一种提取植物根部内生细菌DNA的方法与流程

本发明涉及一种细菌dna的提取方法。
背景技术：
：植物内生细菌是植物微生态系统的组成成分，具有促进植物生长和拮抗病原菌的作用。了解植物内生细菌多样性，对于探究不同寄主植物在不同生长环境下的内生细菌群落结构差异和发现功能菌株等具有重要意义。近年来快速发展的分子生物学技术已经成为研究植物内生细菌的重要手段，这些技术应用的前提是需要从土壤中提取出高质量的植物内生细菌dna，以满足下游pcr、酶切和测序等操作的需求。现有对根部内生细菌dna的提取，前处理主要是利用naclo、酒精或无菌水清洗多次，然后就开始研磨，很容易使紧紧贴附在植物根部表面的微小土壤颗粒不能被彻底清洗，这样提取过程中来自土壤颗粒dna也会被提取出来，造成根际细菌dna对植物本身根部内生细菌dna的污染。另外，现有提取方法在清洗完根部组织后一般采用手动法提取和纯化，效率低，提取时间大约在3小时左右。技术实现要素：本发明是要解决现有对根部内生细菌dna的提取方法容易造成根际细菌dna对植物本身根部内生细菌dna的污染，以及提取时间长的问题，提供一种提取植物根部内生细菌dna的方法。本发明提取植物根部内生细菌dna的方法，包括以下步骤：一、将植物根部样品放入无菌离心管，手动颠倒离心管3～5次，以便使无菌水冲洗掉植物根部样品表面残留浮土，冲洗至植物体表面没有浮土残留；二、向装有植物根部样品的离心管中加入质量浓度0.04％～0.06％的sds溶液，直至sds溶液没过样品，手动颠倒离心管数次，弃去sds溶液，再用无菌水冲洗数次，直至离心管内没有sds溶液的泡沫留下；三、用体积浓度为70％～75％的乙醇溶液冲洗植物根部样品2～3次，再用无菌水冲洗2～3次；四、然后将表面冲洗干净的植物根部样品转移到灭菌研钵中，用灭菌剪刀将样品剪碎，充分研磨植物根部样品；五、使用fastdnaspinkitforsoil试剂盒提取植物根部样品中的内生细菌dna。进一步的，步骤四中研磨植物根部样品时还加入10mm磷酸钠缓冲液，便于研磨，加入体积过多会稀释所提取的dna浓度；进一步的，步骤五中使用fastdnaspinkitforsoil试剂盒提取植物根部样品中的内生细菌dna的方法具体为：1)取研磨充分的植物根部样品0.3-0.5克装入fastdnaspinkitforsoil试剂盒中配套的2.0ml离心管，加入122μlmt缓冲液(试剂盒配套提供)和978μlsodiumphosphatebuffer(试剂盒配套提供)；2)将步骤1)中的离心管放到核酸快速提取震荡仪，打碎植物根部样品(5.5m/s,30s)；3)1,4000g离心30min，将上清液(800μl左右)转移到2.0ml离心管，加入250μlpps(试剂盒配套提供)，涡旋震荡20s；4)1,4000g离心10min，将上清液(1000μl左右)转移到2.0ml离心管，加入250μlpps(试剂盒配套提供)，涡旋震荡20s；5)1,4000g离心10min，将上清液(1200μl左右)转移到15.0ml离心管，加入1mlbindingmatrix(试剂盒配套提供，使用前需要摇匀)，手动颠倒离心管2min，将离心管静止防置30min；6)吸取并丢弃上清液(1800μl左右)，尽量不要碰触底部液面；7)用移液器吸取步骤6)中离心管底部剩余的液体，再小心释放，目的是使底部剩余液体变成均匀的悬浮液，之后将悬浮液转移到spintmfilter过滤柱中(试剂盒配套提供)；8)1,4000g离心1min，弃掉底部液体；9)向spintmfilter过滤柱中加入500μlsews-m，涡旋震荡，目的使过滤柱中底部白色沉淀变成悬浮液；10)1,4000g离心1min，弃掉底部液体；11)重复步骤9)和10)；12)不加入任何试剂，将步骤11)中的过滤柱1,4000g离心2min，弃掉底部液体，目的是风干过滤柱中底部白色沉淀，然后将底部离心管更换为新的2.0ml离心管；13)室温静止5min，然后向过滤柱中加入100μldes(试剂盒配套提供)，再次涡旋震荡将白色沉淀变成悬浮液；14)1,4000g离心1min，底部澄清液体即为内生细菌dna；15)用电泳仪检测dna提取效果，在凝胶成像仪下进行观察，拍照，用微量分光光度计测定提取的dna浓度，记录，并于-20℃保存待用。本发明的有益效果：本发明使用表面活性剂sds预先处理植物根部样品，sds有去污和分散的功能，使用sds清洗植物根部即不会对植物根部本身造成损伤，又可以增强清洗效果。另外，现有提取方法在清洗完根部组织后一般采用手动法提取，本发明将原本应用在提取土壤微生物dna试剂盒的方法借鉴到植物部内生细菌dna的提取，避免了以往单一的对内生细菌的纯手动提取，缩短了提取过程，本方法提取过程所用的时间大约是40分钟，简化了提取步骤，进而减少了手动的繁琐过程对dna造成污染的机会，也省去了dna的纯化步骤，提高了提取效率，省时省力。本发明方法提取的dna纯度高，od260/od280在1.6到1.8之间。附图说明图1为植物内生细菌总dna琼脂糖电泳图；图2为植物内生细菌dna的pcr扩增效果图；图3为pcr产物进行变性梯度凝胶电泳图。