高效复合沼气发酵催化剂的制作方法

本发明涉及沼气发酵领域，特别涉及一种高效复合沼气发酵催化剂。

背景技术：

沼气发酵是以各种有机质为原料，通过微生物的一系列复杂发酵作用最终生成沼气的过程。

沼气厌氧发酵过程是一个由多种微生物结合、交替相互作用的复杂生化反应过程，产甲烷菌和不产甲烷菌之间相互制约，又相互依赖。

沼气发酵过程具有以下三个阶段：

第一阶段

液化阶段，微生物（纤维素分解菌、蛋白质水解菌等）通过胞外酶的作用使固体有机物质转化成可溶性的有机物质。

第二阶段

产酸阶段，可溶性物质在胞内酶的作用下继续分解转化成低分子物质，如甲醇、乙醇、甲酸、乙酸等，同时部分释放出氢和二氧化碳。在第二阶段中，主要产物是乙酸，占70%以上。

第三阶段

产甲烷阶段，在这个阶段中严格厌氧的产甲烷细菌把产酸阶段的小分子化合物通过一步或几步的还原作用，最终形成甲烷和二氧化碳，得到沼气。

为了提高沼气原料的降解效率和沼气产量，目前主要是通过添加辅助剂，通过提高各阶段微生物的产酶、分解转换效率，以达到提高沼气原料的降解效率和沼气产量的目的。然而，这些方案仅针对沼气发酵的第一阶段、第二阶段，即，提高对发酵原料的利用效率，如此虽能促进产酸，对产甲烷菌提供充足原料，但没有提高产甲烷菌对这些产酸阶段生成的小分子化合物的转化利用效率，也没有针对三个主要阶段的总体协同促进措施方案。因此，目前沼气发酵技术仍然具有进一步提升的空间。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高效复合沼气发酵催化剂，发酵催化剂中的复合菌剂产生沼气发酵对应阶段的酶，包括纤维素酶和淀粉酶，这些酶通过酶激活剂提高酶活性，有效提高沼气池中各原料的分解利用效率，复合菌剂中的酵母菌和醋酸菌增加重要中间代谢产物乙酸的积累，发酵催化剂中的还原性盐降低产沼气体系氧化还原电位、减少溶解氧，对产甲烷菌提供严格厌氧环境条件，利于产甲烷菌高效产甲烷，有效提高沼气池的沼气产量。

本发明的技术方案是：一种高效复合沼气发酵催化剂，包括复合菌剂，以及添加在复合菌剂中的酶激活剂、还原性盐，

所述复合菌剂由低温产纤维素酶菌液、常温产纤维素酶菌液、常温产淀粉酶菌液、常温醋酸菌液、常温酵母菌液按体积比1-1.5：1：1：1：1混合制得，各菌液的菌体浓度均为1x10⁹cfu/ml；

添加在复合菌剂中的所述酶激活剂包括纤维素酶激活剂、产甲烷相关酶激活剂，所述纤维素酶激活剂由硝酸钾、氯化锌、硝酸钙组成，所述产甲烷相关酶激活剂由氯化锰、硝酸钴、硫酸镍组成；

所述还原性盐由硫酸亚铁、亚硫酸钠、硝酸铵、硫化钠组成。

所述低温产纤维素酶菌为假单孢菌。

所述常温产纤维素酶菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种。

所述常温产淀粉酶菌为枯草芽胞杆菌。

所述常温醋酸菌为巴氏醋杆菌。

所述常温酵母菌为酿酒酵母。

所述硝酸钾、氯化锌、硝酸钙的浓度均为30-60mg/ml。

所述氯化锰、硝酸钴、硫酸镍的浓度均为30-60mg/ml。

所述硫酸亚铁、亚硫酸钠、硝酸铵、硫化钠的浓度均为30-60mg/ml。

所述复合菌剂中添加有0.12-0.15wt%的吐温。

产甲烷菌是专性严格厌氧菌，对氧化还原电位的要求苛刻，最适氧化还原电位为-400~-500mv，尤其在培养初期，氧化还原电位甚至不能高于-330mv。沼气池在加料过程中不可避免会带入空气，使液体原料中溶解氧，不利于产甲烷菌产甲烷。

