本发明属于医药及食品化工技术领域，具体涉及一种基于黑曲霉细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的方法。
背景技术：
柚皮素(naringenin)是一种广泛存在于芸香科植物中的二氢黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗纤维化等多种药理活性，因此常被用作食品添加剂或辅助药物。近年来研究表明，它还具有抗心律失常、镇咳、预防动脉粥样硬化、免疫调节脂肪代谢、抗衰老、保护肝功能以及类雌激素等多种功能活性。
自然界中，柚皮素一般以柚皮苷的形式存在于自然界蔷薇科、芸香科、柑橘属植物中，其来源广泛，但是含量均极其低，而且提取十分困难。为提高柚皮素提取率，陈雪峰等采用超临界co2萃取技术从桃叶中提取分离出柚皮素，平均得率可达2.18%，获得了品质优良的柚皮素提取物产品，但是萃取物中含有大量的叶绿素，导致产品外观颜色为绿色，产物纯度极低（陈雪峰,刘迪,李欣.超临界co2萃取桃叶中柚皮素的工艺研究[j].食品科学,2007,28(1):106-109.）。除了直接提取法之外，通过化学法催化柚皮苷去糖基化反应也是制备柚皮素的重要方式。相比较于柚皮素，柚皮苷在自然界中分布非常广泛，在芸香科植物柚、葡萄柚、胡柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮中都有存在。在结构上，柚皮苷是由柚皮素和糖环连接而成。目前，常用的通过柚皮苷水解方法制备柚皮素的方法,采用强酸作为催化剂进行。如，刘亚萍等报道使用2%的硫酸试剂在直火加热条件下催化柚皮苷水解反应，柚皮素得率较低（刘亚萍.柚皮素的制备方法研究[j].光谱实验室,2008,25(6):1292-1294.）；专利cn102453011a提出，使用低级醇或低级酮溶液萃取柚皮苷，采用酸法使得溶液中的柚皮苷在酸性条件下发生酸水解获得柚皮素，所得柚皮素产率较低，纯度为99%。但采用该方法时，柚皮苷的水解过程中普鲁宁和柚皮素共存,必须对水解产物进行分离去除普鲁宁，才能获得柚皮素。不仅如此，化学法由于条件苛刻，引入溶剂多，对设备条件要求高，且容易对环境造成污染。针对化学法的不足，有研究进行了绿色的酶催化剂在柚皮素制备中的应用。专利cn105838622a提出，可利用黑曲霉hc306发酵产胞外酶，从发酵液中分离提纯酶，经提纯分离后，获得了一种胞外糖苷酶，该酶可以催化柚皮苷水解获得柚皮素。该方法具有生物催化过程反应条件温和、绿色等优势，但采用纯酶作为催化剂，需要经微生物培养、发酵、提取、纯化等一系列步骤获取，工艺复杂；成本高，难以付诸于大规模工业化使用。
目前为止还没有利用微生物整细胞直接催化芦丁水解反应高选择性合成柚皮素的相关报道。
技术实现要素：
针对目前柚皮素制备方法上存在的缺点和不足，本发明提供了一种基于黑曲霉细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的方法；该方法采用黑曲霉细胞为催化剂，柚皮苷为反应原料，实现柚皮素的高选择性合成。该方法具有条件温和、产物得率高、环境友好，成本低等优点,克服了传统化学催化法需要在高温高压下，由酸或碱催化完成,对设备要求高,且对环境造成污染的缺点；同时，也克服了纯酶催化技术需要经微生物培养、发酵、提取、纯化等一系列步骤获取，工艺复杂、成本高等缺点，直接采用微生物整细胞进行反应，简单易得，且黑曲霉细胞及反应介质都可以重复利用，大大降低制备成本，有利于工业化生产；采用该技术可有效推动柚皮素在医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用。
本发明的原理是采用直接完整黑曲霉细胞作为生物催化剂，选择性催化水解柚皮苷分子中的糖苷键，将柚皮苷水解为经济价值更高、药理活性更好的柚皮素。该方法采用生物催化剂，可一步法实现柚皮素的制备合成，方法简单，环境友好，操作安全，极具工业应用价值。
本发明的目的通过以下技术方法得以实现。
一种基于黑曲霉细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的方法，包括如下步骤：
（1）在缓冲溶液中加入有机溶剂或者离子液体，混匀后加入柚皮苷，再加入黑曲霉细胞作为催化剂催化柚皮苷水解反应；
（2）反应结束后，将反应液过滤，再将滤液减压蒸馏得到粗产物，粗产物分离提纯得到柚皮素。
优选的，步骤（1）所述缓冲溶液为醋酸缓冲溶液或者柠檬酸缓冲溶液。
优选的，步骤（1）所述缓冲溶液的ph值为3.0~7.0。
优选的，步骤（1）所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜或吡啶。
优选的，步骤（1）所述离子液体为[bmim]bf4、[emim]bf4、[bmim]cl、[emim]cl、[bmim]br或[hmim]br。