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式提取植物根部内生细菌dna的方法，包括以下步骤：一、将植物根部样品放入无菌离心管，手动颠倒离心管3～5次，冲洗至植物体表面没有浮土残留；二、向装有植物根部样品的离心管中加入质量浓度0.04％～0.06％的sds溶液，直至sds溶液没过样品，手动颠倒离心管3～5次，弃去sds溶液，再用无菌水冲洗3～5次，直至离心管内没有sds溶液的泡沫留下；三、用体积浓度为70％～75％的乙醇溶液冲洗植物根部样品2～3次，再用无菌水冲洗2～3次；四、然后将表面冲洗干净的植物根部样品转移到灭菌研钵中，用灭菌剪刀将样品剪碎，充分研磨植物根部样品；五、然后使用fastdnaspinkitforsoil试剂盒提取植物根部样品中的内生细菌dna。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三用体积浓度为71％～74％的乙醇溶液冲洗植物根部样品。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三用体积浓度为72％～73％的乙醇溶液冲洗植物根部样品。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤四向装有植物根部样品的离心管中加入质量浓度00.05％的sds溶液。其它与具体实施方式一至三之一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤四中研磨植物根部样品时还加入10mm磷酸钠缓冲液，便于研磨，加入体积过多会稀释所提取的dna浓度。其它与具体实施方式一至四之一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤五中使用fastdnaspinkitforsoil试剂盒提取植物根部样品中的内生细菌dna的方法具体为：1)取研磨充分的植物根部样品0.3-0.5克装入fastdnaspinkitforsoil试剂盒中配套的2.0ml离心管，加入122μlmt缓冲液和978μlsodiumphosphatebuffer；2)将步骤1)中的离心管放到核酸快速提取震荡仪，打碎植物根部样品；3)1,4000g离心30min，将上清液转移到2.0ml离心管，加入250μlpps，涡旋震荡20s；4)1,4000g离心10min，将上清液转移到2.0ml离心管，加入250μlpps，涡旋震荡20s；5)1,4000g离心10min，将上清液转移到15.0ml离心管，加入1mlbindingmatrix，手动颠倒离心管2min，将离心管静止防置30min；6)吸取并丢弃上清液，尽量不要碰触底部液面；7)用移液器吸取步骤6)中离心管底部剩余的液体，再小心释放，目的是使底部剩余液体变成均匀的悬浮液，之后将悬浮液转移到spintmfilter过滤柱中；8)1,4000g离心1min，弃掉底部液体；9)向spintmfilter过滤柱中加入500μlsews-m，涡旋震荡，目的使过滤柱中底部白色沉淀变成悬浮液；10)1,4000g离心1min，弃掉底部液体；11)重复步骤9)和10)；12)不加入任何试剂，将步骤11)中的过滤柱1,4000g离心2min，弃掉底部液体，目的是风干过滤柱中底部白色沉淀，然后将底部离心管更换为新的2.0ml离心管；13)室温静止5min，然后向过滤柱中加入100μldes，再次涡旋震荡将白色沉淀变成悬浮液；14)1,4000g离心1min，底部澄清液体即为内生细菌dna；15)用电泳仪检测dna提取效果，在凝胶成像仪下进行观察，拍照，用微量分光光度计测定提取的dna浓度，记录，并于-20℃保存待用。其它与具体实施方式一至五之一相同。下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：提取植物根部内生细菌dna的方法，包括以下步骤：1、将大豆根部样品放入50ml无菌离心管，手动颠倒离心管数次，以便使无菌水冲洗掉大豆根部样品表面残留浮土，可多次冲洗直至植物体表面没有浮土残留；2、向上述装有大豆根部样品的离心管中加入0.05％sds溶液，直至液体没过样品，手动颠倒离心管数次，弃去sds溶液，用无菌水冲洗5次，直至离心管内没有sds溶液的泡沫留下；3、用70％酒精冲洗大豆根部样品2次，再用无菌水冲洗2次；4、将上述表面冲洗干净的大豆根部样品转移到灭菌研钵中，用灭菌剪刀将样品剪碎；5、充分研磨大豆根部样品，此过程中可加入少量体积的10mm磷酸钠缓冲液，便于研磨，加入体积过多会稀释所提取的dna浓度；6、取研磨充分的大豆根部样品0.3-0.5克装入fastdnaspinkitforsoil试剂盒中配套的2.0ml离心管，加入122μlmt缓冲液(试剂盒配套提供)和978μlsodiumphosphatebuffer(试剂盒配套提供)；7、将6步骤中的离心管放到核酸快速提取震荡仪，打碎大豆根部样品(5.5m/s,30s)；8、1,4000g离心30min；9、将上清液(800μl左右)转移到2.0ml离心管，加入250μlpps(试剂盒配套提供)，涡旋震荡20s；10、1,4000g离心10min；11、将上清液(1000μl左右)转移到2.0ml离心管，加入250μlpps(试剂盒配套提供)，涡旋震荡20s；12、1,4000g离心10min；13、将上清液(1200μl左右)转移到15.0ml离心管，加入1mlbindingmatrix(试剂盒配套提供，使用前需要摇匀)，手动颠倒离心管2min，将离