萝卜籽进行脱脂处理，这样既能脱除油脂，又可避免其他脱脂方式对酶的不利影响；硫代葡萄糖苷酶是一种胞内酶，采用匀浆机在高转速下将细胞破碎的方法可使硫代葡萄糖苷酶游离出来；硫代葡萄糖苷酶是蛋白质，可溶于一定ph值的缓冲溶液中，以稳定、缓冲能力强且干扰小的tris-hcl作为缓冲溶液，可将硫代葡萄糖苷酶提取出来；甘油是一种渗透性保护剂，其亲水的羟基可以帮助酶分子稳定其必需的空间构象，从而减小酶活力的损耗；乙醇是一种能与水互溶的有机溶剂，能使水溶液的介电常数降低，增加相反电荷基团之间的吸引力，从而促进酶蛋白质分子的聚集和沉淀；壳寡糖修饰棉纤维是壳寡糖与棉纤维以共价键稳固连接的新型材料，其特点是表面修饰的壳寡糖含有大量的氨基，因而具有很强的抗菌性，同时还带有一定量的正电荷，可与硫代葡萄糖苷酶蛋白表面的负电荷产生静电吸附作用，从而将硫代葡萄糖苷酶与其他电荷性质不同的粒子分离开来；超滤是以压力为推动力的膜分离技术，基于超滤膜孔径，可实现大分子与小分子分离，硫代葡萄糖苷酶提取液中的其他杂质蛋白与硫代葡萄糖苷酶分子量不同，通过超滤即可实现两者的有效分离；由于冻干时水结冰体积增大，致使酶蛋白活性部位中一些由弱分子力连接的键遭到破坏，从而使活性损失，而蔗糖属于亲水性物质，形成氢键能力较强，能替代酶蛋白表面水分子的羟基，与蛋白质中的极性基团形成氢键，使得酶蛋白的活性部位变化不大，从而避免酶蛋白由于发生相变所造成的机械损伤；乙醇的沸点仅为78℃，而在真空条件下，其沸点更低，因此，控制体系的真空度，可在较低温度下完全蒸发该溶剂，从而制得回收乙醇。
本发明的目的是通过以下途径实现的：一种从萝卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法，以新鲜萝卜籽为原料，经过制备天然脱脂萝卜籽粉，制备tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，制备硫代葡萄糖苷酶提取液，装配固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，制备硫代葡萄糖苷酶分离液，制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液，制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉，制备回收乙醇等步骤，制备出比活力为40.35～45.65u/mg、收得率为0.4～0.6‰的硫代葡萄糖苷酶。其具体工艺步骤如下：
(1)制备天然脱脂萝卜籽粉
取新鲜萝卜籽，先用质量分数为8～12％的次氯酸钠溶液浸泡10～15min，再用无菌水漂洗3～5次，每次1～5min，然后置于铺有2层滤纸的培养皿上，放入温度为20～30℃的培养箱中恒温培养，直至萝卜籽发芽。收集发芽的萝卜籽并将芽剪除，余下的种子部分再置于30～40℃的烘箱内干燥。待其干燥后用中药粉碎机粉碎，再用80～160目的分样筛进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回粉碎机进行再次粉碎；对于过筛的萝卜籽粉，即为天然脱脂萝卜籽粉，用于第(3)步制备硫代葡萄糖苷酶提取液。
(2)制备tris-hcl-甘油缓冲保护溶液
先按照tris的质量与纯净水的体积之比为0.24∶1(kg/l)的比例，将称量好的tris在搅拌下用纯净水溶解，配制成tris浓度为为0.2mol/l的溶液，即制备出tris溶液。再按照tris的质量与浓盐酸的体积之比为1∶0.50～0.58(kg/l)的比例，将浓盐酸与制备出的tris溶液混合均匀，即制备出ph为7.4～7.6的tris-hcl缓冲溶液。再按照体积百分含量为4～6％的比例，向tris-hcl缓冲溶液中加入甘油作为提取过程中酶的保护剂，即制备出tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶提取液。
(3)制备硫代葡萄糖苷酶提取液
第(2)步完成后，按照天然脱脂萝卜籽粉的质量与tris-hcl-甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶5～6(kg/l)的比例，将天然脱脂萝卜籽粉加入到tris-hcl-甘油缓冲保护溶液中，用匀浆机在8000～12000r/min的速度下高速粉碎，对收集的粉碎分散液，置于常温下搅拌30～40min，之后用7～9层纱布过滤并收集滤液。对收集的滤液，用蠕动泵泵入管式离心机中，在10000～20000r/min的转速下离心15～25min并收集上清液。对收集的上清液，于4℃冰箱中放置2～3h，然后在搅拌下向其中缓慢加入2～3倍体积的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置2～3h，然后再次泵入管式离心机中，在10000～20000r/min的转速下离心15～25min，分别收集沉淀和上清液。对收集的上清液，用于第(9)步制备回收乙醇；对收集的沉淀，即为硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其质量与tris-hcl-甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶5～6(kg/l)的比例，将沉淀溶于tris-hcl-甘油缓冲保护溶液中，即制备出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床。
(4)装配固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床
按照专利号为201510028848.x介绍的方法制备出壳寡糖修饰棉纤维，将该壳寡糖修饰棉纤维分散于2～3倍体积的纯净水中润湿，再装填于内径为100～300mm、高度为400～800mm的自制不锈钢固定化吸附反应床中，其中壳寡糖修饰棉纤维的装填高度为300～600mm，即装配出固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床。
(5)制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床
