无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用与流程

文档序号：16208278发布日期：2018-12-08 07:23阅读：907来源：国知局

本发明属于生物工程领域；更具体的，本发明涉及一种无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用。

背景技术

近年来，生物制品在人们生产生活中所占的比重越来越高，而大部分生物制品如：疫苗、抗体、抗菌肽、抗生素等几乎都是通过异源表达的方式进行生产。而在采用模式生物异源表达生物制品的过程中，由启动子引导的转录起始过程是蛋白表达的关键步骤。因此强力可调控的启动子一直是高水平表达外源蛋白所必不可少的工具。

毕赤酵母中的醇氧化酶(aox1)启动子(paox1)是目前最强力的启动子，已用于表达多种外源蛋白，胞内表达量和胞外表达量最高分别可达到22g/l的和15g/l。因此，paox1常被用来进行改造以获得具有更高启动强度、不依赖甲醇诱导的合成型启动子。目前对于paox1的改造主要针对于其启动子序列的缺失或者插入及转录调控因子表达水平的调控。在这些研究中在甲醇诱导下相对野生型活性最好的的突变启动子分别为hartner等的160％、xuan等的157％。但是由于paox1的调控网络尚未完全清晰，在大规模应用中还存在诸多问题。近年来已经商业化的不依赖甲醇的启动子只有奥地利vtutechnology公司，他们通过对paox1序列进行的改造开发的2ndpaox1在甘油诱导下能够达到1ndpaox1(野生型菌株的paox1)在甲醇诱导下的18.2％～114.3％，并且要高于pgap的表达水平，已经达到工业应用的水平。尽管非甲醇诱导paox1的研究已经取得了很大的突破，但是仍旧无法改变paox1调控模式单一，碳源严重阻遏等问题。

因此，如果得到一种调控更加灵活、能够利用非甲醇诱导启动子表达的方法，使原本依赖甲醇诱导的启动子在其它碳源作为单一碳源的条件下也能够更为高效的转录，这对于实现工业上利用毕赤酵母灵活、高效的表达外源多肽具有积极意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种通过人工改造甲醇诱导/碳源阻遏型启动子转录调控遗传线路从而构建更为强力的新型表达系统的方法。

在本发明的第一方面，提供一种无碳源阻遏性表达外源多肽的方法，包括：

(1)提供甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：

表达盒1，其表达外源的dna结合蛋白和转录激活因子的融合多肽，以及

表达盒2，从5’→3’依次包括操作性连接的：蛋白结合序列、甲醇诱导型启动子，外源多肽编码基因；

(2)在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下、培养(1)的甲醇营养型酵母，表达外源多肽。

在一个优选例中，所述的甲醇营养型酵母包括：毕赤酵母(pichia)，汉逊酵母(hansenula)，假丝酵母(candida)，球拟酵母(torulopsis)；较佳地，所述的甲醇营养型酵母是毕赤酵母。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母是：gs115毕赤酵母菌株。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，包括启动子以及与之操作性连接的dna结合蛋白和转录激活因子的融合多肽的编码基因。

在另一优选例中，所述的表达盒1中还包括启动子，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子或葡萄糖浓度控制型启动子；较佳地，所述的组成型启动子包括(但不限于)gap启动子；较佳地，所述的葡萄糖浓度控制型启动子包括(但不限于)：msc1启动子、mal31启动子、gal4启动子。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，所述的dna结合蛋白包括(但不限于)：laci，fapr，arac。

在另一优选例中，所述的laci基因的核苷酸序列如seqidno:1所示或其简并的序列；

所述的fapr基因的核苷酸序列如seqidno:2所示或其简并的序列；或

所述的arac基因的核苷酸序列如seqidno:3所示或其简并的序列。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，所述的转录激活因子是甲醇营养型酵母中具备独立招募rna聚合酶能力的转录因子蛋白；较佳的，为转录激活因子的激活域。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，所述的转录激活因子激活域包括(但不限于)：mit1ad，mxr1ad，prm1ad。

