甲烷氧化耦合铬酸盐生物还原菌群的富集方法及应用与流程

本发明属于氧化态污染物生物修复技术，具体涉及一种甲烷氧化耦合铬酸盐(cro4^2-)还原菌群的富集及其在膜生物反应器(mbfr)中对铬酸盐生物还原的应用。

背景技术：

随着我国工业生产的快速发展，铬及其化合物作为一种强氧化剂、催化剂、防腐剂等，被广泛的应用在电镀、制革、纺织、冶炼等行业的工业生产中，产生了大量的六价铬废水(铬的主要存在价态为三价铬和六价铬，其中六价铬相对三价铬具有很高的溶解性和生物有效性，其毒性相对三价铬高达100倍)，进入江河湖泊，造成水体铬污染；同时，六价铬对人体可引起呼吸道疾病、消化道疾病，与皮肤接触可引起皮炎和湿疹，具有“三致”效应，严重危害人体健康。因此，加强对含铬废水的治理迫在眉睫。

而目前，利用微生物法处理重金属废水受到越来越多的重视。通过重金属离子与微生物或其代谢产物之间的相互作用，将六价铬还原为低价态低毒的三价铬，达到净化废水的目的。具有基建投资小、处理成本低、环境友好等优点。

因此，探究哪些微生物种类对六价铬的高效的生物还原作用是很有意义的。

甲烷(ch4)气体在自然界中会引起温室效应等危害，而微生物的作用过程需要有电子供体和碳源的输入。利用甲烷在自然界中的大量存在和价格低廉等优点，既可以为微生物作用提供电子供体，又可以作为碳源输入。因此，利用甲烷氧化耦合铬酸盐生物还原过程具有十分重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术内容是，克服现有技术的不足，提供一种甲烷氧化耦合铬酸盐生物还原菌群的富集方法及应用。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种甲烷氧化耦合铬酸盐生物还原菌群的富集方法，包括下述步骤：

(1)制备无机培养基

将1ml酸性微量元素溶液、1ml碱性微量元素溶液、1mgcacl2、5mgmgso4·7h2o、2mgmgcl2、0.4gkh2po4和0.8gna2hpo4·12h2o加入至1升去离子水中，调节ph至6.8-7.2之间，配成培养基；

所述酸性微量元素溶液是指：每升溶液含100mmhcl、2.085gfeso4·7h2o、68mgznso4·7h2o、14mgh3bo3、120mgcocl2·6h2o、500mgmncl2·4h2o、320mgcuso4、95mgnicl2·6h2o，余量为水；

所述碱性微量元素溶液是指：每升溶液含10mmnaoh、67mgseo2、50mgna2wo4·2h2o、242mgna2moo4·2h2o，余量为水；

(2)初始接种源富集

在中空纤维膜生物反应器中接种初始菌源；该初始菌源中含有按质量占比计算的下述菌种：β-变形菌26.84％、α-变形菌27.13％、γ-变形菌25.87％、酸杆菌4.97％、鞘氨醇杆菌3.88％、绿菌2.20％、异常球菌0.96％，余量是非富集对象的杂菌；

(3)反应阶段

向步骤(1)中所得的无机培养基中添加cro4^2-，直至其六价铬初始浓度为1.0mg/l；然后将其引入至接种了初始菌源的中空纤维膜生物反应器中，并连续运行；整个过程中控制温度为30±1℃，进水速率为0.5ml/min，半保留时间为130min，甲烷分压为10-15psi；运行15-20天后，该中空纤维膜生物反应器中即富集了能还原铬酸盐的生物菌群。

本发明进一步提供了前述方法所获生物菌群在降解铬酸盐中的应用，是利用富集了能还原铬酸盐的生物菌群的中空纤维膜生物反应器，进行铬酸盐废水的处理；具体包括以下步骤：

(1)按前述方法制备无机培养基，并用纯度大于99.99％的氩气曝气至氧气含量<0.2mg/l，得到经除氧的培养基；

(2)向经除氧的培养基中添加铬酸盐废水，使六价铬浓度为3mg/l；然后引入至富集了生物菌群的中空纤维膜生物反应器中，连续运行15-20d；整个过程中控制温度为30±1℃，进水速率为0.5ml/min，半保留时间为130min，甲烷分压为10-15psi；

(3)向经除氧的培养基中添加铬酸盐废水，使六价铬浓度为1mg/l；然后引入至步骤(2)的中空纤维膜生物反应器中，按相同运行条件连续运行15-20d；

(4)向经除氧的培养基中添加铬酸盐废水，使六价铬浓度为2mg/l；然后引入至步骤(3)的中空纤维膜生物反应器中，按相同运行条件连续运行15-20d；

(5)向经除氧的培养基中添加铬酸盐废水，使六价铬浓度为3mg/l；然后引入至步骤(4)的中空纤维膜生物反应器中，按相同运行条件连续运行15-20d。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：