第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步装配出的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中泵入tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，该缓冲保护溶液泵入流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的1～3倍/h(bv/h)，泵入时间为1～2h。缓冲保护溶液泵入完成后，按照装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积与第(3)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液体积之比为1∶4～6(l/l)的比例，将硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的1～2倍/h(bv/h)。泵入完成后，分别收集脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，对收集的脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制备硫代葡萄糖苷酶提取液；对收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即为富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶分离液。
(6)制备硫代葡萄糖苷酶分离液
首先制备出ph为8.0～9.0的稀na2co3溶液。再按照体积百分含量为4～6％的比例，向稀na2co3溶液中加入甘油，即制备出na2co3-甘油溶液。第(5)步完成后，对第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，泵入na2co3-甘油溶液进行洗涤，泵入的na2co3-甘油溶液的体积为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的2～4倍，泵入na2co3-甘油溶液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的2～4倍/小时。洗涤完成后，分别收集洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床和经床洗涤液。对收集的洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，即为再生固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，可用于制备下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；对收集的经床洗涤液，即为硫代葡萄糖苷酶分离液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液。
(7)制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液
第(6)步完成后，将第(6)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量为50000～100000da的超滤器中，在表压为0.2～0.5mpa下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与第一次超滤滤过液体积之比(l/l)为1∶7～9时止。分别收集第一次超滤滤过液和第一次超滤截留液，对收集的第一次超滤截留液，主要含大分子的多糖，可用于制备萝卜籽多糖；对收集的第一次超滤滤过液，用纯净水稀释至原体积，再次泵入截留分子量为10000～20000da的超滤器中进行第二次超滤，第二次超滤的表压及停止第二次超滤时第二次超滤截留液与第二次超滤滤过液体积之比均与第一次超滤相同。第二次超滤完成后，分别收集第二次超滤滤过液和第二次超滤截留液。对收集的第二次超滤滤过液，可用于稀释下批次的第一次超滤滤过液；对收集的第二次超滤截留液，即为出硫代葡萄糖苷酶浓缩液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉。
(8)制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉
第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的体积与硫代葡萄糖苷酶浓缩液体积之比为1∶20～25(l/l)的比例，向第(7)步制备的硫代葡萄糖苷酶浓缩液中加入浓度为80～120mmol/l的蔗糖溶液作为冷冻干燥保护剂。然后置于-40～-20℃冰箱中预冻8～12h，再取出放置于真空冷冻干燥机中，在真空度为30～50pa、温度为-50～-40℃的条件下冷冻干燥24～36h，即制备出硫代葡萄糖苷酶冻干粉，其比活力为40.35～45.65u/mg、收得率为0.4～0.6‰。
(9)制备回收乙醇
第(3)步完成后，将第(3)步第二次离心收集的上清液泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为30～45℃、真空度为0.1～3kpa的条件下回收乙醇，直至无乙醇味时止，即制备出回收乙醇，可用于再次配制乙醇体积百分浓度为95％的水溶液。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下优点：
1、本发明方法以新鲜萝卜籽为原料，制备出比活力为40.35～45.65u/mg、收得率为0.4～0.6‰的硫代葡萄糖苷酶，产品质量符合市场要求；所用生产设备均为工业化设备，生产条件易实施，操作方便，适合规模化生产。
2、本发明方法采用萝卜籽自然萌芽的方式对其进行脱脂处理，相比于传统的有机溶剂萃取法，具有操作方便，条件温和，无毒害作用的特点，且更有利于保持酶的稳定。
3、本发明在提取过程中加入了甘油作为保护剂，在制备冻干粉时又加入了蔗糖溶液作为保护剂，最大限度地稳定了酶蛋白分子的构象，保持了酶的活力。
4、本发明方法以壳寡糖修饰棉纤维这一具有抗菌性质的新型材料为载体，利用静电作用对硫代葡萄糖苷酶进行吸附，并装配出固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，有效分离出了高活力的硫代葡萄糖苷酶。
5、本发明方法用超滤膜分离技术对提取液进行浓缩，使用溶剂低温回收真空系统回收乙醇，能耗和乙醇损耗均低，显著降低了生产成本。
6、本发明生产的产品硫代葡萄糖苷酶冻干粉可广泛应用于固定化酶及制备莱菔素等领域中。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
(1)制备天然脱脂萝卜籽粉