在另一优选例中，所述的mit1ad基因的核苷酸序列如seqidno:4所示或其简并的序列；

所述的mxr1ad基因的核苷酸序列如seqidno:5所示或其简并的序列；或

所述的prm1ad基因的核苷酸序列如seqidno:6所示或其简并的序列；

在另一优选例中，所述的表达盒2中，所述的蛋白结合序列包括(但不限于)：laco、fapo、arai。

在另一优选例中，所述的laco的核苷酸序列如seqidno:8所示或其简并的序列；

所述的fapo的核苷酸序列如seqidno:9所示或其简并的序列；或

所述的arai的核苷酸序列如seqidno:10所示或其简并的序列。

在另一优选例中，所述的蛋白结合序列以1～15拷贝存在，较佳地为1～9拷贝。

在另一优选例中，所述的甲醇诱导型启动子包括(但不限于)：aox1启动子、dhas启动子、fdh启动子或它们的核心启动子；较佳地，为aox1核心启动子；更佳地，其核苷酸序列如seqidno:7所示。

在另一优选例中，所述的培养是以甘油和/或葡萄糖为碳源的培养。

在本发明的另一方面，提供dna结合蛋白和转录激活因子的融合多肽或其编码基因的用途，用于甲醇营养型酵母消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性或碳源阻遏而更加强力的驱动外源多肽编码基因表达。

在一个优选例中，所述的甲醇诱导型启动子是aox1启动子；或所述的甲醇营养型酵母包括：毕赤酵母(pichia)，汉逊酵母(hansenula)，假丝酵母(candida)，球拟酵母(torulopsis)；较佳地，所述的甲醇营养型酵母是毕赤酵母；或所述的碳源是甘油和/或葡萄糖。

在本发明的另一方面，提供一种重组的甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：

表达盒1，其表达外源的dna结合蛋白和转录激活因子激活域的融合多肽，以及

表达盒2，从5’→3’依次包括操作性连接的：蛋白结合序列、甲醇诱导型启动子，外源多肽编码基因。

在一个优选例中，所述的表达盒1中，包括启动子以及与之操作性连接的dna结合蛋白和转录激活因子激活域的融合多肽的编码基因；或

所述的表达盒1中，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子或葡萄糖浓度控制型启动子；或

所述的表达盒1中，所述的dna结合蛋白包括(但不限于)：laci，fapr，arac；或

所述的表达盒1中，所述的转录激活因子激活域包括(但不限于)：mit1ad，mxr1ad，prm1ad；或

所述的表达盒2中，所述的蛋白结合序列包括(但不限于)：laco、fapo、arai；较佳地为laco，其以1～15拷贝存在，较佳地为1～9拷贝；或

所述的甲醇诱导型启动子包括：aox1启动子；较佳地，为aox1核心启动子。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、gs115-ppag、lm-laco1cag、lx-laco1cag、lp-laco1cag四个菌株在不同碳源下培养后单位细胞的荧光强度。

图2、gs115-ppag、pmsclm-laco1cag、pmallm-laco1cag、pgallm-laco1cag四个菌株分别在甲醇和不同葡萄糖浓度下进行培养后单位细胞的荧光强度。

图3、gs115-ppag与含有1-9个拷贝laco的菌株在甲醇条件下培养后单位细胞的荧光强度。

具体实施方式

为解决目前甲醇诱导型启动子存在的调控模式单一，碳源严重阻遏等问题，本发明人经过深入的研究，揭示了一种消除甲醇诱导型启动子甲醇碳源依赖性和葡萄糖等碳源严重阻遏的方法，通过人工改造甲醇营养型酵母细胞内的转录调控遗传线路，提高启动子转录强度并改变其调控模式，使得酵母表达系统可以更为灵活和高效的表达外源多肽。

如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mrna。一般地，启动子或启动子区提供rna聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“甲醇诱导型启动子”是与甲醇代谢有关的酶的启动子。在现有技术中，这些启动子通过向生长培养基中添加甲醇，可以控制外源多肽由所述启动子的表达。所述的“甲醇诱导型启动子”可以由本领域技术人员使用常规技术从酵母中分离获得。