本发明高效复合沼气发酵催化剂中复合菌剂的低温产纤维素酶菌在低温环境下产纤维素酶，分解原料中的纤维素为可溶性有机物质（糖类），常温产纤维素酶菌、常温产淀粉酶菌分别在常温环境下产纤维素酶、淀粉酶，对应分解原料中的纤维素、淀粉为可溶性有机物质（糖类），使沼气发酵原料在低温、常温条件下均能快速分解成可溶性有机物质，形成产乙酸、乙醇的底物。复合菌剂中常温酵母菌和常温醋酸菌将可溶性有机物质（糖类）进一步转化乙酸，生成产甲烷的重要中间代谢产物，通过添加纤维素酶激活剂，提高纤维素的酶活性，促进纤维素的分解速率，通过添加产甲烷相关酶激活剂，提高这些相关酶的酶活性，提高产甲烷菌对乙酸的利用效率，提高甲烷的产气速率和产气量。本发明高效复合沼气发酵催化剂通过添加还原性盐硫酸亚铁、亚硫酸钠、硝酸铵、硫化钠，降低产沼气体系氧化还原电位、减少溶解氧，为发酵体系提供严格的厌氧环境条件，为产甲烷菌的生长创造适宜的氧化还原电位条件，利于产甲烷细菌生长繁殖。随着氧化还原电位的降低，各种微生物的活性随之发生改变，首先表现为氮呼吸，产生氨氮、亚硝酸盐；氧化还原电位继续降低，表现为铁锰呼吸，三价铁逐渐被还原成二价铁，这个过程耗氧产酸，发酵环境的ph下降；氧化还原电位继续降低，表现为硫呼吸，原本存在的硫酸根被还原成硫化氢，硫化氢与二价铁（亚铁离子）反应，产生黑臭现象；最后发酵环境在极度缺氧情况下，产甲烷菌分解有机质产生甲烷，实现高效产甲烷、有效提高沼气池沼气产量的目的。

复合菌剂中添加有0.12-0.15wt%的吐温，用于提高酶激活剂、还原性盐和菌的均匀分布度。

附图说明

图1为实施例1发酵期间产气量曲线图；

图2为实施例2发酵期间产气量曲线图。

具体实施方式

本发明中，硝酸钾、氯化锌、硝酸钙、氯化锰、硝酸钴、硫酸镍、硫酸亚铁、亚硫酸钠、硝酸铵、硫化钠、吐温均购自重庆韵博科技有限公司，均为化学纯度。

本发明中，各菌种的来源为：

假单胞菌（pseudomonadaceae）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc10441。

枯草芽孢杆菌枯草亚种（bacillussubtilissubspecies）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc10832。

巴氏醋杆菌（acetobacterpasteurianus）购自广东省微生物菌种保藏中心，菌株编号：gim1.67。

酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：cicc1049。

枯草芽胞杆菌（bacillussubtilis）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc10066。

实施例1：

试验组：

取购买的假单胞菌菌种，在牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml蒸馏水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g琼脂）中培养60-72h，培养温度28℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml；

取购买的枯草芽孢杆菌枯草亚种，在牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml蒸馏水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g琼脂）中培养60-72h，培养温度28℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml；

取购买的巴氏醋杆菌，在ypd培养基（1000ml蒸馏水中添加100g葡萄糖、10g酵母膏、20gcaco3、15g琼脂，调节ph至6.8）的中培养80h，培养温度28℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml；

取购买的酿酒酵母，在5bé麦芽汁琼脂培养基（1.0l5bé麦芽汁中添加15.0g琼脂，自然ph）中培养75h，培养温度为28-30℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml；

取购买的枯草芽胞杆菌，在牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml蒸馏水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g琼脂）中培养60h，培养温度为37℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml。

取制备好的各菌液，按体积比1.5：1：1：1：1混合制得复合菌剂。

取制得的复合菌剂3ml，添加硝酸钾150mg、氯化锌150mg、硝酸钙150mg、氯化锰150mg、硝酸钴150mg、硫酸镍150mg、硫酸亚铁150mg、亚硫酸钠150mg、硝酸铵150mg、硫化钠150mg、吐温3.9mg，混匀，制得高效复合沼气发酵催化剂。