取新鲜萝卜籽，先用质量分数为8％的次氯酸钠溶液浸泡10min，再用无菌水漂洗3次，每次1min，然后置于铺有2层滤纸的培养皿上，放入温度为20℃的培养箱中恒温培养，直至萝卜籽发芽。收集发芽的萝卜籽并将芽剪除，余下的种子部分再置于30℃的烘箱内干燥。待其干燥后用中药粉碎机粉碎，再用80目的分样筛进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回粉碎机进行再次粉碎；对于过筛的萝卜籽粉，即为天然脱脂萝卜籽粉，用于第(3)步制备硫代葡萄糖苷酶提取液。
(2)制备tris-hcl-甘油缓冲保护溶液
先按照tris的质量与纯净水的体积之比为0.24∶1(kg/l)的比例，将称量好的tris在搅拌下用纯净水溶解，配制成tris浓度为为0.2mol/l的溶液，即制备出tris溶液。再按照tris的质量与浓盐酸的体积之比为1∶0.50(kg/l)的比例，将浓盐酸与制备出的tris溶液混合均匀，即制备出ph为7.6的tris-hcl缓冲溶液。再按照体积百分含量为4％的比例，向tris-hcl缓冲溶液中加入甘油作为提取过程中酶的保护剂，即制备出tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶提取液。
(3)制备硫代葡萄糖苷酶提取液
第(2)步完成后，按照天然脱脂萝卜籽粉的质量与tris-hcl-甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶5(kg/l)的比例，将天然脱脂萝卜籽粉加入到tris-hcl-甘油缓冲保护溶液中，用匀浆机在8000r/min的速度下高速粉碎，对收集的粉碎分散液，置于常温下搅拌30min，之后用7层纱布过滤并收集滤液。对收集的滤液，用蠕动泵泵入管式离心机中，在10000r/min的转速下离心15min并收集上清液。对收集的上清液，于4℃冰箱中放置2h，然后在搅拌下向其中缓慢加入2倍体积的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置2h，然后再次泵入管式离心机中，在10000r/min的转速下离心15min，分别收集沉淀和上清液。对收集的上清液，用于第(9)步制备回收乙醇；对收集的沉淀，即为硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其质量与tris-hcl-甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶5(kg/l)的比例，将沉淀溶于tris-hcl-甘油缓冲保护溶液中，即制备出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床。
(4)装配固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床
按照专利号为201510028848.x介绍的方法制备出壳寡糖修饰棉纤维，将该壳寡糖修饰棉纤维分散于2倍体积的纯净水中润湿，再装填于内径为100mm、高度为400mm的自制不锈钢固定化吸附反应床中，其中壳寡糖修饰棉纤维的装填高度为300mm，即装配出固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床。
(5)制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床
第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步装配出的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中泵入tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，该缓冲保护溶液泵入流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的1倍/h(bv/h)，泵入时间为1h。缓冲保护溶液泵入完成后，按照装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积与第(3)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液体积之比为1∶4(l/l)的比例，将硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的1倍/h(bv/h)。泵入完成后，分别收集脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，对收集的脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制备硫代葡萄糖苷酶提取液；对收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即为富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶分离液。
(6)制备硫代葡萄糖苷酶分离液
首先制备出ph为8.0的稀na2co3溶液。再按照体积百分含量为4％的比例，向稀na2co3溶液中加入甘油，即制备出na2co3-甘油溶液。第(5)步完成后，对第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，泵入na2co3-甘油溶液进行洗涤，泵入的na2co3-甘油溶液的体积为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的2倍，泵入na2co3-甘油溶液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的2倍/h。洗涤完成后，分别收集洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床和经床洗涤液。对收集的洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，即为再生固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，可用于制备下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；对收集的经床洗涤液，即为硫代葡萄糖苷酶分离液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液。
(7)制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液