如本文所用，所述的“单一甲醇(碳源)依赖”是指启动子需要以甲醇为唯一碳源进行诱导来驱动与之操作性连接的基因的表达，在非甲醇为唯一碳源(如葡萄糖，或甲醇+葡萄糖)的条件下不能驱动与之操作性连接的基因的表达。所述的“消除单一甲醇依赖”是指使得启动子在不以甲醇为唯一碳源(如甲醇+葡萄糖，或葡萄糖，或甘油)的条件下就可驱动与之操作性连接的基因的表达。“非单一甲醇(碳源)诱导”是指除了甲醇碳源外，还存在至少一种非甲醇的碳源。

如本文所用，所述的“组成型启动子”是指在其调控下不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异的一类启动子。

如本文所用，所述的“诱导型启动子”可根据需要在特定细胞生长阶段或特定生长环境下，快速诱导基因转录的“开”与“关”或者“高”与“低”。根据来源，可将诱导型启动子分为天然存在的启动子和人工构建的启动子。

如本文所用，所述的“组织或器官特异性启动子”是指基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中的启动子。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(例如，本发明中的外源多肽或laci-mit1ad融合多肽(编码基因如seqidno:11))所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“甲醇营养型酵母”是指可利用甲醇作为唯一碳源的酵母。包括来自汉逊酵母属(hansenula)，毕赤酵母属(pichia)，球拟酵母属(torulopsis)，假丝酵母属(candida)等的酵母。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明揭示了一种通过在甲醇营养型酵母细胞中异源表达dna结合蛋白与转录激活因子激活域的融合蛋白，激发下游合成启动子的表达，以此使得原本依赖甲醇诱导的启动子不再依赖单一甲醇、不受葡萄糖等其他碳源阻遏，可以更加灵活、高效的表达外源多肽。更具体地，在本发明构建的酵母表达系统中，一方面，dna结合蛋白和转录激活因子构成融合蛋白。另一方面，表达盒1中的dna结合蛋白通过与表达盒2中的核心甲醇诱导型启动子上游的蛋白结合序列可以发生结合，这种结合使得转录激活因子与甲醇诱导型启动子在空间上靠近。从而，所述的转录激活因子能够招募rna聚合酶结合到所述的核心甲醇诱导型启动子上，启动外源多肽的转录。

本发明中，所述的dna结合蛋白包括但不限于：laci，fapr，arac；所述的蛋白结合序列包括但不限于：laco、fapo、arai。并且，当dna结合蛋白应用laci时，相应的蛋白结合序列应用laco；当dna结合蛋白应用fapr时，相应的蛋白结合序列应用fapo；当dna结合蛋白应用arac时，相应的蛋白结合序列应用arai。

所述的laci基因的核苷酸序列可以是seqidno:1所示；所述的fapr基因的核苷酸序列可以是seqidno:2所示；所述的arac基因的核苷酸序列可以是seqidno:3所示。所述的laco的核苷酸序列如seqidno:8所示；所述的fapo的核苷酸序列如seqidno:9所示；所述的arai的核苷酸序列如seqidno:10所示。本发明还涉及上述多核苷酸的简并的序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与上述核苷酸所编码的相同氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述多核苷酸同源的多核苷酸，较佳地同源性为70％以上、80％以上、90％以上、93％、95％以上或97％以上，这些多核苷酸所编码的多肽也具有与前述多核苷酸所编码的多肽相同的功能。

本发明中，所述的转录激活因子激活域包括但不限于：mit1ad，mxr1ad，prm1ad。所述的mit1ad基因具有seqidno:4所示的核苷酸序列。所述的mxr1ad基因具有seqidno:5所示的核苷酸序列。所述的prm1ad基因具有seqidno:6所示的核苷酸序列。本发明还涉及这些多核苷酸的简并的序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与上述这些核苷酸所编码的相同氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。本发明还涉及与上述这些多核苷酸同源的多核苷酸，较佳地同源性为70％以上、80％以上、90％以上、93％、95％以上或97％以上，这些多核苷酸所编码的多肽也具有mit1ad，mxr1ad或prm1ad相同的功能。