心管静止防置30min；14、吸取并丢弃上清液1800μl左右，尽量不要碰触底部液面；15、用移液器吸取14步骤中离心管底部剩余的液体，再小心释放，目的是使底部剩余液体变成均匀的悬浮液，之后将悬浮液转移到spintmfilter过滤柱中(试剂盒配套提供)；16、1,4000g离心1min，弃掉底部液体；17、向spintmfilter过滤柱中加入500μlsews-m，涡旋震荡，目的使过滤柱中底部白色沉淀变成悬浮液；18、1,4000g离心1min，弃掉底部液体；19、重复步骤17；20、重复步骤18；21、不加入任何试剂，将步骤20中的过滤柱1,4000g离心2min，弃掉底部液体，目的是风干过滤柱中底部白色沉淀，然后将底部离心管更换为新的2.0ml离心管；22、室温静止5min；23、向过滤柱中加入100μldes(试剂盒配套提供)，再次涡旋震荡将白色沉淀变成悬浮液；24、1,4000g离心1min，底部澄清液体即为内生细菌dna；25、用电泳仪检测dna提取效果，在凝胶成像仪下进行观察，拍照，用微量分光光度计测定提取的dna浓度，记录，并于-20℃保存待用。本实施例方法提取的植物内生细菌总dna琼脂糖电泳图如图1所示，可以看出dna的纯度较高(条带的明亮程度越大代表所获得的dna量越高)，提取效果较好。本方法提取的dna的od260/od280在1.6到1.8之间。巢式pcr扩增根内生细菌16srrna基因。利用引物(如表1)进行pcr扩增，反应为：premix(5u·μl-1，extaq，takara)12.5μl，引物63fmi/1492ry各1μl(20pmol·μl-1)，lna-mit63/lna-mit1492各3.75μl(20pmol·μl-1)，lna-pla63/lna-pla1492各1.25μl(20pmol·μl-1)dna模板0.5μl，无菌水定容至25μl反应体系，设未添加dna模板为阴性对照。扩增条件为：94℃3min；94℃1min，70℃1min，54℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。表1引物序列长度lna-mit635’-gtcgaacgttgttttcggp-3’18lna-mit14925’-cttcaccccagtcgaagap-3’18lna-pla635’-tcggacgggaagtggtp-3’16lna-pla14925’-cttcactccagtcactagcp-3’1963f-mi5’-yrkgcytwayacatgcaagtc-3’211492r-y5’-ggytaccttgttacgactt-3’19植物内生细菌dna的pcr扩增效果如图2所示，图2中m表示dnamarker，d表示阴性对照，s表示植物内生细菌dna的pcr扩增片段。从pcr结果我们可以验证本提取方法确实能够提取出来自植物内生细菌的dna，pcr产物可用于测序或酶切等下游实验。将得到的内生细菌dna的pcr产物进行变性梯度凝胶电泳，如图3所示。变性梯度凝胶电泳是pcr的下游实验，能获得清晰的变性梯度凝胶电泳条带图谱能再次说明通过该提取方法获得的pcr产物足以满足后续实验的需要。因为本发明用0.05％sds溶液和预先处理了植物根部样品，其中sds为表面活性剂，其作用是能使附着在植物根上的土壤颗粒和微生物从根表面脱离，然后又用75％酒精处理了根部样品，酒精有杀菌的作用，这进一步对根部表面进行了除菌，经过sds和酒精双重处理后，又用无菌水对根部样品进行了多次清洗，可认为根部表面的土壤颗粒和微生物已经被清除掉了，所以再对这部分表面已经被除菌的根进行dna提取，即可认为所获得的为内生细菌的dna。对根表面先除菌再进行后续关于内生细菌的研究也是目前国际上公认的研究内生细菌的方法。本方法提取过程所用的时间大约是40分钟，与现有的提取方法(3小时)相比所用时间显著降低。序列表<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所<120>一种提取植物根部内生细菌dna的方法<160>6<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物lna-mit63<400>1gtcgaacgttgttttcgg18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物lna-mit1492<400>2cttcaccccagtcgaaga18<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物lna-pla63<400>3tcggacgggaagtggt16<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物lna-pla1492<400>4cttcactccagtcactagc19<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物63f-mi<400>5yrkgcytwayacatgcaagtc21<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物1492r-y<400>6ggytaccttgttacgactt19当前第1页12