使植物具有除草剂抗性的水稻ALS突变型蛋白、基因及其应用的制作方法

本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，涉及使植物具有除草剂抗性的水稻als突变型蛋白、基因及其应用；具体而言，本发明涉及水稻的乙酰乳酸合成酶(als)突变蛋白，该蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的特性。本发明公开了该蛋白的序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。

背景技术：

杂草是制约农业生产稳产高产的不利因素。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是一种高效的、简便的和经济的治理杂草方法。

乙酰乳酸合成酶(als)(也称乙酰羟酸合成酶，ahas；ec4.1.3.18)抑制剂类除草剂以als作为靶标而导致杂草死亡，主要包括磺酰脲类(sulfonylureas,su)、咪唑啉酮类(imidazolinones,imi)、三唑嘧啶类(triazolopyrimidines,tp)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[pyrimidinylthio(oroxy)–benzoates,ptb；pyrimidinyl-carboxyherbicides；pcs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(sulfonylamino-carbonyltriazolinones,sct)等13类化合物。乙酰乳酸合成酶，存在于植物生长过程中，它能以高度专一性和极高的催化效率催化丙酮酸为乙酰乳酸，从而导致支链氨基酸的生物合成。als抑制剂是除草剂通过抑制als而破坏植物体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成。而亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸是植物体内3种必需的支链氨基酸。als是催化缬氨酸和异亮氨酸生物合成过程中第一步反应的一个关键酶，亮氨酸的合成过程则较复杂，其中从丙酮酸到α-酮异戊酸的合成过程与缬氨酸完全一致，然后才形成亮氨酸，所以，这3种氨基酸的生物合成开始阶段均需als催化。als也是植物支链氨基酸生物合成过程中3个调节酶之一，其活性受产物缬氨酸和异亮氨酸的反馈调节。als抑制剂会使植物体内als活力降低，导致这3种支链氨基酸合成受阻，影响蛋白质的合成，进一步抑制细胞分裂，导致植物组织失绿、黄化，植株生长受抑，最后逐渐死亡。

als抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。但这些除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也产生药害，极大限制了其使用时间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范围。

成熟的als蛋白大约由670个氨基酸组成，其序列在不同物种间高度保守。als蛋白在gly95、ala96、ala122、pro171、pro196、pro197、ala205、asp376、trp537、trp548、trp552、trp557、trp563、trp574、ser621、ser627、ser638、ser653、gly654、val669等氨基酸位点(以模式植物拟南芥的als氨基酸位置计算)发生突变可以产生als抑制剂类除草剂抗性，这在多种农作物(包括玉米、水稻、水稻、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。

其中，水稻已知的抗als抑制剂突变位点包括gly95、ala96、ala122、trp548、ser627、ser653和gly654。als突变体抗除草剂水平与als氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。

目前，als抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测als蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现als蛋白新的除草剂抗性位点。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供使植物具有除草剂抗性的蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了编码该蛋白的核酸以及表达盒、载体和细胞等。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。

本发明人通过长期、艰苦的研究，对籼稻扬州恢复系的ems突变植株进行长期、不断地筛选，发现了一系列als突变蛋白，包括前文所述的某些已知als突变蛋白和新als突变蛋白，其对als抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有als抑制剂类除草剂抗性。本发明在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等作物中的应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明提供了使得植物具有除草剂抗性的als蛋白，其在氨基酸序列的第627位氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺，和/或在氨基酸序列的第628位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸。目前还没有报道表明，在来自水稻品种扬州恢复系als蛋白的ser627和gly628位点同时突变的突变株和在gly628位点突变的突变株。

优选本发明的第一方面的蛋白带有ser627和gly628位点同时突变的突变株和在gly628位点突变的突变株，除了本发明具有的实施方式所述的突变植株筛选或扩增方法之外，在蛋白质序列已知的情形下，本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入载体，就可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质，这些方法均为常规手段。在本发明的具体实施方式中，本发明的具有除草剂抗性的als蛋白的氨基酸序列如seqidno:2或seqidno:6所示。该蛋白经过证实对咪唑啉酮类除草剂不敏感的乙酰乳酸合成酶。

