本发明属于医药及食品化工技术领域，具体涉及一种基于黑曲霉细胞催化芦丁水解制备异槲皮苷的方法。
背景技术：
异槲皮苷是一种黄酮醇类化合物，具有抗氧化、抗病毒，以及增加雌性激素的分泌等性质，因此常被用作食品添加剂或辅助药物。在日本和美国，异槲皮苷已被准许作为食品添加剂使用。近年来研究表明，它还具有调节血脂和血糖、利尿、抗抑郁和预防骨质疏松等多种功能活性。
自然界中，异槲皮苷存量很少，在植物中的含量仅十万分之几到万分之几，而且提取十分困难。如专利（cn00808993）公开的从生物类黄酮中回收异槲皮苷方法，即从生物类黄酮浆（回收类黄酮的母液残余物）中采用乙酸乙酯和水的混合溶剂提取，但由于类黄酮浆中含有槲皮素、异槲皮素以及其他类似物，分离纯化很困难；单纯采用溶剂萃取法难以实现低成本制备异槲皮苷。相比较于异槲皮苷，芦丁实在自然界总分布非常广泛，在很多植物的根、茎、叶、花、果实、种子中都有存在。在槐米、芸香、荞麦、沙棘、银杏、枸杞、益母草、芦荟、桉树叶和烟叶等多种常见的中草药植物中都含有芦丁，其中以槐米、荞麦含量最高，我国主要提取芦丁的原料是槐米，其含量在20%以上。在结构上，芦丁是由异槲皮苷（isoquercitrin）和芸香糖连接而成。通过化学法催化芦丁的去糖基化反应是制备异槲皮苷的重要方式。目前常规水解方法是利用强酸对芦丁进行水解，如使用磷酸、盐酸和硫酸或其混合酸试剂可以对芦丁进行水解（wangj,zhaoll,sungx,etal.acomparisonofacidicandenzymatichydrolysisofrutin[j].africanjournalofbiotechnology,2011,10(8):1460-1466.）；为了提高酸水解效率，还有报道提出采用加压水解法（于婷,付绍平,肖远胜,等.高压水解芦丁分离制备异槲皮苷[j].大连工业大学学报,2013(2).），如专利(cn1817876)中公开的采用芦丁制备异槲皮苷的方法,即在高压反应釜中投入芦丁浆液,加热至沸,采用加压水解获得水解产物槲皮素和异槲皮苷；但由于采用该方法时，芦丁的水解过程中槲皮素和异槲皮苷共存,必须对水解产物进行分离去除槲皮素，才能获得异槲皮苷。不仅如此，化学法由于条件苛刻，引入溶剂多，对设备条件要求高，且容易对环境造成污染。在专利cn101985639a中，提出了采用酶技术催化芦丁水解，加入α-l-鼠李糖苷酶催化水解芦丁分子中的鼠李糖,实现异槲皮苷合成。为了获得具有高效催化芦丁水解活性的酶，还有研究（专利cn1483825）提出先利用微生物发酵产胞外酶，发酵液经提纯分离后，所制备的酶与芦丁进行反应。上述这些酶法，均采用纯酶作为催化剂。由于纯酶均需要经微生物发酵、提取等步骤获取，工艺复杂，且对反应条件要求较高；成本高，难以付诸于大规模工业化使用。
目前为止还没有采用微生物细胞直接催化芦丁水解反应高选择性合成异槲皮苷的相关报道。
技术实现要素：
针对目前异槲皮苷制备方法上存在的缺点和不足，本发明提供了一种基于黑曲霉细胞催化芦丁水解制备异槲皮苷的方法；该方法采用黑曲霉细胞为催化剂，芦丁为反应原料，实现异槲皮苷的高选择性合成。该方法具有条件温和、产物得率高、环境友好，成本低等优点,克服了传统化学催化法需要在高温高压下，由酸或碱催化完成,对设备要求高,且对环境造成污染的缺点；同时，也克服了酶技术需要发酵-分离提纯等繁琐步骤，成本高难以工业化应用的不足，黑曲霉细胞易获取，且与反应介质都可以重复利用，降低成本，有利于工业化生产，可有效推动异槲皮苷在医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用。
本发明的原理是黑曲霉的整细胞可作为生物催化剂，选择性催化水解芦丁分子中的鼠李糖，将芦丁水解为经济价值更高、药理活性更好的异槲皮苷。该方法采用生物催化剂，可一步法实现异槲皮苷的制备合成，方法简单，环境友好，操作安全；考虑到异槲皮苷良好的医用、食品用现状，本方法极具工业应用价值。
本发明的目的通过以下技术方法得以实现:
一种基于黑曲霉细胞催化芦丁水解制备异槲皮苷的方法，包括如下步骤：
（1）在缓冲溶液中加入有机溶剂，混匀后加入芦丁，再加入黑曲霉细胞作为催化剂催化芦丁水解反应；
（2）反应结束后，将反应液过滤，然后减压蒸馏得到粗产物，再分离提纯得到异槲皮苷。
优选的，步骤（1）所述缓冲溶液为醋酸缓冲溶液或者柠檬酸缓冲溶液。
优选的，步骤（1）所述缓冲溶液的ph值为2.0~6.0。
优选的，步骤（1）所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙醇。
优选的，步骤（1）所述有机溶剂与缓冲溶液的体积比为1:1~5:1.