1、本发明最终获得的生物菌群具有高效的生物还原铬酸盐的效率，在130min的半保留时间内可以将3mg/l的六价铬生物还原95％。

2、本发明中，确定了起主导性作用的生物还原铬酸盐的菌群种类为异常球菌(亚栖热菌属)，丰富了生物还原铬酸盐的菌属类型。

3、本发明还具有十分重要的现实意义：既可以缓解温室效应，又可以修复受污染的水体，还可以实现废物资源化再利用。

附图说明

图1：本发明中中空纤维膜生物反应器进行铬酸盐生物还原的效率图；

图2：本发明中中空纤维膜生物反应器进行铬酸盐生物还原各阶段的微生物菌群结构图。

具体实施方式

本发明中所述初始菌源的获取方式是：采集污水处理厂的活性污泥(本申请人采集自杭州七格污水处理厂)，以多种氧化态污染物(例如铬酸盐、硒酸盐、锑酸盐、高氯酸盐、硝酸盐)作为电子受体，以甲烷作为电子供体富集培养约半年，然后接种到甲烷mbfr反应器中直至运行稳定，即可获得菌种含量稳定的初始接种菌源。具体的富集培养方法系本领域技术人员熟知的现有技术，故本发明不再赘述。

本发明所述初始菌源中含有按质量占比计算的下述菌种：β-变形菌26.84％、α-变形菌27.13％、γ-变形菌25.87％、酸杆菌4.97％、鞘氨醇杆菌3.88％、绿菌2.20％、异常球菌0.96％，余量是非富集对象的杂菌。申请人承诺：从该专利申请之日起20年内向公众发放该初始菌源，以用于实现、利用本发明所述技术方案。

本发明中，所使用的中空纤维膜生物反应器(mbfr反应器)可按常规方式自行搭建。该反应器为双管中空纤维膜生物反应器，总体积为65ml，主膜管管内有32根疏水性微孔聚乙烯膜(外径为280μm，内径为180μm，微孔直径为0.1-0.15μm)，副膜管管内有16根疏水性微孔聚乙烯膜(该膜由日本mitsubishi公司制造，型号mhf-200tl)。反应器构型可参照mbfr反应器，具体可见参考文献(zhaoet.al,2011,interactionsbetweenperchlorateandnitratereductionsinthebiofilmofahydrogen-basedmembranebiofilmreactor))。

实施例1：

本发明中，能生物还原铬酸盐的生物菌群的富集方法，包括下述步骤：

(1)制备无机培养基

将1ml酸性微量元素溶液、1ml碱性微量元素溶液、1mgcacl2、5mgmgso4·7h2o、2mgmgcl2、0.4gkh2po4和0.8gna2hpo4·12h2o加入至1升去离子水中，调节ph至6.8-7.2之间，配成培养基；

所述酸性微量元素溶液是指：每升溶液含100mmhcl、2.085gfeso4·7h2o、68mgznso4·7h2o、14mgh3bo3、120mgcocl2·6h2o、500mgmncl2·4h2o、320mgcuso4、95mgnicl2·6h2o，余量为水；

所述碱性微量元素溶液是指：每升溶液含10mmnaoh、67mgseo2、50mgna2wo4·2h2o、242mgna2moo4·2h2o，余量为水；

(2)初始接种源富集

在中空纤维膜生物反应器中接种初始菌源；该初始菌源中含有按质量占比计算的下述菌种：β-变形菌26.84％、α-变形菌27.13％、γ-变形菌25.87％、酸杆菌4.97％、鞘氨醇杆菌3.88％、绿菌2.20％、异常球菌0.96％，余量是非富集对象的杂菌；

(3)反应阶段

在步骤(1)所得的无机培养基中添加cro4^2-直至其六价铬初始浓度为1.0mg/l，然后引入至接种了初始菌源的中空纤维膜生物反应器(mbfr)中并连续运行；整个过程中控制温度为30±1℃，进水速率为0.5ml/min，半保留时间为130min，甲烷分压为10-15psi；运行15-20天后，该中空纤维膜生物反应器中即富集了能生物还原铬酸盐的生物菌群。

最终，对含1mg/l六价铬铬酸盐进水浓度的生物还原效率维持在77％(详见图1：阶段一)。

(4)菌群结构鉴定

对步骤(3)中富集的生物菌群的群落结构进行测序鉴定(详见图2：阶段一)，菌群中主要菌种包括：异常球菌(deinococci)、β-变形菌(betaproteobacteria)、α-变形菌(alphaproteobacteria)、γ-变形菌(gammaproteobacteria)、酸杆菌(acidobacteria)和鞘氨醇杆菌(sphingobacteria)，各自的比例为：异常球菌57.36％、α-变形菌21.84％、β-变形菌6.52％、γ-变形菌3.51％、酸杆菌6.54％、鞘氨醇杆菌2.37％(其余为各类非富集对象的杂菌)。

本发明实施例2-5是利用实施例1中富集了能还原铬酸盐的生物菌群的中空纤维膜生物反应器，依次引入不同六价铬浓度的铬酸盐废水并分阶段连续运行。然后对菌群的群落结构进行测序，并对生物还原效率进行计算。