本发明的第二方面提供了核酸，其编码本发明第一方面的蛋白质。在本发明中，核酸可以是dna、rna，其中优选为dna。在知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用pcr方法、dna重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本发明第一方面的蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。优选本发明第二方面的核酸的核苷酸序列如seqidno：1或seqidno:5所示。具体的，本发明的dna序列，是在野生型水稻品种扬州恢复系的als基因序列的第1880位核苷酸由g变成核苷酸a，和/或第1883位核苷酸由g变成核苷酸a。

此外，本发明还获得了仅包含有ser627位点突变的抗除草剂突变体2和仅包含有gly628位点突变的抗除草剂突变体3，通过实验比较发现，含有ser627和gly628位点突变的突变体比仅含有ser627位点的突变体2或仅含有gly628位点突变的抗除草剂突变体3的抗除草剂抗性要强。其中，仅含有ser627位点突变的抗除草剂突变体2的als核苷酸序列如seqidno.3所示，氨基酸如seqidno.4所示。仅含有gly628位点突变的抗除草剂突变体3的als核苷酸序列如seqidno.5所示，氨基酸如seqidno.6所示。

此外，本发明突变前的野生型水稻为籼型常规水稻种子扬州恢复系，该als抑制剂类除草剂敏感的野生型扬州恢复系水稻als的核苷酸序列如seqidno.7所示，氨基酸如seqidno.8所示。

本发明的第三方面的内容包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的第二方面的核酸。

本发明第四方面内容还包括上述的具有除草剂抗性的als蛋白、核酸、表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。

其中，上述绿色植物为水稻、烟草、拟南芥、棉花等。

本发明第五方面的内容还包括获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含本发明所述的核酸；或

2)使植物表达所述的蛋白。

其中，上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

本发明第六方面的内容包括鉴定植物的方法，其中植物是包含所述的核酸的植物、表达所述的蛋白的植物或所述的方法获得的植物，具体包括以下步骤：

1)测定所述植物是否包含所述的核酸；或，

2)测定所述植物是否表达所述的蛋白。

有益效果：

1)本发明通过对突变株的als酶活测定结果来看，扬州恢复系抗除草剂突变体1的als活性比扬州恢复系抗除草剂突变体2的als活性高30％，比扬州恢复系抗除草剂突变体3的als活性高31％。

2)本发明通过田间喷施als抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本发明的具有除草剂抗性的als蛋白的水稻3-4叶幼苗在施用3ml百垄通/l水(9倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻3-4叶幼苗在施用1ml百垄通/3l水(1倍推荐使用浓度)30天后表现为整株死亡。

附图说明

图1百垄通除草剂筛选获得的抗性水稻突变体1；

图2pcr扩增als基因结果图；第1泳道为marker；marker分子量从上到下依次为3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道为扬州恢复系野生型水稻dna，第3泳道为抗除草剂突变体1的dna，第4泳道为抗除草剂突变体2的dna，第5泳道为抗除草剂突变体3的dna；目的片段长度2091bp；

图3百垄通除草剂对野生型和抗除草剂水稻抗除草剂突变体1、抗除草剂突变体2和抗除草剂突变体3的als酶活性抑制的吸光值测定；

图4抗除草剂突变体1的als基因的过量表达载体bamhi/saci双酶切验证图；第1泳道为marker；marker分子量从上到下依次为3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp；第2泳道为未经酶切的重组载体，第3泳道为重组载体经bamhi/saci双酶切后产生的基因片段和质粒片段dna，基因片段大小符合预期，证明载体构建成功；

图5突变型als基因水稻pcr检测图；总共有8个泳道，第1泳道为marker；marker分子量从上到下依次为3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp；第2泳道为非转基因野生型dna，作为阴性对照，第3泳道为质粒dna，作为阳性对照，第4泳道为转化抗除草剂突变体1als基因的转基因植株dna，第5泳道为转化抗除草剂突变体2als基因的转基因植株dna，第6泳道为转化抗除草剂突变体3als基因的转基因植株dna。

图6百垄通除草剂对野生型水稻和含有抗除草剂突变体1als基因的转基因水稻、含有抗除草剂突变体2als基因的转基因水稻和含有抗除草剂突变体3als基因的转基因水稻的als酶活性抑制的吸光值测定；