本领域技术人员熟悉甲醇依赖型启动子，可使用常规技术从酵母中分离获得。由于甲醇依赖型启动子具有基本相同的工作机制和工作原理，本发明对于甲醇依赖型启动子的种类没有特别的限制。例如，所述的甲醇诱导型启动子包括但不限于：aox1启动子、dhas启动子(或者das启动子)、fdh启动子(或者fmdh启动子)、mox启动子、aox2启动子、zza1、pex5-、pex8-、pex14-启动子、pmp20启动子、pmp47启动子、aod1启动子、aod2启动子。作为本发明的优选方式，所述的甲醇依赖型启动子为aox1启动子，较佳地为aox1核心启动子；更佳地，其核苷酸序列如seqidno:7所示。本发明还包括与上述甲醇依赖型启动子的多核苷酸序列具有至少70％，更佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的启动子。这些启动子在引发转录的必要位点及转录起始点的位置上是严格保守的。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述甲醇依赖型启动子的核苷酸序列可杂交的多核苷酸，且该多核苷酸也具有野生型甲醇依赖型启动子的功能。

所述的表达盒1中，也包括使得dna结合蛋白和转录激活因子激活域的融合多肽顺利表达的启动子元件。任意能使融合多肽大量表达的启动子均可应用于表达盒1中。所述的启动子可以是：组成型启动子，诱导型启动子，组织或器官特异性启动子，时空特异性表达启动子等。较佳地，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子pgap，葡萄糖浓度控制型启动子pmal、pmsc、pgal。同样地，所述的表达盒1中也包括适用的终止子，这是本领域技术人员构建基因表达盒所熟知的元件。

作为本发明的优选方式，表达盒2中，所述的蛋白结合序列在核心启动子上游以单拷贝或多拷贝存在，较佳地为1～15拷贝，更佳地1-9拷贝，如9、7、5、3、1拷贝。

本发明中，所述的“无甲醇的条件”或“非单一甲醇碳源条件”是本领域技术人员易于建立的，也即，在常规应用的甲醇营养型酵母培养基中，不加入甲醇作为碳源，取代以其它类型的碳源；或者，在常规应用的甲醇营养型酵母培养基中，含有甲醇作为碳源的同时，还含有其他碳源(如葡萄糖、甘油)。常用的碳源是本领域技术人员熟知的，例如但不限于：甘油、葡萄糖、淀粉(含淀粉水解液，木薯淀粉，玉米淀粉，纤维素类水解液等)、蔗糖、麦芽糖等。较佳地，采用以甘油和/或葡萄糖为碳源的酵母培养基。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种重组的甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：前面所述的表达盒1以及表达盒2。任何甲醇营养型酵母均可被应用于本发明中，以构建上述重组的甲醇营养型酵母。例如，所述的甲醇营养型酵母包括但不限于：毕赤酵母(pichia)，汉逊酵母(hansenula)，假丝酵母(candida)，球拟酵母(torulopsis)；较佳地为毕赤酵母(pichia)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料

质粒构建方法应用诺唯赞生物科技公司的无缝克隆试剂盒。

所使用的工具酶均购自takara生物公司(大连，中国)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

下面的商品化质粒和菌株用于基因克隆和蛋白表达：质粒pgapzαa、质粒ppic3.5k、大肠杆菌top10、毕赤酵母菌株gs115，均购自invitrogen公司。

质粒ppag是通过在质粒ppic3.5k的aox1启动子下游的snabi酶切位点处插入gfp基因(全长714bp，序列见genbank登录号ay656807.1中第80～793位)而获得。

laci多肽的dna片段(seqidno:1)通过金唯智生物科技有限公司人工合成，laco序列的dna片段通过捷瑞生物公司合成两条单链的引物lacof(seqidno:12)和lacor(seqidno:13)退火连接获得。

ypd培养基：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，2％琼脂粉；ynb培养基：0.67％ynb；mgy培养基：1％甘油，0.67％ynb；ynd液体培养基：1％葡萄糖，0.67％ynb。