实施例2：

利用实施例1中经连续运行的中空纤维膜生物反应器，进行第二阶段处理：

(1)按相同方法制备无机培养基，并用纯度大于99.99％的氩气曝气至氧气含量<0.2mg/l，得到经除氧的培养基；

(2)向经除氧的培养基中添加铬酸盐废水，使六价铬浓度为3mg/l；然后引入至富集了生物菌群的中空纤维膜生物反应器中，连续运行15-20d；整个过程中控制温度为30±1℃，进水速率为0.5ml/min，半保留时间为130min，甲烷分压为10-15psi；

(3)菌群结构鉴定

对步骤(2)中富集菌群的群落结构进行测序鉴定(详见图2：阶段二)，菌群中主要菌种包括：异常球菌、α-变形菌、β-变形菌、γ-变形菌、酸杆菌和鞘氨醇杆菌，各自的比例为：异常球菌58.06％、α-变形菌19.80％、β-变形菌12.39％、γ-变形菌2.02％、酸杆菌2.24％、鞘氨醇杆菌3.87％(其余为各类非富集对象的杂菌)。

经检验，在130min的半保留时间内，对含3mg/l六价铬铬酸盐进水浓度的生物还原效率仅仅达到10％(详见图1：阶段二)。结合菌群结构鉴定结果，可以确定是铬酸盐的毒害作用对生物菌群产生影响。

实施例3：

利用实施例2中经连续运行的中空纤维膜生物反应器，进行第三阶段处理：

(1)按相同方法制备无机培养基，并用纯度大于99.99％的氩气曝气至氧气含量<0.2mg/l，得到经除氧的培养基；

(2)向经除氧的培养基中添加铬酸盐废水，使六价铬浓度为1mg/l；然后引入至中空纤维膜生物反应器中，连续运行15-20d；整个过程中控制温度为30±1℃，进水速率为0.5ml/min，半保留时间为130min，甲烷分压为10-15psi。

(3)菌群结构鉴定

对步骤(2)中富集菌群的群落结构进行测序鉴定(详见图2：阶段三)，菌群中主要菌种包括：异常球菌、α-变形菌、β-变形菌和鞘氨醇杆菌，各自的比例为：异常球菌62.25％、α-变形菌26.55％、β-变形菌8.22％、鞘氨醇杆菌1.78％(其余为各类非富集对象的杂菌)。

经检验，在130min的半保留时间内，对含1mg/l六价铬铬酸盐进水浓度的生物还原效率超过了95％(详见图1：阶段三)。结合菌群结构鉴定结果，可以确定是铬酸盐的浓度降低，抑制解除，速率得以提升。

实施例4：

利用实施例3中经连续运行的中空纤维膜生物反应器，进行第四阶段处理：

(1)按相同方法制备无机培养基，并用纯度大于99.99％的氩气曝气至氧气含量<0.2mg/l，得到经除氧的培养基；

(2)向经除氧的培养基中添加铬酸盐废水，使六价铬浓度为2mg/l；然后引入至中空纤维膜生物反应器中，连续运行15-20d；整个过程中控制温度为30±1℃，进水速率为0.5ml/min，半保留时间为130min，甲烷分压为10-15psi。

(3)菌群结构鉴定

对步骤(2)中富集菌群的群落结构进行测序鉴定(详见图2：阶段四)，菌群中主要菌种包括：异常球菌、α-变形菌、β-变形菌和鞘氨醇杆菌，各自的比例为：异常球菌67.35％、α-变形菌20.95％、β-变形菌7.37％、鞘氨醇杆菌2.64％(其余为各类非富集对象的杂菌)。

经检验，在130min的半保留时间内，对含2mg/l六价铬铬酸盐进水浓度的生物还原效率与阶段三基本一致(详见图1：阶段四)。结合菌群结构鉴定结果，可以确定是铬的还原菌逐渐适应了铬酸盐浓度的提高。

实施例5：

利用实施例4中经连续运行的中空纤维膜生物反应器，进行第五阶段处理：

(1)按相同方法制备无机培养基，并用纯度大于99.99％的氩气曝气至氧气含量<0.2mg/l，得到经除氧的培养基；

(2)向经除氧的培养基中添加铬酸盐废水，使六价铬浓度为3mg/l；然后引入至中空纤维膜生物反应器中，连续运行15-20d；整个过程中控制温度为30±1℃，进水速率为0.5ml/min，半保留时间为130min，甲烷分压为10-15psi。

(3)菌群结构鉴定

对步骤(2)中富集菌群的群落结构进行测序鉴定(详见图2：阶段五)，菌群中主要菌种包括：异常球菌、α-变形菌、β-变形菌和鞘氨醇杆菌，各自的比例为：异常球菌73.33％、α-变形菌15.27％、β-变形菌6.13％、鞘氨醇杆菌1.82％、厌氧绳菌1.47％(其余为各类非富集对象的杂菌)。

经检验，在130min的半保留时间内，对含3mg/l六价铬铬酸盐进水浓度的生物还原效率依旧维持在95％(详见图1：阶段五)。结合菌群结构鉴定结果，可以确定：相较于阶段二，铬的还原菌在经过阶段三和阶段四渐渐适应了，所以还原效率提升到了95％。此外，在生物菌群中起到主导性作用的是异常球菌，隶属于亚栖热菌属。