一种角蛋白降解菌的发酵罐发酵工艺及其在生猪脱毛中的应用的制作方法

本发明涉及一种角蛋白降解菌的发酵罐发酵工艺及其在生猪脱毛中的应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术：

猪肉皮中蛋白质含量达26.4％，加工利用价值很高(孙卫清，刘阳，肉类工艺，2004,12：24-27.)，但猪皮多毛且难以脱除，尤其猪头和猪脚毛难以脱尽，严重限制了猪皮食品的加工。据统计，除少部分猪皮用于皮革加工外，应用于食品工业的极少，近60％的猪皮资源未得到有效利用(刘冬敏等，湖南农业科学，2015(7)：56-59.)。传统蹄类脱毛采用火燎法、碱烫法、机械刮擦法、或利用松香甘油酯进行拔毛处理。上述方法不仅破坏皮组织，影响产品风味，还会产生大量的硫化物、毛蛋白质降解物和油脂，残留大量致癌物质，严重污染环境，影响消费者的健康，此外脱毛废水还会污染周围环境。并且，由于蹄类毛孔细小，这些方法很难脱净根毛，尤其蹄甲部分，造成毛根残留，严重影响产品的口感和风味。酶法脱毛通过酶制剂的作用破坏动物毛与皮之间的连接作用，使毛与皮分离，是一种清洁化脱毛技术。利用酶法对猪肉皮脱毛来代替传统的松香甘油酯等化学试剂脱毛及其他的传统脱毛法，既能保持产品干净无毛、外观整洁、品相完整，又可降低工业排污，保护环境，具有广阔的应用潜力和市场前景。目前食品业酶法脱毛中最常用的酶制剂是蛋白酶(张红见等，食品研究与开发，2010,31(8)：167-169.)，或是蛋白酶与其他脂肪酶、α-淀粉酶混合而成的复合酶制剂(王学川等，中国皮革，2012,41(13)：49-55.)。

角蛋白酶能高效降解普通蛋白酶难以降解的角蛋白，包括富含角蛋白的羽毛、羊毛、蹄甲、毛发(guptaandramnani,applmicrobiolbiotechnol.2006,70:21-33.)，因此在酶法脱毛中，角蛋白酶就成为了比普通蛋白酶更有优势的替代品。没有胶原酶活性、有微弱弹性蛋白酶活性的角蛋白酶可用于动物皮的脱毛，这些酶松弛角蛋白组织，不破坏皮革的弹性而拔出完整毛皮。酶法脱毛工业生产的关键是选育产酶能力强、酶活高的脱毛用微生物菌株，并在选育的基础上优化发酵条件，使其发酵周期缩短、产酶量进一步提高，这样才能提高酶制剂的产量，降低用酶成本；同时，目前食品业中利用角蛋白酶进行脱毛的研究还很初步，在该行业生产实际应用中，酶法脱毛的技术与工艺还亟需探索和优化。

技术实现要素：

发明人2016年从家禽屠宰场长期堆放羽毛废弃物的沼渣中筛选到一株枯草芽孢杆菌bacillussubtilisfj-3-16，该菌于2016年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号cgmccno.12086。该菌株在畜禽废弃物降解、生物脱毛方面有潜在应用价值(专利cn201610289198.9)，胞外角蛋白酶kerfj作为该菌分泌到胞外的主要蛋白酶，能够单独作用于驴皮、羊皮的酶法脱毛，脱毛效果显著(专利cn201610289190.2)。

发明人针对巴马香猪的猪蹄、猪皮和猪头利用本发明的发酵液进行了酶法脱毛实验，本发明发酵液即为b.subtilisfj-3-16发酵液。研究表明，b.subtilisfj-3-16在巴马香猪为代表的难脱毛生猪的脱毛应用中具有极好的应用前景。

广西巴马香猪肉味鲜甘香，是猪肉中的上品(莫玉萍等，猪业科学，2011,10：116-118.)。巴马香猪可制成多种不同样式的优质加工食品，市场前景广阔，带来了巨大经济效益(舒黎辉，邢君，畜禽业，2015,9：51-51.)。与普通肉食猪相比，巴马香猪的猪头、猪蹄和部分猪皮部位皮厚毛长、毛根浓密、脱毛困难。

菌株b.subtilisfj-3-1650l发酵罐发酵所用的发酵培养基(按质量百分数计)为：

玉米粉1.40-1.45％、豆粉3.60-3.65％、酪素1.8-2.1％、cacl20.13-0.18％、k2hpo40.2-0.4％、kh2po40.08-0.14％，水补足，naoh调ph为8.0。