图7百垄通除草剂对野生型烟草和含有抗除草剂突变体1als基因的转基因烟草、含有抗除草剂突变体2als基因的转基因烟草和含有抗除草剂突变体3als基因的转基因水稻的als酶活性抑制的吸光值测定；

图8百垄通除草剂对杂交后代中的杂合植株、抗除草剂突变体2和抗除草剂突变体3的als酶活性抑制的吸光值测定。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：水稻抗咪唑啉酮类除草剂突变体获取过程(百垄通)

将籼型常规水稻种子扬州恢复系(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)(此为m0，用清水浸泡2小时)150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(ems)室温下浸泡6-9小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去ems溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用自来水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理(此为m1)。植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待水稻(此为m2)幼苗长至3-4叶期时，喷施为3ml百垄通/l水(“百垄通”是德国巴斯夫公司生产一种水剂型咪唑啉酮类除草剂，推荐最低使用浓度为1ml百垄通/1.5～3l水)，30天后还呈正常绿色植株即为抗咪唑啉酮类除草剂的水稻突变体(图1)。共计获得抗除草剂的m2单株211株，这些抗性单株进行常规肥水管理，有198个m2单株可正常结实，种子成熟后，单株收种、晾干，过冬保存。

实施例2：抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体突变位点分析

取上述实施例1获得的抗除草剂水稻突变植株选取多个突变体叶片，分别提取基因组dna，送南京一道生物科技有限公司进行基因组测序。测序结果与扬州恢复系野生型als基因比较，发现上述水稻突变植株中有三组突变植株，即抗除草剂水稻突变体1、抗除草剂水稻突变体2和抗除草剂水稻突变体3，其中，抗除草剂水稻突变体1在als基因上发生了2个位点的突变，第1880、1883位点碱基发生突变，分别由g变成a、g变成a，导致其相应编码的氨基酸序列的第627、628位点由丝氨酸变为天冬酰胺、甘氨酸变为谷氨酸，即抗除草剂突变体1的als基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，其编码的als蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示；抗除草剂突变体2在als基因的仅在第1880位点碱基发生突变，分别由g变成a，导致其相应编码的氨基酸序列的第627位点分别由丝氨酸变为天冬酰胺，即抗除草剂突变体2的als基因的核苷酸序列如seqidno.3所示，其编码的als蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示；抗除草剂突变体3在als基因的仅在第1883位点碱基发生突变，由g变成a，导致其相应编码的氨基酸序列的第628位点分别由甘氨酸变为谷氨酸，即抗除草剂突变体3的als基因的核苷酸序列如seqidno.5所示，其编码的als蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示。

本发明的抗除草剂水稻突变体1其分类命名为水稻种子yxl-25(oryzasativaindicagroupyxl-25)，该菌株已于2017年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为cctccno：p201713。

本发明的抗除草剂水稻突变体3其分类命名为水稻种子yxl-63(oryzasativaindicagroupyxl-63)，该菌株已于2017年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为cctccno：p201712。

实施例3：抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体als基因克隆

取上述抗除草剂水稻突变体1、抗除草剂水稻突变体2和抗除草剂水稻突变体3的叶片，分别提取基因组dna。根据扬州恢复系野生型als基因序列设计扩增als基因全长的特异引物为：正向引物f5’-tcgcccaaacccagaaaccc-3’、反向引物r5’-ctctttatgggtcattcaggtc-3’。

采用takaraprimerstarmaxdnapolymerase聚合酶(购自takara公司)扩增als基因，其反应体系如下：

pcr扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。

程序如下：预变性：98℃3min；35个循环：变性98℃10sec；延伸68℃1min；保温：72℃10min。

取2μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图2)，剩余的pcr产物经pcr清洁试剂盒(购自axygen公司)清洁回收后，克隆至pmd19-t载体(购自takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行pcr检测，取pcr结果呈阳性的6个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测序，获得突变als基因序列，该基因片段长度为2091bp，抗除草剂水稻突变体1als基因片段的测序结果如下：

