专利名称：一种阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法及装置，属于发酵工程及设备技术 领域。
背景技术：
粘细菌、丝状真菌等微生物在发酵罐内培养时，菌体极易粘附于发酵液面以上的发酵 罐内壁上，而且随着发酵时间的增长，菌体逐步沿发酵罐内壁向上蔓延，贴壁粘附的菌体 越积越多，这是微生物发酵工业生产上常见的一种现象。
这种现象至少有两方面的弊端 一是贴壁粘附的这些菌体不能回到液体中，造成了发 酵液中菌体细胞数量减少，生物量的降低造成发酵效率低下；二是贴壁菌体汲取不到液体 培养基中的营养，传质和供氧均受到较大影响，无法满足目标产物的生成条件，造成严重 的浪费。发酵罐规模越大，此问题造成的弊端也越为严重。
通过提高发酵液搅拌强度，依靠液面的晃动把贴壁菌体重新融入发酵液中，可以部分 缓解菌体贴壁积累问题。但是，随着发酵液面达到新的高度，有些菌体依然从这一高度上 继续向上贴壁蔓延，而且在新的高度上越积越多，因此，此方法不能彻底解决这些微生物 贴壁粘附和蔓延的问题。
发明内容
本发明针对粘细菌、丝状真菌等工业微生物生产中存在的贴壁粘附问题以及背景技术 中存在的不足，提供一种阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法及装置。
本发明的一种阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法是使用无菌气体或无菌液体，逆着菌 体贴壁蔓延的方向将菌体吹送或淋洗回发酵液中。该方法是通过在发酵罐内发酵液面之上 的特定距离内设置一套环形多孔装置而实现的。
本发明的技术方案如下
一种阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法，是使用无菌气体或无菌液体，逆着菌体贴壁 蔓延的方向将菌体吹送或喷淋回发酵液中，所述无菌气体或无菌液体喷射点距离发酵液面
为l-10cm，喷射方向与所述发酵罐内壁夹角为1-60度，喷射速度为l-10m/s，无菌气体或
无菌液体输送压力与发酵罐内压力之差大于0. lMPa。
前述方法，优选的技术方案是，在进行吹送或喷淋时调节所述发酵罐罐压p《0. 05MPa。 前述方法，优选的技术方案是，在进行喷淋之前，所述无菌液体先经0.45um孔径过滤。
前述方法，优选的技术方案是，所述无菌气体或无菌液体喷射点距离发酵液面为
5-8cm。
前述方法，优选的技术方案是，所述无菌气体或无菌液体喷射方向与所述发酵罐内壁
夹角为25-45度。
前述方法，尤其适合于阻止发酵罐内粘细菌(Myxobacteria)和丝状真菌(Filamentous Fungi)的贴壁粘附现象。
3本发明提供的实现阻止发酵罐内菌体贴壁粘附方法的装置，包括管路、流量调节阀门 和环形装置，所述环形装置通过定位支架固定于发酵罐内，所述环形装置上设有喷射孔。 前述装置，优选的技术方案是，所述环形装置的直径D为4-15ram。 前述装置，优选的技术方案是，所述喷射孔的数量为40-120个。 前述装置，优选的技术方案是，所述喷射孔的直径d为0.2-1.2mm。 本发明阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法，是使用无菌气体或无菌液体，逆着菌体贴 壁蔓延的方向将菌体吹送或喷淋回发酵液中。无菌气体可以是发酵液中供氧所用的通用无 菌空气，是空气经过多级粗过滤和精过滤，除尘、除水、除油、除菌制备而成的。无菌液 体有两种制备方法， 一是以发酵罐中培养基配方而配制的新鲜液体培养基；二是发酵罐中 的培养液过滤后循环使用。以上无菌气体和无菌液体来源非常方便，制备方法为本专业人 员熟知。具体采用无菌气体还是无菌液体方式，要根据菌种培养要求而确定。如果加入新 鲜培养液对目标产物的生成没有影响，可以采用无菌液体喷淋的方法。如果加入新鲜培养 液对目标产物的生成有影响，则可采用无菌气体吹送或发酵液循环喷淋的方法。当采用两 种来源的无菌液体时，无菌液体进入环形多孔装置之前先经0. 45 ii m孔径过滤效果较好。