进一步的，发酵培养基(按质量百分数计)优选为：

玉米粉1.41％、豆粉3.62％、酪素2％、cacl20.16％、k2hpo40.3％、kh2po40.1％，水补足，naoh调ph为8.0。

菌株b.subtilisfj-3-16利用上述发酵培养基进行50l发酵罐发酵的工艺，具体步骤如下：

(1)斜面培养

采用划线法将b.subtilisfj-3-16接种到lb固体斜面培养基上，30℃培养24h得到复壮菌体；

lb固体斜面培养基(按质量百分数计)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、nacl1％、琼脂粉1.5％，水补足，naoh调ph为7.5。

(2)种子培养

将步骤(1)中的复壮菌体接种到lb液体种子培养基中，30℃，200rpm培养18h，得到发酵种子；

lb液体培养基(按质量百分数计)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、nacl1％，水补足，naoh调ph为7.5。

(3)50l发酵罐发酵

将步骤(2)获得的发酵种子按发酵培养基体积的6％接入50l发酵罐中，发酵罐参数：罐温36-38℃、罐压0.03-0.05mpa，搅拌速率380-420rpm，通气比为1:1.0，发酵时间为16-20h。

进一步的，发酵罐参数：罐温37℃、罐压0.04mpa，搅拌速率400rpm，通气比为1:1.0，发酵时间为18h。

本发明还包括通过上述方法获得的发酵液。

本发明发酵液酶法脱毛的条件如下：

选取12月龄的巴马香猪；

猪蹄、猪皮的脱毛条件为：48-53℃，130-180rpm，10-15h，酶活力单位65-75u/ml；猪头脱毛条件为：48-53℃，130-180rpm，14-18h，酶活力单位77-84u/ml。

进一步的，猪蹄、猪皮的脱毛条件为：49-52℃，140-160rpm，11-13h，酶活力单位68-73u/ml；猪头脱毛条件为：48-53℃，140-160rpm，15-17h，酶活力单位79-82u/ml。

进一步的，猪蹄、猪皮的脱毛条件为：50℃，150rpm，12h，酶活力单位70u/ml；猪头脱毛条件为：50℃，150rpm，16h，酶活力单位80u/ml。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明建立了50l发酵罐生产角蛋白酶的发酵工艺，使b.subtilisfj-3-16菌株产酶量在专利cn201610289198.9基础上提高了2.25倍；同时产酶时间缩短了75％，具有优异的效果。在50l发酵罐发酵工艺的基础上，本发明进一步建立了酶法脱毛的批量处理工艺，利用50l发酵罐生产角蛋白酶的发酵工艺制备的发酵液，20l发酵液可一次性处理巴马香猪猪蹄/猪皮/猪头约40kg。综上，本发明为实现角蛋白酶的工业化应用奠定了基础，具有巨大的经济效益和市场价值。

附图说明

图1为脱毛条件为50℃，150rpm，12h，酶活力单位70u/ml时，本发明发酵液对猪蹄和猪头上皮张的脱毛效果图；

图2为脱毛条件为50℃，150rpm，12h，酶活力单位70u/ml时，本发明发酵液对整蹄的脱毛效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1一种角蛋白降解菌的发酵罐发酵工艺

菌株b.subtilisfj-3-16利用上述发酵培养基进行50l发酵罐发酵，具体步骤如下：

(1)斜面培养

采用划线法将b.subtilisfj-3-16接种到lb固体斜面培养基上，30℃培养24h得到复壮菌体；

lb固体斜面培养基(按质量百分数计)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、nacl1％、琼脂粉1.5％，水补足，naoh调ph为7.5；

(2)种子培养

将步骤(1)中的复壮菌体接种到lb液体种子培养基中，30℃，200rpm培养18h，得到发酵种子；

lb液体培养基(按质量百分数计)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、nacl1％，水补足，naoh调ph为7.5。

(3)50l发酵罐发酵

将步骤(2)获得的发酵种子按发酵培养基体积的6％接入50l发酵罐中，发酵罐参数：罐温37℃、罐压0.04mpa，搅拌速率400rpm，通气比为1:1.0，发酵时间为18h；