ctgcatcgcgtgtcgccctttcgcccaaacccagaaaccctcgccgccgccgccgccgccatcacccaccatggctacgaccgccgcggccgcggccgccaccttgtccgccgccgcgacggccaagaccggccgtaagaaccaccagcgacaccacgtccttcccgctcgaggccgggtgggggcggcggcggtcaggtgctcggcggtgtccccggtcaccccgccgtccccggcgccgccggccacgccgctccggccgtgggggacggccgagccccgcaagggcgcggacatcctcgtggaggcgctggagcggtgcggcgtcagcgacgtgttcgcctacccgggcggcgcgtccatggagatccaccaggcgctgacgcgctccccggtcatcaccaaccacctcttccgccacgagcagggcgaggcgttcgcggcgtccgggtacgcgcgcgcgtccggccgcgtcggggtctgcgtcgccacctccggccccggggcaaccaacctcgtgtccgcgctcgccgacgcgctgctcgactccgtcccgatggtcgccatcacgggccaggtcccccgccgcatgatcggcaccgacgccttccaggagacgcccatagtcgaggtcacccgctccatcaccaagcacaattaccttgtccttgatgtggaggacatcccccgcgtcatacaggaagccttcttcctcgcgtcctcgggccgtcctggcccggtgctggtcgacatccccaaggacatccagcagcagatggctgtgccagtctgggacacctcgatgaatctaccggggtacattgcacgcctgcccaagccacccgcgacagaattgcttgagcaggtcttgcgtctggttggcgagtcacggcgcccgattctctatgtcggtggtggctgctctgcatctggtgatgaattgcgccggtttgttgagctgaccggcatcccagttacaaccactctgatgggcctcggcaatttccccagtgatgatccgttgtccctgcgcatgcttgggatgcatggcacggtgtacgcaaattatgcggtggataaggctgacctgttgcttgcatttggcgtgcggtttgatgatcgtgtgacagggaaaattgaggcttttgcaagcagggccaagattgtgcacattgacattgatccagcggagattggaaagaacaagcaaccacatgtgtcaatttgcgcagatgttaagcttgctttacagggcttgaatgctctgctagaccagagcacaacaaagacaagttctgattttagtgcatggcacaatgagttggaccagcagaagagggagtttcctctggggtacaagacttttggtgaagagatcccaccgcaatatgctattcaggtgctggatgagctgacgaaaggggaggcaatcatcgctactggtgttggacagcaccagatgtgggcggcacaatattacacctacaagcggccacggcagtggctgtcttcggctggtctgggcgcaatgggatttgggctgcctgctgcagctggtgcttctgtggctaacccaggtgtcacagttgttgatattgatggggatggtagcttcctcatgaacattcaggagttggcattgatccgcattgagaacctcccggtgaaggtgatggtgttgaacaaccaacatttgggtatggttgtgcaatgggaggataggttttacaaggcaaatagggcgcatacatacttgggcaacccagaatgtgagagcgagatatatccagattttgtgactattgctaaagggttcaatattcctgcagtccgtgtaacaaagaagagtgaagtccgtgccgccatcaagaagatgctcgagaccccagggccatacttgttggatatcatcgtcccacaccaggagcatgtgctgcctatgatcccaaatgagggcgcattcaaggacatgatcctggatggtgatggcaggactatgtattaatctataatctgtatgttggcaaagcaccagcccggcctatgtttgacctgaatgacccataaagagaagggcgacacgcgatgcag

实施例4：水稻m3突变体抗咪唑啉酮类除草剂(百垄通)

将扬州恢复系抗除草剂突变体1和扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3收获的种子播种出苗(此为m3)，待m3水稻幼苗长至3-4叶期时，喷施3ml百垄通/l水(推荐最低使用浓度为1ml百垄通/3l水，相当于9倍浓度)。喷施除草剂15天后，抗性苗m3呈正常绿色、能继续长高至20-30cm，而非抗性苗叶片失去绿色甚至部分枯黄，植株不长高，只有5-9cm。30天后，m3抗性株均呈正常绿色植株，而喷施同样浓度除草剂的野生型水稻都已全部枯死，表明突变水稻至少抗9倍浓度的百垄通除草剂。我们又对扬州恢复系抗除草剂突变体1和扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3喷施4ml百垄通/l水(相当于12倍浓度)进行鉴定，发现抗除草剂突变体1还是呈现正常绿色，而抗除草剂突变体2和抗除草剂突变体3部分植株已经枯黄。表明含有同时含有ser627位点和gly628位点突变的抗除草剂突变体1的抗除草剂能力比抗除草剂突变体2和抗除草剂突变体3都要好。

