本发明涉及一株绿僵菌fm-03及其在防治粉蚧中的应用，属于生物防治技术领域。
背景技术：
粉蚧属半翅目（hemiptera）粉蚧科（pseudococcidae）害虫，寄主广，是热带和亚热带经济作物及温带温室植物的的重要害虫，引起落叶、落花和落果，分泌的蜜露可诱发煤烟病，使为害加重，直接或间接影响了作物的的产量、品质和经济价值，不易防治。目前，该虫的防控偏重于使用化学农药，易造成“3r”和药害问题。
生物防治是一种安全、有效、持久的控害方法，且虫生真菌挖掘利用已是害虫生防的重要发展方向之一。绿僵菌（metarhiziumspp.）是一种地理分布和寄主范围均比较广泛的虫生真菌，目前已有一些菌株被筛选用于防控粉蚧，如梁昌聪等（2008）从椰心叶甲（brontispalongissina）上分离得到的对菠萝粉蚧（dysmicoccusbrevipes）具强致死力的绿僵菌（metarhiziumsp.）j813菌株（安徽农业科学，cn：34-1076/s），黄俊生等（2012）报道了对甘蔗螟虫（chilovenosatus）和新菠萝灰粉蚧（dysmicoccusneobrevipes）等害虫具强致病力的金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）jf-6213菌株（zl201210274297.1），但这些菌株仅仅是绿僵菌属菌株中的一小部分，还有众多其他寄主和地理来源的高效菌株有待挖掘。本发明从受感染的暗黑鳃金龟（holotrichiaparallela）幼虫上分离得到一株金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fm-03菌株，该菌株生长性状好、产孢量大、孢子萌发率高，对粉蚧具良好的侵染致死效果，且对天敌相对安全，可以代替部分防控粉蚧的化学农药，减少化学农药的用量，有利于维护生态平衡。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一株绿僵菌fm-03及其在防治粉蚧中的应用，可用于防治粉蚧为害。
本发明提供的绿僵菌为金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fm-03，已于2017年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏在管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏号为：cgmccno.13774，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供了所述的绿僵菌fm-03在防治粉蚧中的应用。
以上述金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fm-03为活性成分的生物菌剂也属于本发明保护范围，该菌剂中还包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
所述绿僵菌fm-03接种于pda平板培养基，置于温度（25±1）℃、相对湿度（90±5）%、光周期l：d=12：12的光照培养箱内培养8d，形态特征：菌落近圆形，初期白色，后逐渐从中部产生暗绿色分生孢子层并变大；分生孢子层呈环状或放射状分布；菌丝分枝、具隔、无色光滑，宽1.6-2.3μm；分生孢子梗单生或分枝，宽2.1-2.6μm，分枝顶端具3-5个柱形的产孢细胞，大小为（7.4-13.3）μm×（2.2-2.9）μm；分生孢子长椭圆形、链状排列，大小为（6.2-8.7）μm×（1.9-3.0）μm；产孢量：1.53×109-3.21×109孢子/皿；相同培养条件下，分生孢子的萌发率：92.34-96.58%。
本发明的显著优点：本发明提供了一株绿僵菌fm-03，该绿僵菌生长性状好、产孢量大、孢子萌发率高，对粉蚧的侵染致死效果可达80%以上，且对天敌相对安全，具代替部分粉蚧化防农药的潜力，可减少化学农药的用量，有利于维护生态平衡。
具体实施方式
为使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中使用的的材料、试剂等耗材，如无特别说明，均可从商业途径购得。
实施例1
绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fm-03的分离和鉴定及其产孢量和孢子萌发率测定
1、试验方法
1）菌株分离：从福建漳州长泰县岩溪镇五四青年农场附近的堆肥中，采集自然罹病死亡的暗黑鳃金龟（holotrichiaparallela）幼虫，用灭菌手术刀将虫体表面的孢子粉刮入10ml无菌水中，经脱脂纱布过滤得孢子原液，再将孢子原液均匀涂布于pda平板培养基上，后置于温度（25±1）℃、相对湿度（90±5）%、光周期l：d=12：12的光照培养箱内培养8d。
2）形态学鉴定：所分离菌株培养8d后，先观察菌落和分生孢子层的特性，后用倒置显微镜观测菌株的菌丝宽度、分生孢子形态和大小及分生孢子梗形态和宽度等特征。
3）分子生物学鉴定：采用基因序列分析。所分离菌株培养8d后，用灭菌手术刀刮取培养基上的菌粉于2ml的epperdorf管中，称取0.1-0.2g菌粉，采用真菌基因组提取试剂盒提取菌体总dna。pcr扩增采用真菌its通用引物its1：5-tccgtaggtgaacctgcgg-3，its4：5-tcctccgcttattgatatgc-3对菌株基因组dna进行pcr扩增。pcr反应体系（25μl）：taqpcrmastermix12.5μl，模板dna2μl（100ng/μl），10μmol/l引物各1μl，加ddh2o至总体积达25μl；对照用ddh2o代替模板dna。pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min､58℃退火1min､72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸8min。actinpcr反应程序的退火温度为58℃，其余的与rdna-its相同。将pcr产物上样于含有gelred染料的琼脂糖凝胶中电泳后回收目的条带，送交上海杰李生物公司测序。利用ncbiblast对所测序列进行比对分析，选取genbank中与之同源性较高的菌株的its序列，利用clustalx软件对其进行多重比对，分析所分离菌株与参比菌株之间的序列相似性。