第(6)步完成后，将第(6)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量为50000da的超滤器中，在表压为0.2mpa下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与第一次超滤滤过液体积之比(l/l)为1∶7时止。分别收集第一次超滤滤过液和第一次超滤截留液，对收集的第一次超滤截留液，主要含大分子的多糖，可用于制备萝卜籽多糖；对收集的第一次超滤滤过液，用纯净水稀释至原体积，再次泵入截留分子量为10000da的超滤器中进行第二次超滤，第二次超滤的表压及停止第二次超滤时第二次超滤截留液与第二次超滤滤过液体积之比均与第一次超滤相同。第二次超滤完成后，分别收集第二次超滤滤过液和第二次超滤截留液。对收集的第二次超滤滤过液，可用于稀释下批次的第一次超滤滤过液；对收集的第二次超滤截留液，即为出硫代葡萄糖苷酶浓缩液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉。
(8)制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉
第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的体积与硫代葡萄糖苷酶浓缩液体积之比为1∶20(l/l)的比例，向第(7)步制备的硫代葡萄糖苷酶浓缩液中加入浓度为80mmol/l的蔗糖溶液作为冷冻干燥保护剂。然后置于-40℃冰箱中预冻8h，再取出放置于真空冷冻干燥机中，在真空度为30pa、温度为-50℃的条件下冷冻干燥24h，即制备出硫代葡萄糖苷酶冻干粉，其比活力为40.35u/mg、收得率为0.4‰。
(9)制备回收乙醇
第(3)步完成后，将第(3)步第二次离心收集的上清液泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为30℃、真空度为0.1kpa的条件下回收乙醇，直至无乙醇味时止，即制备出回收乙醇，可用于再次配制乙醇体积百分浓度为95％的水溶液。
实施例2
(1)制备天然脱脂萝卜籽粉
取新鲜萝卜籽，先用质量分数为10％的次氯酸钠溶液浸泡12min，再用无菌水漂洗4次，每次3min，然后置于铺有2层滤纸的培养皿上，放入温度为25℃的培养箱中恒温培养，直至萝卜籽发芽。收集发芽的萝卜籽并将芽剪除，余下的种子部分再置于35℃的烘箱内干燥。待其干燥后用中药粉碎机粉碎，再用120目的分样筛进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回粉碎机进行再次粉碎；对于过筛的萝卜籽粉，即为天然脱脂萝卜籽粉，用于第(3)步制备硫代葡萄糖苷酶提取液。
(2)制备tris-hcl-甘油缓冲保护溶液
先按照tris的质量与纯净水的体积之比为0.24∶1(kg/l)的比例，将称量好的tris在搅拌下用纯净水溶解，配制成tris浓度为为0.2mol/l的溶液，即制备出tris溶液。再按照tris的质量与浓盐酸的体积之比为1∶0.54(kg/l)的比例，将浓盐酸与制备出的tris溶液混合均匀，即制备出ph为7.5的tris-hcl缓冲溶液。再按照体积百分含量为5％的比例，向tris-hcl缓冲溶液中加入甘油作为提取过程中酶的保护剂，即制备出tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶提取液。
(3)制备硫代葡萄糖苷酶提取液
第(2)步完成后，按照天然脱脂萝卜籽粉的质量与tris-hcl-甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶5.5(kg/l)的比例，将天然脱脂萝卜籽粉加入到tris-hcl-甘油缓冲保护溶液中，用匀浆机在10000r/min的速度下高速粉碎，对收集的粉碎分散液，置于常温下搅拌35min，之后用8层纱布过滤并收集滤液。对收集的滤液，用蠕动泵泵入管式离心机中，在15000r/min的转速下离心20min并收集上清液。对收集的上清液，于4℃冰箱中放置2.5h，然后在搅拌下向其中缓慢加入2.5倍体积的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置2.5h，然后再次泵入管式离心机中，在15000r/min的转速下离心20min，分别收集沉淀和上清液。对收集的上清液，用于第(9)步制备回收乙醇；对收集的沉淀，即为硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其质量与tris-hcl-甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶5.5(kg/l)的比例，将沉淀溶于tris-hcl-甘油缓冲保护溶液中，即制备出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床。
(4)装配固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床
按照专利号为201510028848.x介绍的方法制备出壳寡糖修饰棉纤维，将该壳寡糖修饰棉纤维分散于2.5倍体积的纯净水中润湿，再装填于内径为200mm、高度为600mm的自制不锈钢固定化吸附反应床中，其中壳寡糖修饰棉纤维的装填高度为450mm，即装配出固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床。
(5)制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床
第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步装配出的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中泵入tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，该缓冲保护溶液泵入流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的2倍/h(bv/h)，泵入时间为1.5h。缓冲保护溶液泵入完成后，按照装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积与第(3)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液体积之比为1∶5(l/l)的比例，将硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的1.5倍/h(bv/h)。泵入完成后，分别收集脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，对收集的脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制备硫代葡萄糖苷酶提取液；对收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即为富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶分离液。