实施例5：水稻m3抗除草剂突变体的als酶活测定

为了验证水稻突变体的除草剂抗性是否由als突变所致，本发明人进行了als酶活性测定。测定方法参照singh等的方法(singhb.k.,stidhamm.a.,shanerd.l.assayofacetohydroxyacidsynthase.analyticalbiochemistry,1988,171:173-179.)。具体的，分别取野生型、扬州恢复系抗除草剂突变体1、扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3的m3植株叶片0.2g，在研钵中用液氮研磨粉碎，加入2ml提取液(100mmk2hpo4，ph7.5、10mm丙酮酸钠、5mmedta、1mm缬氨酸、1mm亮氨酸、10mm半胱氨酸、0.1mm黄素腺嘌呤二核苷酸、5mm氯化镁、10％(v/v)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解冻后继续研磨1min左右。12000rpm、4℃离心30min，吸取上清液，加入硫酸铵使之达到50％饱和度，于冰上放置半小时，12000rpm、4℃离心30min，弃上清，将沉淀溶解于0.2ml反应缓冲液(100mmk2hpo4,ph7.0、1mmedta、10mm氯化镁、100mm丙酮酸钠、1mm焦磷酸硫胺素、0.1mm黄素腺嘌呤二核苷酸)，分别得各植株的als提取液。

在获得als提取液中分别加入10μl除草剂“百垄通”(水剂，有效成分240g/l)，混匀，37℃孵育1h，加0.1ml3m硫酸终止反应，反应混合物在60℃反应孵育30分钟便于脱羧。然后加0.4ml显色液(0.09g/l1-萘酚和0.009g/l肌酸，用2.5mnaoh溶解)。混合液在37℃孵育30分钟进行显色(als催化2个丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰乳酸脱羧形成3-羟基丁酮，再与肌酸和1-萘酚形成粉红色复合物，该复合物在530nm处有最大吸收值)，随后测定其530nm的吸光度，als活性用a530吸光值表示，a530吸光值的高低反映als活性的高低。实验以水为对照，野生型、扬州恢复系抗除草剂突变体1和扬州抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3都各测5个单株。

a530吸光值测定结果发现，当野生型、扬州恢复系抗除草剂突变体1、扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3的als提取液中没有als抑制剂百垄通时，它们的a530吸光值均在1.2-1.4间，表明野生型和突变体的als酶活性无显著性差异(图3)；而加入als抑制剂百垄通后，野生型的a530吸光值仅为0.2，扬州恢复系抗除草剂突变体1的a530吸光值为1.28，扬州恢复系抗除草剂突变体2的a530吸光值为0.98，扬州恢复系抗除草剂突变体3的a530吸光值为0.97，即野生型的als酶活性仅为对照的16.4％，而扬州恢复系抗除草剂突变体1、抗除草剂突变体2和抗除草剂突变体3的als酶活性仍有75％以上(图3)，表明扬州恢复系抗除草剂突变体1、扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3的als对百垄通不敏感，从而赋予了抗性。从抗除草剂的效果来看，扬州恢复系抗除草剂突变体1的als活性比扬州恢复系抗除草剂突变体2高30％，比扬州恢复系抗除草剂突变体3高31％。因此扬州恢复系抗除草剂突变体1的抗除草剂效果比扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3都要好。