4）产孢量和孢子萌发率测定：所分离菌株培养8d后，取其中3个培养基，往每个培养皿中加入10ml的0.05%吐温-80无菌水作为润湿剂洗脱并收集分生孢子，经3层脱脂纱布过滤除去菌丝和杂质得3份孢子原液，用纽鲍尔血细胞计数在400倍的倒置生物显微镜下，统计每个培养基的产孢量；再分别将3份孢子原液稀释300倍，各取1ml稀释液分别均匀涂布于2%水琼脂平板培养基上，置于相同条件的光照培养箱内培养15h，后用400倍的倒置生物显微镜随机观察每个培养基3个视野，每个视野至少20个孢子，以孢子的芽管长度大于或等于孢子短轴直径为标准，统计孢子萌发率。
2、试验结果
1）形态学鉴定：所分离菌株的菌落近圆形，初期白色，后逐渐从中部产生暗绿色分生孢子层并变大；分生孢子层呈环状或放射状分布；菌丝分枝、具隔、无色光滑，宽1.6-2.3μm；分生孢子梗单生或分枝，宽2.1-2.6μm，分枝顶端具3-5个柱形的产孢细胞，大小为（7.4-13.3）μm×（2.2-2.9）μm；分生孢子长椭圆形、链状排列，大小为（6.2-8.7）μm×（1.9-3.0）μm。通过形态学初步鉴定为金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）。
2）分子生物学鉴定：通过ncbiblast对所测序列（序列如seqidno.1）进行比对分析，选取genbank中与之同源性较高的菌株的its序列，利用clustalx软件对其进行多重比对，得出所分离菌株为金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）。
3）产孢量和孢子萌发率测定：在3个培养基中，所分离菌株的产孢量达1.53×109-3.21×109孢子/皿；分生孢子的萌发率达90.44-93.58%（表1）。
表1绿僵菌fm-03的产孢量和孢子萌发率
实施例2
绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fm-03对柑桔粉蚧（长尾粉蚧pseudococcuslongispinus）、番荔枝粉蚧（南洋臀纹粉蚧planococcuslilacinus）和多肉植物粉蚧（石蒜绵粉蚧phenacoccussolani）等粉蚧的侵染致死效果
1、试验方法：取（实施例1）分离所得的金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fm-03，接种于pda平板培养基上，置于温度（25±1）℃、相对湿度（90±5）%、光周期l：d=12：12的光照培养箱内培养8d；往培养皿中加入10ml含0.05%吐温-80的无菌水脱溶孢子，经3层脱脂纱布过滤得孢子原液；用纽鲍尔血细胞计数板在生物显微镜下统计孢子原液的孢子数并计算孢子浓度，再用无菌水将孢子原液稀释成1.00×104、1.00×105、1.00×106、1.00×107和1.00×108孢子/ml等5个浓度，以0.05%吐温-80无菌水作空白对照，共6个处理，每个处理重复3次。取54个培养皿，均分为3组，均铺入1片湿润的滤纸，每组中的每3个培养皿为1个处理浓度，每个培养皿即为1次重复；在3组培养皿中，分别再放入1片带叶柄的柑桔嫩叶、番荔枝嫩叶和多肉植物嫩叶，叶柄均用湿棉花包裹并紧贴滤纸；接着用毛笔往每个处理浓度的菌液中挑取同一日龄的柑桔粉蚧成虫、番荔枝粉蚧成虫和多肉植物粉蚧成虫各90头，浸泡10s后挑到滤纸上，晾干2min后再分别均分挑到对应3个培养皿的寄主嫩叶上（既每个重复30头），盖上培养置，置于与上述相同条件的光照培养箱内，每日观察、记录死虫数，以死亡虫体长出菌丝计为有效感染，每次记录后挑除死亡虫体，8d后统计3种粉蚧成虫的累计校正死亡率（%）。
2、试验结果：由表2可知，绿僵菌fm-03均能有效侵染3种粉蚧，但不同处理浓度的侵染致死效果存在明显差异。针对柑桔粉蚧，其中1.00×107孢子/ml和1.00×108孢子/ml两个处理浓度的侵染致死效果高，分别达74.73%和80.87%，两者差异不显著，但显著高于其他3个处理浓度；其后依次是1.00×106孢子/ml、1.00×105孢子/ml和1.00×104孢子/ml处理，侵染致死效果相对低，且相互间差异显著。针对番荔枝粉蚧和多肉植物粉蚧，其中1.00×108孢子/ml处理的侵染致死效果高均最高，分别达83.72%和80.58%，均显著高于同组试验内的其他4个处理浓度；1.00×107孢子/ml处理的侵染致死效果位居其次，分别高达75.58%和72.71%；其后均依次是1.00×106孢子/ml、1.00×105孢子/ml和1.00×104孢子/ml处理，侵染致死效果相对低，相互间差异显著。可见，绿僵菌fm-03对3种粉蚧具良好的侵染致死效果，推荐使用1.00×107孢子/ml或更高的处理浓度。
表2绿僵菌fm-03对3种粉蚧的侵染致死效果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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<110>福建省农业科学院植物保护研究所
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