(6)制备硫代葡萄糖苷酶分离液
首先制备出ph为8.5的稀na2co3溶液。再按照体积百分含量为5％的比例，向稀na2co3溶液中加入甘油，即制备出na2co3-甘油溶液。第(5)步完成后，对第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，泵入na2co3-甘油溶液进行洗涤，泵入的na2co3-甘油溶液的体积为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的3倍，泵入na2co3-甘油溶液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的3倍/h。洗涤完成后，分别收集洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床和经床洗涤液。对收集的洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，即为再生固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，可用于制备下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；对收集的经床洗涤液，即为硫代葡萄糖苷酶分离液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液。
(7)制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液
第(6)步完成后，将第(6)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量为80000da的超滤器中，在表压为0.45mpa下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与第一次超滤滤过液体积之比(l/l)为1∶8时止。分别收集第一次超滤滤过液和第一次超滤截留液，对收集的第一次超滤截留液，主要含大分子的多糖，可用于制备萝卜籽多糖；对收集的第一次超滤滤过液，用纯净水稀释至原体积，再次泵入截留分子量为20000da的超滤器中进行第二次超滤，第二次超滤的表压及停止第二次超滤时第二次超滤截留液与第二次超滤滤过液体积之比均与第一次超滤相同。第二次超滤完成后，分别收集第二次超滤滤过液和第二次超滤截留液。对收集的第二次超滤滤过液，可用于稀释下批次的第一次超滤滤过液；对收集的第二次超滤截留液，即为出硫代葡萄糖苷酶浓缩液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉。
(8)制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉
第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的体积与硫代葡萄糖苷酶浓缩液体积之比为1∶22(l/l)的比例，向第(7)步制备的硫代葡萄糖苷酶浓缩液中加入浓度为100mmol/l的蔗糖溶液作为冷冻干燥保护剂。然后置于-30℃冰箱中预冻10h，再取出放置于真空冷冻干燥机中，在真空度为40pa、温度为-45℃的条件下冷冻干燥30h，即制备出硫代葡萄糖苷酶冻干粉，其比活力为43.21u/mg、收得率为0.5‰。
(9)制备回收乙醇
第(3)步完成后，将第(3)步第二次离心收集的上清液泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为38℃、真空度为1.5kpa的条件下回收乙醇，直至无乙醇味时止，即制备出回收乙醇，可用于再次配制乙醇体积百分浓度为95％的水溶液。
实施例3
(1)制备天然脱脂萝卜籽粉
取新鲜萝卜籽，先用质量分数为12％的次氯酸钠溶液浸泡15min，再用无菌水漂洗5次，每次5min，然后置于铺有2层滤纸的培养皿上，放入温度为30℃的培养箱中恒温培养，直至萝卜籽发芽。收集发芽的萝卜籽并将芽剪除，余下的种子部分再置于40℃的烘箱内干燥。待其干燥后用中药粉碎机粉碎，再用160目的分样筛进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回粉碎机进行再次粉碎；对于过筛的萝卜籽粉，即为天然脱脂萝卜籽粉，用于第(3)步制备硫代葡萄糖苷酶提取液。
(2)制备tris-hcl-甘油缓冲保护溶液
先按照tris的质量与纯净水的体积之比为0.24∶1(kg/l)的比例，将称量好的tris在搅拌下用纯净水溶解，配制成tris浓度为为0.2mol/l的溶液，即制备出tris溶液。再按照tris的质量与浓盐酸的体积之比为1∶0.58(kg/l)的比例，将浓盐酸与制备出的tris溶液混合均匀，即制备出ph为7.4的tris-hcl缓冲溶液。再按照体积百分含量为6％的比例，向tris-hcl缓冲溶液中加入甘油作为提取过程中酶的保护剂，即制备出tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶提取液。
(3)制备硫代葡萄糖苷酶提取液
第(2)步完成后，按照天然脱脂萝卜籽粉的质量与tris-hcl-甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶6(kg/l)的比例，将天然脱脂萝卜籽粉加入到tris-hcl-甘油缓冲保护溶液中，用匀浆机在12000r/min的速度下高速粉碎，对收集的粉碎分散液，置于常温下搅拌40min，之后用9层纱布过滤并收集滤液。对收集的滤液，用蠕动泵泵入管式离心机中，在20000r/min的转速下离心25min并收集上清液。对收集的上清液，于4℃冰箱中放置3h，然后在搅拌下向其中缓慢加入3倍体积的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置3h，然后再次泵入管式离心机中，在20000r/min的转速下离心25min，分别收集沉淀和上清液。对收集的上清液，用于第(9)步制备回收乙醇；对收集的沉淀，即为硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其质量与tris-hcl-甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶6(kg/l)的比例，将沉淀溶于tris-hcl-甘油缓冲保护溶液中，即制备出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床。