优选的，步骤（1）所述芦丁与黑曲霉细胞催化剂的干重比为1:0.5~1:5。
优选的，步骤（1）所述水解反应的温度为20~50℃。
优选的，步骤（1）所述水解反应的时间为6~72小时。
优选的，步骤（1）所述水解反应的振荡速率为60~220r/min。
优选的，步骤（2）中采用柱层析或者薄层层析将粗产物分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1。
相对于现有技术，本发明具有以下优点和效果：
1、与现有提取法制备异槲皮苷的技术相比，本发明制备异槲皮苷的原料经济易得，成本低，异槲皮苷产率高。
2、与现有化学法催化芦丁水解制备异槲皮苷的技术相比，本方法采用黑曲霉细胞作为生物催化剂，避免了酸碱、重金属等有毒、高污染的化学催化剂的使用，且反应条件温和、对制备设备和环境的要求低、环境友好。
3、与现有的酶催化制备技术相比，本方法直接采用微生物细胞作为催化剂，省略了纯酶催化剂需要微生物细胞发酵、分离提取及固定化等多步制备过程，大大降低了制备成本，有利于工业化应用。
4、该方法简单易操作，产物单一，产物纯度高，细胞催化剂及反应介质可回收重复使用，成功实现了从低成本、存量大的底物简单地经过一步法水解反应，生成高经济价值、自然界存量小的异槲皮苷，制备方法有利于工业化应用。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，需说明的是，本发明的实施方式不限于此，这些实施例不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
在10ml带塞三角瓶中加入总体积为2ml的甲醇和0.2mol/lph为2.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液的混合溶液（二者体积比1：1），加入20mg芦丁水合物混合均匀，再加入黑曲霉细胞aspergillusnigergim3.25(广东省微生物研究所)作为催化剂（芦丁与黑曲霉细胞干重比1:0.5）启动反应，在20℃、振荡速率60r/min的条件下，反应6h后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物经薄层层析分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1，得到异槲皮苷；芦丁转化率为10%，芦丁纯度99%。
实施例2
在10ml带塞三角瓶中加入总体积为2ml的甲醇和0.2mol/lph为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液的混合溶液（二者体积比5：1），加入20mg芦丁水合物混合均匀，再加入黑曲霉细胞aspergillusnigergim3.25作为催化剂（芦丁与黑曲霉细胞干重比1:3）启动反应，在50℃、振荡速率140r/min的条件下，反应36h后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物经薄层层析分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1，得到异槲皮苷；芦丁转化率为30%，芦丁纯度99%。
实施例3
在10ml带塞三角瓶中加入总体积为2ml的乙醇和0.2mol/lph为6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液的混合溶液（二者体积比3：1），加入20mg芦丁水合物混合均匀，再加入黑曲霉细胞aspergillusnigergim3.25作为催化剂（芦丁与黑曲霉细胞干重比1:5）启动反应，35℃、振荡速率220r/min的条件下，反应72h后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物经薄层层析分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1，得到异槲皮苷；芦丁转化率为99%，芦丁纯度99%。
实施例4
在10ml带塞三角瓶中加入总体积为2ml的甲醇和0.2mol/lph为6.0的柠檬酸缓冲溶液的混合溶液（二者体积比5：1），加入20mg芦丁水合物混合均匀，再加入黑曲霉细胞aspergillusnigergim3.25作为催化剂（芦丁与黑曲霉细胞干重比1:0.5）启动反应，20℃、振荡速率140r/min的条件下，反应24h后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物经薄层层析分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1，得到异槲皮苷；芦丁转化率为65%，芦丁纯度99%。
实施例5
在10ml带塞三角瓶中加入总体积为2ml的甲醇和0.2mol/lph为4.0的柠檬酸缓冲溶液的混合溶液（二者体积比1：1），加入20mg芦丁水合物混合均匀，再加入黑曲霉细胞aspergillusnigergim3.25作为催化剂（芦丁与黑曲霉细胞干重比1:5）启动反应，40℃、振荡速率60r/min的条件下，反应72h后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物经薄层层析分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1，得到异槲皮苷；芦丁转化率为99%，芦丁纯度99%。
实施例6
在10ml带塞三角瓶中加入总体积为2ml的丙醇和0.2mol/lph为2.0的柠檬酸缓冲溶液的混合溶液（二者体积比3：1），加入20mg芦丁水合物混合均匀，再加入黑曲霉细胞aspergillusnigergim3.25作为催化剂（芦丁与黑曲霉细胞干重比1:3）启动反应，35℃、振荡速率220r/min的条件下，反应72h后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物经薄层层析分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1，得到异槲皮苷；芦丁转化率为70%，芦丁纯度99%。
实施例7
在10ml带塞三角瓶中加入总体积为2ml的乙醇和0.2mol/lph为4.0的柠檬酸缓冲溶液的混合溶液（二者体积比1：1），加入20mg芦丁水合物混合均匀，再加入黑曲霉细胞aspergillusnigergim3.25作为催化剂（芦丁与黑曲霉细胞干重比1:5）启动反应，35℃、振荡速率140r/min的条件下，反应12h后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物经薄层层析分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1，得到异槲皮苷；芦丁转化率为70%，芦丁纯度99%。
实施例8
在10ml带塞三角瓶中加入总体积为2ml的甲醇和0.2mol/lph为5.0的醋酸缓冲溶液的混合溶液（二者体积比1：1），加入20mg芦丁水合物混合均匀，再加入黑曲霉细胞aspergillusnigergim3.25作为催化剂（芦丁与黑曲霉细胞干重比1:3）启动反应，35℃、振荡速率220r/min的条件下，反应48h后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物经薄层层析分离纯化，所用层析剂为乙酸乙酯、丁酮、甲醇和水，体积比为10:7:1:1，得到异槲皮苷；芦丁转化率为99%，芦丁纯度99%。