发酵培养基(按质量百分数计)为：

玉米粉1.41％、豆粉3.62％、酪素2％、cacl20.16％、k2hpo40.3％、kh2po40.1％，水补足，naoh调ph为8.0。

实施例2一种角蛋白降解菌的发酵罐发酵工艺

菌株b.subtilisfj-3-16利用上述发酵培养基进行50l发酵罐发酵，具体步骤如下：

(1)斜面培养

采用划线法将b.subtilisfj-3-16接种到lb固体斜面培养基上，30℃培养24h得到复壮菌体；

lb固体斜面培养基(按质量百分数计)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、nacl1％、琼脂粉1.5％，水补足，ph为7.5。

(2)种子培养

将步骤(1)中的复壮菌体接种到lb液体种子培养基中，30℃，200rpm培养18h，得到发酵种子；

lb液体培养基(按质量百分数计)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、nacl1％，水补足，naoh调ph为7.5。

(3)50l发酵罐发酵

将步骤(2)获得的发酵种子按发酵培养基体积的6％接入50l发酵罐中，发酵罐参数：罐温36℃、罐压0.05mpa，搅拌速率390rpm，通气比为1:1.0，发酵时间为17h；

发酵培养基(按质量百分数计)为：

玉米粉1.40％、豆粉3.61％、酪素1.9％、cacl20.18％、k2hpo40.25％、kh2po40.13％，水补足，naoh调ph为8.0。

实施例3一种角蛋白降解菌的发酵罐发酵工艺

菌株b.subtilisfj-3-16利用上述发酵培养基进行50l发酵罐发酵，具体步骤如下：

(1)斜面培养

采用划线法将b.subtilisfj-3-16接种到lb固体斜面培养基上，30℃培养24h得到复壮菌体；

lb固体斜面培养基(按质量百分数计)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、nacl1％、琼脂粉1.5％，水补足，naoh调ph为7.5。

(2)种子培养

将步骤(1)中的复壮菌体接种到lb液体种子培养基中，30℃，200rpm培养18h，得到发酵种子；

lb液体培养基(按质量百分数计)：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、nacl1％，水补足，naoh调ph为7.5。

(3)50l发酵罐发酵

将步骤(2)获得的发酵种子按发酵培养基体积的6％接入50l发酵罐中，发酵罐参数：罐温38℃、罐压0.05mpa，搅拌速率410rpm，通气比为1:1.0，发酵时间为20h；

发酵培养基(按质量百分数计)为：

玉米粉1.44％、豆粉3.65％、酪素1.8-.1％、cacl20.14％、k2hpo40.35％、kh2po40.13％，水补足，naoh调ph为8.0。

实施例4-实施例6中选取的是12月龄的巴马香猪。

实施例4实施例1获得的发酵液在生猪脱毛中的应用

(1)对原料皮的脱毛效果

①原料皮准备

选用巴马香猪猪蹄和猪头作为样品；猪蹄经充分水洗后，用解剖刀剥下蹄上的皮，将皮切割成2.5cm×1.5cm小块，取覆盖着硬毛的蹄背部分皮块做实验材料。猪头样品用解剖刀剥下部分皮张，经充分水洗后，将皮切割成2.5cm×1.5cm小块，取覆盖着浓密黑毛的皮块做实验材料。

②脱毛效果

脱毛条件为：50℃，150rpm，12h，酶活力单位70u/ml。

实验结果显示发酵液对猪蹄和猪头上所取原料皮的脱毛效果显著；目视观察脱毛后的皮张纹路完整、毛孔清晰、皮张上无毛茬残留，皮张的胶原层未受破坏，如图1所示。

(2)对整蹄的脱毛效果

新鲜猪蹄经充分水洗后浸泡于发酵液，脱毛条件：50℃、150rpm，酶活力单位70u/ml。定时观察猪蹄脱毛情况，结果显示在该条件下经过12h，猪蹄变软；蹄上的硬毛和绒毛松动，用手能轻松连根拔下；经充分水洗后整只猪蹄上的毛全部脱落，脱毛效果优异，如图2所示。

(3)批量处理

用磅秤称取新鲜猪蹄和猪皮共40kg，猪头40kg，猪蹄和猪皮间隔码好、放置于容器中，猪头码好、放置于容器中，分别加发酵液液20l浸没，猪蹄、猪皮的脱毛条件为：50℃，150rpm，12h，酶活力单位70u/ml；猪头脱毛条件为：50℃，150rpm，16h，酶活力单位80u/ml。观察脱毛效果：除几只大蹄(老龄猪)外，大部分蹄上的硬毛和绒毛都能用手连根拔下；猪皮的脱毛效果优于猪蹄，黑色硬毛部分脱落，裸露出白色皮张，余下的毛可用手拔下处理；猪头在相应的脱毛条件下，脱毛效果也较好。