无菌气体吹送和无菌液体喷淋的方法均可采用脉冲方式，脉冲时间间隔视菌体贴壁粘 附的轻重程度而定，可在间隔l-24小时内手动调整。阻止菌体贴壁粘附的效果受流体的压 力、流量、喷射距离、喷射方向与罐内壁的夹角、喷射孔的开孔数目与开孔面积、脉冲频 率等因素的影响。可以根据此原理制作不同规格的环形装置用于不同菌体的发酵。 本发明方法及装置具有以下优点
入装置简单只需在通用发酵罐设备中加装该环形装置，辅以无菌空气和无菌液体的
输送管路阀门，便可以解决困扰发酵行业多年的菌体贴壁这一难题，将贴壁菌体回送到发
酵醪液当中，提高发酵效率。可以通过不同规格的环形装置(开孔数目和开孔方式不同)
以适宜于不同菌种的发酵。
么操作方便只需调整流体输送压力、流量既可以达到较好的喷射效果，脉冲频率可 以根据具体菌体贴壁情况手工调整。
J、不易染菌因为装置简单，而且主体装置在发酵罐内，可以随发酵罐实消，灭菌效 果较好。其它辅助管路阀门较少，且与无菌空气管路相连，保持无菌正压状态，几乎没有 染菌机会，所以整套装置不易染菌。
图l为环形装置正视剖面图2为环形装置俯视图3为环形装置局部放大其中l.管路；2.流量调节阀门；3.环形装置；4.粘附菌体；5.罐内发酵醪液面；6. 发酵罐内壁；7.定位支架；8.喷射孔；9.发酵罐；R.发酵罐内半径；r.环形装置弯曲半径; D.环形装置直径；d.喷射孔直径。
具体实施例方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但保护范围不限于此。 实施例1
4根据图1-3所示，本发明实现阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法的装置包括管路1、 流量调节阀门2和环形装置3，所述环形装置3通过定位支架7固定于发酵罐9内，所述 环形装置3上设有喷射孔8。
在用发酵罐进行纤维堆囊菌(5bra/^7'"/z7ceWi/7os^ATCC 15384)发酵生产埃博霉素 (印othilone)的过程中，菌体贴壁粘附现象严重，采用本发明的方法及装置，解除了菌体 贴壁粘附问题，发明装置相关参数如下
发酵罐总容积V: 500升； 发酵罐内半径R: 290mm;
喷射孔开孔数目N: 100个;
环形管开孔面积A: 19.6mm2; 流体类型无菌空气； 无菌空气压力P: 0.2MPa;
环形装置距发酵液面距离T :
操作方法步骤如下-(1)
50rariu
装液系数入75%
环形管弯曲半径r: 270mm
喷射孔直径d: 0. 5rara
环形管直径D: 10ram
无菌空气输送管直径①20mm 发酵罐内压力p: 0.05MPa 喷射方向与罐内壁夹角S: 30度
将发酵培养基装至发酵罐内相应液面高度，并在实消过程中控制最后液面高度 符合要求，距环形装置50mm。
(2) 无菌空气相应管路蒸汽杀菌30min，可以通过该环形装置进行发酵罐保压灭菌。
(3) 待灭菌结束后关闭无菌气体流量调节阀，备用。
(4) 接种培养24小时，发酵罐内壁有纤维堆囊菌向上蔓延迹象，调节罐压为0.05 MPa，开启发明装置中的流量调节阀30秒钟，关闭流量阀，记为一次脉冲。再 调节罐压为0.05 MPa，再开启发明装置中的流量调节阀30秒钟，关闭。脉冲 3次后，从视镜观察，纤维堆囊菌向上贴壁蔓延迹象消失。
(5) 每隔12小时，重复(4)中的脉冲操作，至贴壁粘附的菌体全部回到发酵醪液 中为止。
(6) 发酵7天时，检测发酵生物量和埃博霉素产量，与不安装本发明装置的发酵罐 相比，生物量提高52. 1%,埃博霉素A产量提高37.6y。。实施例2
在用发酵罐进行土曲霉菌(力卬e/^7^s ^rrews ATCC 20542)发酵生产洛伐他丁 (lovastatin)的过程中，菌体贴壁粘附现象严重，采用本发明的方法及装置，解除了菌体 贴壁粘附问题，发明装置相关参数如下