配制以上培养基时，葡萄糖115℃高压灭菌20min，甲醇在使用时添加。其它成分121℃高压灭菌20min。固体培养基加2％琼脂粉。

实施例1、无碳源阻遏的甲醇营养型酵母组成型表达系统

1.pplaco1cag质粒的构建

分别以laco-caox1f(seqidno:14)和ppcagr(seqidno:15)为引物以及以ppcagf(seqidno:16)和laco-ppicr(seqidno:17)为引物，通过pcr的方法，从ppag质粒上扩增aox1核心启动子(即seqidno:7)和gfp的区域以及pphis整合位点和抗性片段区域，通过无缝克隆试剂盒将两条片段进行组装，得到的重组质粒为pplaco1cag。

2.电转毕赤酵母和gs115-laco1cag菌株的筛选

将重组质粒pplaco1cag电转毕赤酵母菌株gs115，涂于不含组氨酸的ynd平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-timepcr验证gfp拷贝数。把real-timepcr检验gfp为单拷贝的毕赤酵母表达菌株命名为gs115-laco1cag。

表达菌株gs115-ppag的构建：将重组质粒ppag电转毕赤酵母菌株gs115，获得表达菌株gs115-ppag。

3.pgap表达laci和转录因子激活域融合多肽质粒的构建

以pgapf(seqidno:18)和laci-gapr(seqidno:19)为引物，通过pcr的方法，从pgapzαa上扩增gap启动子和抗性区域片段；从毕赤酵母gs115基因组上扩增mit1ad(seqidno:4)、mxr1ad(seqidno:5)、prm1ad片段(seqidno:6)，分别与抗性区域片段及laci片段通过无缝克隆试剂盒进行无缝组装，获得重组质粒pgglacimit1ad、pgglacimxr1ad、pgglaciprm1ad。

mit1ad扩增引物：laci-mit1adf(seqidno:20)和pgap-mit1adr(seqidno:21)；

mxr1ad扩增引物：laci-mxr1adf(seqidno:22)和pgap-mxr1adr(seqidno:23)；

prm1ad扩增引物：laci-prm1adf(seqidno:24)和pgap-prm1adr(seqidno:25)。

4.电转毕赤酵母和单拷贝菌株的筛选

将重组质粒pgglacimit1ad、pgglacimxr1ad、pgglaciprm1ad分别电转gs115-laco1cag菌株，涂于添加zeocin抗生素的ypd固体培养基平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-timepcr验证laci拷贝数。把real-timepcr检验为单拷贝的毕赤酵母表达菌株分别命名为lm-laco1cag、lx-laco1cag、lp-laco1cag。

5.酶标仪检测gfp荧光强度

将菌株gs115-ppag、lm-laco1cag、lx-laco1cag、lp-laco1cag分别在ypd液体培养基中过夜预培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2次后，分别转移至含有0.5％(v/v)甲醇，1％葡萄糖，1％甘油的ynb液体培养基中进行培养，取样后用酶标仪检测样品中gfp的荧光强度。

结果图1所示，lm-laco1cag、lx-laco1cag、lp-laco1cag三个菌株在甲醇、葡萄糖和甘油条件下均不受碳源阻遏，有显著的荧光蛋白表达，其中lm-laco1cag菌株表达强度约为gs115-ppag的3.5倍；lx-laco1cag菌株表达强度约为gs115-ppag的3倍；lp-laco1cag菌株表达强度约为gs115-ppag的0.75倍，但体现出碳源阻遏的消除。

由上述结果可见，本发明的方法可有效地消除酵母菌菌株的碳源阻遏。

实施例2、诱导调控型表达系统

1.诱导型启动子表达lacimit1ad融合多肽质粒的构建

以lacif(seqidno:26)和pgoutr(seqidno:27)为引物，通过pcr的方法，从pgglacimit1ad上扩增lacimit1ad融合多肽的orf框、终止子和抗性区域片段，分别与从毕赤酵母gs115基因组上扩增出的msc1启动子、mal31启动子、gal4启动子片段通过无缝克隆试剂盒进行无缝组装，使得上述启动子分别位于融合多肽orf框的上游、可驱动多肽表达。分别获得重组质粒pgpmsclacimit1ad、pgpmallacimit1ad、pgpgallacimit1ad。