实施例6：转基因als水稻抗百垄通

设计特异引物5’-cgcggatccatccgagccacacatcgcctc-3’和5’-tccccgcggcctacggaaaacaacacac-3’，其5’分别加入bamhi和saci酶切修饰位点。参考实施例3的方法，通过pcr从上述水稻突变体扬州恢复系抗除草剂突变体1、扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3的基因组dna中扩增出突变als基因，测序正确后，用bamhi和saci分别双酶切突变als基因片段和植物表达载体pcambia1301质粒(购自pcambia公司)，酶切产物用t4-dna酶(购自takara公司)连接，连接产物转化大肠杆菌。重组质粒提取dna，用bamhi和saci双酶切验证，可以产生大的质粒片段和小的基因片段(图4)，证明已将核苷酸序列如seqidno.1或3或5所示的als基因克隆至植物表达载体pcambia1301质粒(购自pcambia公司)中。将构建好的质粒载体转化农杆菌eha105，培养菌体。采用常规的农杆菌介导法转化粳型水稻日本晴(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，pcr检测转基因植株(图5)。pcr检测引物为正向引物35sf5’-atggttagagaggcttacgc-3’，反向引物5r5’-agcaacaggtcagccttatccac-3’，扩增片段涵括camv35s启动子和als基因的5’端序列，大小约2kb。pcr扩增反应体系参考实施例3，pcr扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。扩增程序如下：预变性：98℃3min；30个循环：变性98℃10sec；延伸68℃2min；保温：72℃10min。经pcr鉴定呈阳性后，喷施3ml百垄通/l水(9倍推荐使用浓度)，7天后，参照实施例6所述方法测定als酶活性，发现转基因水稻的als酶活性显著高于非转基因水稻；30天后发现转基因水稻生长状态良好，而非转基因日本晴水稻则全部枯死。比较转化扬州恢复系抗除草剂突变体1、扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3的als基因的转基因水稻后代植株的als酶活性，发现含有扬州恢复系抗除草剂突变体1的als基因的转基因植株als酶活性比含有扬州恢复系抗除草剂突变体2的als基因的转基因植株的als酶活高32％，比含有扬州恢复系抗除草剂突变体3的als基因的转基因植株的als酶活高34％(图6)。

实施例7：转基因als烟草抗百垄通

设计特异引物5’-cgcggatccatccgagccacacatcgcctc-3’和5’-tccccgcggcctacggaaaacaacacac-3’，其5’分别加入bamhi和saci酶切修饰位点。通过pcr从扬州恢复系抗除草剂突变体1、扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3的基因组dna中扩增出突变als基因，测序正确后，参照实施例7方法将核苷酸序列如seqidno.1或3或5所示的als基因克隆至植物表达载体pcambia2301质粒(购自pcambia公司)中。挑选阳性克隆转化农杆菌eha105，采用常规的农杆菌介导法转化本氏烟叶盘，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，经pcr鉴定呈阳性后，喷施3ml百垄通/l水(9倍推荐使用浓度)，7天后，参照实施例6所述方法测定als酶活性，发现转基因烟草的als酶活性显著高于非转基因烟草；30天后发现转基因烟草生长状态良好，而非转基因烟草则全部枯死。比较转化扬州恢复系抗除草剂突变体1、抗除草剂突变体2和抗除草剂突变体3的als基因的转基因烟草后代植株的als酶活性，发现含有扬州恢复系抗除草剂突变体1的als基因的转基因植株als酶活性比含有扬州恢复系抗除草剂突变体2的als基因的转基因植株的高31％，比含有扬州恢复系抗除草剂突变体3的als基因的转基因植株的高27％(图7)。

实施例8：抗性材料的杂交和鉴定

为了检测是否具有2个突变位点的抗性植株比具有单个位点突变点的抗性植株的除草耐受能力更强，我们将实施例2中的单个位点突变进行杂交，选择仅含有ser627单个位点突变的扬州恢复系抗除草剂突变体2和仅含有gly628单个位点突变的的扬州恢复系抗除草剂突变体3在温室种植，开花期将扬州恢复系抗除草剂突变体2和扬州恢复系抗除草剂突变体3进行杂交。具体方法是将扬州恢复系突变体2人工去雄并套袋，扬州恢复系突变体3植株开花的时候，将颖壳剪掉，光下放置10分钟，将父本花粉抖到扬州恢复系突变体2的柱头上，重复2次，待种子成熟后收种，即为f1代杂交植株。收获的f1代杂交中繁殖一代后，收获f2代群体，在该群体中鉴定同时携带有ser627和gly628位点突变的个体。用除草剂对杂合植株以及抗除草剂突变体2和抗除草剂突变体3亲本同时进行喷施实验，结果表明，同时含有2个位点突变的植株相对于只含有单个位点突变的植株，对除草剂的抗性明显提高。我们又对杂合植株、抗除草剂突变体2和抗除草剂突变体3的als酶活进行测定，发现杂合植株的als酶活性比抗除草剂突变体2高31％，比抗除草剂突变体3高25％(图8)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。

sequencelisting

<110>江苏省农业科学院

<120>使植物具有除草剂抗性的水稻als突变型蛋白、基因及其应用

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<213>上游引物

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<213>下游引物

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