发酵罐总容积V: 50升； 发酵罐内半径R: 150mm;
喷射孔开孔数目N: 60个；
环形管开孔面积A: 47. lmra2 流体类型无菌液体； 无菌空气压力P: 0.2MPa; 环形装置距发酵液面距离T
操作方法步骤如下
30mm;
装液系数入70% 环形管弯曲半径r: 130mm
喷射孔直径d: Iran
环形管直径D: 8mra
无菌空气输送管直径①15mm 发酵罐内压力p: 0.03MPa
喷射方向与罐内壁夹角S: 45度(1) 将发酵培养基装至发酵罐内相应液面高度，并在实消过程中控制最后液面高度符 合要求，距环形装置30ram。
(2) 无菌空气相应管路蒸汽杀菌20min,可以通过该环形装置进行发酵罐保压灭菌。
(3) 待灭菌结束后关闭无菌气体流量调节阀，备用。
(4) 接种培养12小时，发酵罐内壁有土曲霉菌体贴壁粘附迹象，调节罐压为0. 03MPa, 将过滤灭菌配制好的培养基营养液补料瓶同流量调节阀相连，开启本发明装置中的流量调 节阀30秒钟，用气压将新鲜营养液压入环形装置中进行喷射，关闭流量阀，记为一次脉冲。 再调节罐压为0. 03MPa，开启发明装置中的流量调节阀30秒钟，关闭。脉冲3次后，从视 镜观察，土曲霉菌贴壁粘附迹象消失。
(5) 每隔24小时，重复(4)中的脉冲操作，至贴壁粘附的菌体全部回到发酵醪液中 为止。
(6) 发酵10天时，检测发酵生物量和洛伐他丁产量，与不安装本发明装置的发酵罐相 比，生物量提高35.6%，洛伐他丁产量提高29. 7%。
在用发酵罐进行纤维堆囊菌(5br朋gi鹏ceWuJo幼/77ATCC 15384)发酵生产埃博霉素 (印othilone)的过程中，菌体贴壁粘附现象严重，采用本发明的方法及装置，解除了菌体 贴壁粘附问题，发明装置相关参数如下
操作方法步骤如下
(1) 将发酵培养基装至发酵罐内相应液面高度，并在实消过程中控制最后液面高度 符合要求，距环形装置55mm。
(2) 无菌空气相应管路蒸汽杀菌30min，可以通过该环形装置进行发酵罐保压灭菌。
(3) 待灭菌结束后关闭无菌气体流量调节阀，备用。
(4) 接种培养24小时，发酵罐内壁有纤维堆囊菌向上蔓延迹象，调节罐压为0.03 MPa，开启发明装置中的流量调节阔30秒钟，关闭流量阀，记为一次脉冲。再调节罐 压为0.03 MPa,再开启发明装置中的流量调节阀30秒钟，关闭。脉冲3次后，从视 镜观察，纤维堆囊菌向上贴壁蔓延迹象消失。
(5) 每隔12小时，重复(4)中的脉冲操作，至贴壁粘附的菌体全部回到发酵醪液 中为止。
(6) 发酵7天时，检测发酵生物量和埃博霉素产量，与不安装本发明装置的发酵罐 相比，生物量提高45.3%，埃博霉素A产量提高33.6y。。
实施例3无菌空气压力P: 0. 15MPa; 环形装置距发酵液面距离T: 55 ram
发酵罐总容积V: 500升； 发酵罐内半径R: 290咖； 喷射孔开孔数目N: 40个； 环形管开孔面积A: 1.26咖2; 流体类型无菌空气；
装液系数入75%
环形管弯曲半径r: 270mm
喷射孔直径d: 0. 2mm
环形管直径D: 6mm
无菌空气输送管直径①20mm 发酵罐内压力p: 0.03MPa 喷射方向与罐内壁夹角S.: 25度
实施例4在用发酵罐进行土曲霉菌"卬e2^7hs terre"s ATCC 20542)发酵生产洛伐他丁 (lovastatin)的过程中，菌体贴壁粘附现象严重，采用本发明的方法及装置，解除了菌体 贴壁粘附问题，发明装置相关参数如下-
操作方法步骤如下
(1) 将发酵培养基装至发酵罐内相应液面高度，并在实消过程中控制最后液面高度符 合要求，距环形装置50誦。
(2) 无菌空气相应管路蒸汽杀菌20min，可以通过该环形装置进行发酵罐保压灭菌。
(3) 待灭菌结束后关闭无菌气体流量调节阀，备用。