实施例5实施例2获得的发酵液在生猪脱毛中的应用

(1)对原料皮的脱毛效果

①原料皮准备

选用巴马香猪猪蹄和猪头作为样品；猪蹄经充分水洗后，用解剖刀剥下蹄上的皮，将皮切割成2.5cm×1.5cm小块，取覆盖着硬毛的蹄背部分皮块做实验材料。猪头样品用解剖刀剥下部分皮张，经充分水洗后，将皮切割成2.5cm×1.5cm小块，取覆盖着浓密黑毛的皮块做实验材料。

②脱毛效果

脱毛条件为：49℃，160rpm，13h，酶活力单位67u/ml。

实验结果显示发酵液对猪蹄和猪头上所取原料皮的脱毛效果显著；目视观察脱毛后的皮张纹路完整、毛孔清晰、皮张上无毛茬残留，皮张的胶原层未受破坏。

(2)对整蹄的脱毛效果

新鲜猪蹄经充分水洗后浸泡于发酵液，脱毛条件：49℃，160rpm，酶活力单位67u/ml。定时观察猪蹄脱毛情况，结果显示在该条件下经过13h，猪蹄变软；蹄上的硬毛和绒毛松动，用手能轻松连根拔下；经充分水洗后整只猪蹄上的毛全部脱落，脱毛效果优异。

(3)批量处理

用磅秤称取新鲜猪蹄和猪皮共40kg，猪头40kg，猪蹄和猪皮间隔码好、放置于容器中，猪头码好、放置于容器中，分别加发酵液液20l浸没，猪蹄、猪皮的脱毛条件为：49℃，160rpm，13h，酶活力单位67u/ml；猪头脱毛条件为：49℃，160rpm，17h，酶活力单位82u/ml。观察脱毛效果：大部分蹄上的硬毛和绒毛都能用手连根拔下；猪皮的脱毛效果优于猪蹄，黑色硬毛部分脱落，裸露出白色皮张，余下的毛可用手拔下处理；猪头在相应的脱毛条件下，比实施例5效果稍差，但是黑色硬毛部分脱落，裸露出白色皮张，皱着处的毛可用手拔下处理。

实施例6实施例2获得的发酵液在生猪脱毛中的应用

(1)对原料皮的脱毛效果

①原料皮准备

选用巴马香猪猪蹄和猪头作为样品；猪蹄经充分水洗后，用解剖刀剥下蹄上的皮，将皮切割成2.5cm×1.5cm小块，取覆盖着硬毛的蹄背部分皮块做实验材料。猪头样品用解剖刀剥下部分皮张，经充分水洗后，将皮切割成2.5cm×1.5cm小块，取覆盖着浓密黑毛的皮块做实验材料。

②脱毛效果

脱毛条件为：52℃，140rpm，11h，酶活力单位72u/ml。

实验结果显示发酵液对猪蹄和猪头上所取原料皮的脱毛效果显著；目视观察脱毛后的皮张纹路完整、毛孔清晰、皮张上无毛茬残留，皮张的胶原层未受破坏。

(2)对整蹄的脱毛效果

新鲜猪蹄经充分水洗后浸泡于发酵液，脱毛条件：脱毛条件为：52℃，140rpm，酶活力单位72u/ml。定时观察猪蹄脱毛情况，结果显示在该条件下经过11h，猪蹄变软；蹄上的硬毛和绒毛松动，用手能轻松连根拔下；经充分水洗后整只猪蹄上的毛全部脱落，脱毛效果优异。

(3)批量处理

用磅秤称取新鲜猪蹄和猪皮共40kg，猪头40kg，猪蹄和猪皮间隔码好、放置于容器中，猪头码好、放置于容器中，分别加发酵液液20l浸没，猪蹄、猪皮的脱毛条件为：脱毛条件为：52℃，140rpm，11h，酶活力单位72u/ml；猪头脱毛条件为：52℃，140rpm，16h，酶活力单位79u/ml。观察脱毛效果：大部分蹄上的硬毛和绒毛都能用手连根拔下；猪皮的脱毛效果优于猪蹄，黑色硬毛部分脱落，裸露出白色皮张，余下的毛可用手拔下处理；猪头在相应的脱毛条件下，比实施例5效果稍差，但是黑色硬毛部分脱落，裸露出白色皮张，皱着处的毛可用手拔下处理。