(4)装配固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床
按照专利号为201510028848.x介绍的方法制备出壳寡糖修饰棉纤维，将该壳寡糖修饰棉纤维分散于3倍体积的纯净水中润湿，再装填于内径为300mm、高度为800mm的自制不锈钢固定化吸附反应床中，其中壳寡糖修饰棉纤维的装填高度为600mm，即装配出固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床。
(5)制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床
第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步装配出的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中泵入tris-hcl-甘油缓冲保护溶液，该缓冲保护溶液泵入流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的3倍/h(bv/h)，泵入时间为2h。缓冲保护溶液泵入完成后，按照装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积与第(3)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液体积之比为1∶6(l/l)的比例，将硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的2倍/h(bv/h)。泵入完成后，分别收集脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，对收集的脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制备硫代葡萄糖苷酶提取液；对收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即为富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶分离液。
(6)制备硫代葡萄糖苷酶分离液
首先制备出ph为9.0的稀na2co3溶液。再按照体积百分含量为6％的比例，向稀na2co3溶液中加入甘油，即制备出na2co3-甘油溶液。第(5)步完成后，对第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，泵入na2co3-甘油溶液进行洗涤，泵入的na2co3-甘油溶液的体积为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的4倍，泵入na2co3-甘油溶液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的4倍/小时。洗涤完成后，分别收集洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床和经床洗涤液。对收集的洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，即为再生固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，可用于制备下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；对收集的经床洗涤液，即为硫代葡萄糖苷酶分离液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液。
(7)制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液
第(6)步完成后，将第(6)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量为100000da的超滤器中，在表压为0.5mpa下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与第一次超滤滤过液体积之比(l/l)为1∶9时止。分别收集第一次超滤滤过液和第一次超滤截留液，对收集的第一次超滤截留液，主要含大分子的多糖，可用于制备萝卜籽多糖；对收集的第一次超滤滤过液，用纯净水稀释至原体积，再次泵入截留分子量为20000da的超滤器中进行第二次超滤，第二次超滤的表压及停止第二次超滤时第二次超滤截留液与第二次超滤滤过液体积之比均与第一次超滤相同。第二次超滤完成后，分别收集第二次超滤滤过液和第二次超滤截留液。对收集的第二次超滤滤过液，可用于稀释下批次的第一次超滤滤过液；对收集的第二次超滤截留液，即为出硫代葡萄糖苷酶浓缩液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉。
(8)制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉
第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的体积与硫代葡萄糖苷酶浓缩液体积之比为1∶25(l/l)的比例，向第(7)步制备的硫代葡萄糖苷酶浓缩液中加入浓度为120mmol/l的蔗糖溶液作为冷冻干燥保护剂。然后置于-20℃冰箱中预冻12h，再取出放置于真空冷冻干燥机中，在真空度为50pa、温度为-40℃的条件下冷冻干燥36h，即制备出硫代葡萄糖苷酶冻干粉，其比活力为45.65u/mg、收得率为0.6‰。
(9)制备回收乙醇
第(3)步完成后，将第(3)步第二次离心收集的上清液泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为45℃、真空度为3kpa的条件下回收乙醇，直至无乙醇味时止，即制备出回收乙醇，可用于再次配制乙醇体积百分浓度为95％的水溶液。