(4) 接种培养12小时，发酵罐内壁有土曲霉菌体贴壁粘附迹象，调节罐压为0. 03MPa， 将过滤灭菌配制好的培养基营养液补料瓶同流量调节阀相连，开启本发明装置中的流量调 节阀30秒钟，用气压将新鲜营养液压入环形装置中进行喷射，关闭流量阀，记为一次脉冲。 再调节罐压为0. 03MPa，开启发明装置中的流量调节阀30秒钟，关闭。脉冲3次后，从视 镜观察，土曲霉菌贴壁粘附迹象消失。
(5) 每隔24小时，重复(4)中的脉冲操作，至贴壁粘附的菌体全部回到发酵醪液中 为止。
(6) 发酵10天时，检测发酵生物量和洛伐他丁产量，与不安装本发明装置的发酵罐相 比，生物量提高38.6%，洛伐他丁产量提高30. 7%。
发酵罐总容积V: 50升； 发酵罐内半径R: 150mm;
喷射孔开孔数目N: 120个；
环形管开孔面积A: 33.9mm2;
流体类型无菌液体；
无菌空气压力P: 0. 2MPa; 环形装置距发酵液面距离T: 50mm
装液系数入70% 环形管弯曲半径r: 130mm
喷射孔直径d: 0. 6ram
环形管直径D: 15mm .
无菌空气输送管直径①15mm 发酵罐内压力p: 0.03MPa
喷射方向与罐内壁夹角S: 25度
权利要求
1、一种阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法，其特征在于，使用无菌气体或无菌液体，逆着菌体贴壁蔓延的方向将菌体吹送或喷淋回发酵液中，所述无菌气体或无菌液体喷射点距离发酵液面为1-10cm，喷射方向与所述发酵罐内壁夹角为1-60度，喷射速度为1-10m/s，无菌气体或无菌液体输送压力与发酵罐内压力之差大于0.1MPa。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行吹送或喷淋时调节所述发酵罐罐 压p《0. 05MPa。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行喷淋之前，所述无菌液体先经 0. 45um孑L径过滤。
4、 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述无菌气体或无菌液体喷射点 距离发酵液面为5-8cm。
5、 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述无菌气体或无菌液体喷射方 向与所述发酵罐内壁夹角为25-45度。
6、 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述菌体为粘细菌或丝状真菌。
7、 一种实现权利要求l-3任一所述方法的装置，其特征在于，包括管路(1)、流量 调节阀门(2)和环形装置(3)，所述环形装置(3)通过定位支架(7)固定于发酵罐(9) 内，所述环形装置(3)上设有喷射孔(8)。
8、 根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述环形装置(3)的直径D为4-15mm。
9、 根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述喷射孔(8)的数量为40-120个。
10、 根据权利要求7或9所述的装置，其特征在于，所述喷射孔(8)的直径d为 0. 2—1. 2mm。
全文摘要
本发明公开了一种阻止发酵罐内菌体贴壁粘附的方法和装置，是使用无菌气体或无菌液体，逆着菌体贴壁蔓延的方向将菌体吹送或淋洗回发酵液中。该方法是通过在发酵罐内发酵液面之上的特定距离内设置一套环形多孔装置而实现的。本发明具有装置简单、操作方便、不易染菌的技术优势。
文档编号C12N1/14GK101586085SQ20091001626
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者刘新利, 崔灵芝, 玮 胡 申请人:山东轻工业学院