取新鲜禽畜屠宰场的废水260ml，调节废水中固体物质含量（ts）至10%，作为发酵原料。

在恒温厌氧沼气发酵装置中，加入发酵原料260ml、3ml高效复合沼气发酵催化剂，30℃中温发酵。

设3个平行，每2天定时记录产沼气气量，并取样留存，最后将所有取样混合，测沼气中甲烷（ch4）含量。

对照组：

取新鲜禽畜屠宰场的废水260ml，调节废水中固体物质含量（ts）至10%，作为发酵原料。

在恒温厌氧沼气发酵装置中，加入发酵原料260ml，30℃中温发酵。

设3个平行，每2天定时记录产沼气气量，并取样留存，最后将所有取样混合，测沼气中甲烷（ch4）含量。

结果：

试验组、对照组的产气量如图1所示，试验组产气中平均甲烷（ch4）含量为53.8%，发酵期间共产气39.2ml，对照组产气中平均甲烷（ch4）含量为50.15%，发酵期间共产气27.64ml。

实施例2：

试验组：

取购买的假单胞菌菌种，在牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml蒸馏水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g琼脂）中培养60-72h，培养温度28℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml；

取购买的枯草芽孢杆菌枯草亚种，在牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml蒸馏水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g琼脂）中培养60-72h，培养温度28℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml；

取购买的巴氏醋杆菌，在ypd培养基（1000ml蒸馏水中添加100g葡萄糖、10g酵母膏、20gcaco3、15g琼脂，调节ph至6.8）的中培养80h，培养温度28度，至浓度为1x10⁹cfu/ml；

取购买的酿酒酵母，在5bé麦芽汁琼脂培养基（1.0l5bé麦芽汁中添加15.0g琼脂，自然ph）中培养75h，培养温度为28-30℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml；

取购买的枯草芽胞杆菌，在牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml蒸馏水中添加5.0g蛋白胨、3.0g牛肉浸取物、5.0gnacl、15.0g琼脂）中培养60h，培养温度为37℃，至浓度为1x10⁹cfu/ml。

取制备好的各菌液，按体积比1.5：1：1：1：1混合制得复合菌剂。

取15l复合菌剂，添加硝酸钾750g、氯化锌750g、硝酸钙750g、氯化锰750g、硝酸钴750g、硫酸镍750g、硫酸亚铁750g、亚硫酸钠750g、硝酸铵750g、硫化钠750g、吐温19.5g，混匀，制得高效复合沼气发酵催化剂。

取新鲜禽畜屠宰场的废水1000l，调节废水中固体物质含量（ts）至8%，作为发酵原料。

在大型发酵池中加入发酵原料1000l、15l高效复合沼气发酵催化剂，常温发酵。

每2天定时记录产沼气气量，并取样留存，最后将所有取样混合，测沼气中甲烷（ch4）含量。

对照组：

取新鲜禽畜屠宰场的废水1000l，调节废水中固体物质含量（ts）至8%，作为发酵原料。

在大型发酵池中加入发酵原料1000l，常温发酵。

每2天定时记录产沼气气量，并取样留存，最后将所有取样混合，测沼气中甲烷（ch4）含量。

结果

试验组、对照组的产气量如图2所示，试验组产气中平均甲烷（ch4）含量54.3%，发酵期间共产气197.55l，对照组产气中平均甲烷（ch4）含量50.35%，发酵期间共产气140.6l。

结论：

由实施例1、实施例2的结果可知，通过在发酵原料中添加本发明高效复合沼气发酵催化剂，相对于对照组，试验组在整个发酵期间产气量远大于对照组产气量，证明本发明高效复合沼气发酵催化剂能有效提高大分子物质的降解效率和产甲烷菌对乙酸的利用效率，提高甲烷的产气速率和产气量。而且相对于对照组，试验组沼气中甲烷（ch4）含量更高，证明本发明高效复合沼气发酵催化剂能产生更适宜的氧化还原电位条件，利于产甲烷菌生长代谢。