msc1启动子扩增引物：pg-mscf(seqidno:28)和laci-mscr(seqidno:29)；

mal31启动子扩增引物：pg-malf(seqidno:30)和laci-malr(seqidno:31)；

gal4启动子扩增引物：pg-galf(seqidno:32)和laci-galr(seqidno:33)。

2.电转毕赤酵母和pmscmit1ad-laco1cag菌株的筛选

将重组质粒pgpmsclacimit1ad、pgpmallacimit1ad、pgpgallacimit1ad分别电转gs115-laco1cag菌株，涂于添加zeocin抗生素的ypd固体培养基平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-timepcr验证laci拷贝数。把real-timepcr检验laci为单拷贝的毕赤酵母表达菌株分别命名为pmsclm-laco1cag、pmallm-laco1cag、pgallm-laco1cag。

3.酶标仪检测gfp荧光强度

将菌株gs115-ppag、pmsclm-laco1cag、pmallm-laco1cag、pgallm-laco1cag分别在ypd液体培养基中过夜预培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2次后，将gs115-ppag转移至含有0.5％(v/v)甲醇的ynb液体培养基中进行培养，将pmsclm-laco1cag、pmallm-laco1cag、pgallm-laco1cag分别转移至含有2％、1％、0.5％葡萄糖的ynb液体培养基进行培养，取样后用酶标仪检测样品中gfp的荧光强度。

结果如图2所示，pmsclm-laco1cag、pmallm-laco1cag、pgallm-laco1cag三个菌株在不同浓度葡萄糖作为碳源条件下均有荧光表达，且表达强度均呈现随葡萄糖浓度降低而升高的趋势，其中，强度最高的菌株pgallm-laco1cag在0.5％葡萄糖浓度时可达到菌株gs115-ppag的3倍左右。

实施例3、含有不同laco拷贝数的甲醇营养型酵母表达系统

1.毕赤酵母gs115-lm单拷贝菌株的筛选

将重组质粒pgglacimit1ad分别电转gs115菌株，涂于添加zeocin抗生素的ypd固体培养基平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-timepcr验证laci拷贝数。把real-timepcr检验为单拷贝的毕赤酵母表达菌株分别命名为gs115-lm。

2.含有不同拷贝数laco质粒的构建

通过酶切的方法，将重组质粒pplaco1cag(含有1个拷贝的laco)在saci/xhoi进行双酶切线性化，然后与laco片段进行连接反应，得到的重组质粒为pplaco2cag(含有2个拷贝的laco)。

同理可得到重组质粒pplaco3cag、pplaco4cag、pplaco5cag、pplaco6cag、pplaco7cag、pplaco8cag、pplaco9cag，它们分别含有3、4、5、6、7、8、9个拷贝的laco。

3.毕赤酵母lm-laconcag单拷贝菌株的筛选

将含有1-9拷贝laco的重组质粒(pplaco1cag、pplaco2cag…pplaco9cag)分别电转gs115菌株，涂于不含组氨酸的ynd平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-timepcr验证gfp拷贝数。把real-timepcr检验为单拷贝的毕赤酵母表达菌株命名为lm-laconcag(n为相应laco拷贝数)

4.酶标仪检测gfp荧光强度

将菌株、lm-laconcag(n为相应laco拷贝数，本实验中为1-9)分别在ypd液体培养基中过夜预培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2次后，转移至含有0.5％(v/v)甲醇的ynb液体培养基中进行培养，取样后用酶标仪检测样品中gfp的荧光强度。

如图3所示，含有1-9个拷贝的菌株lm-laconcag均有荧光蛋白表达，其中，lm-laco5cag菌株表达强度最高，可达到gs115-ppag菌株的5倍左右。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>华东理工大学

<120>无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用

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<223>aox1核心启动子

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<223>laco的核苷酸序列

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<223>fapo的核苷酸序列

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<223>arai的核苷酸序列

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<213>人工序列

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<223>laci-mit1ad融合多肽编码基因

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