优选的，步骤（1）所述有机溶剂或离子液体与缓冲溶液的体积比为1:1~5:1。
优选的，步骤（1）所述柚皮苷与黑曲霉细胞的干重比为1:0.5~1:10，进一步优选为1:1~1:10。
优选的，步骤（1）所述水解反应的温度为20~50℃。
优选的，步骤（1）所述水解反应的时间为0~48小时，进一步优选为6~48小时。
优选的，步骤（2）所述粗产物用溶剂萃取法进行分离纯化，采用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下减压蒸干乙酸乙酯后,再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥,即得柚皮素。
相对于现有技术，本发明具有以下优点和效果：
（1）与现有提取法制备柚皮素的技术相比，本发明制备柚皮素的原料经济易得，成本低，柚皮素产率高。
（2）与现有化学法催化柚皮苷水解制备柚皮素的技术相比，本方法采用黑曲霉细胞作为生物催化剂，避免了酸碱、重金属等有毒、高污染的化学催化剂的使用，且反应条件温和、对制备设备和环境的要求低、环境友好。
（3）与现有的酶催化制备技术相比，本方法采用直接采用微生物细胞作为催化剂，省略了纯酶催化剂需要微生物细胞发酵、分离提取及固定化等多步制备过程，大大降低了制备成本，有利于工业化应用。
（4）本发明的方法简单易操作，产物单一，产物纯度高，细胞催化剂及反应介质可回收重复使用，成功实现了从低成本、存量大的底物简单地经过一步法水解反应，生成高经济价值、自然界存量小的柚皮素，制备方法有利于工业化应用。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，需说明的是，本发明的实施方式不限于此，这些实施例不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
在10ml带塞三角瓶中加入10mg柚皮苷，总体积为2ml的甲醇与0.2mol/lph为3.0的柠檬酸缓冲溶液的混合物（甲醇与缓冲液体积比为1:1），混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25(广东省微生物研究所)作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:0.5）启动反应，20℃、振荡速率60r/min的条件下，反应48h。反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液在40℃下再次减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。反应柚皮苷转化率为34%，产物柚皮素纯度为98%。
实施例2
在10ml带塞三角瓶中加入10mg柚皮苷，总体积为2ml的二甲基亚砜与0.2mol/lph为5.0的醋酸缓冲溶液的混合物（二甲基亚砜与缓冲液体积比为5:1），混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:5）启动反应，35℃、振荡速率220r/min的条件下，反应24h。反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。反应柚皮苷转化率为68%，产物柚皮素纯度为98%。
实施例3
在10ml带塞三角瓶中加入10mg柚皮苷，总体积为2ml的离子液体[bmim]bf4与0.2mol/lph为5.0的柠檬酸缓冲溶液的混合物（[bmim]bf4与缓冲液体积比为1:1），混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:10）启动反应，40℃、振荡速率140r/min的条件下，反应48h。反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。反应柚皮苷转化率为98%，产物柚皮素纯度为98%。
实施例4
在10ml带塞三角瓶中加入10mg柚皮苷，再加入总体积为2ml的离子液体[emim]bf4与0.2mol/lph为7.0的柠檬酸缓冲溶液的混合物（[emim]bf4与缓冲液体积比为5:1），混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:5）启动反应，50℃、振荡速率140r/min的条件下，反应6h。反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。反应柚皮苷转化率为36%，产物柚皮素纯度为97%。
实施例5
在2个5ml带塞三角瓶中分别加入10mg柚皮苷，编号①、②，①中加入总体积为1ml的[bmim]bf4与缓冲溶液([bmim]bf4与缓冲液体积比为1:1)进行溶解，②中加入总体积为1ml的[emim]bf4与缓冲溶液([emim]bf4与缓冲液体积比为1:1)进行溶解，缓冲溶液为0.2mol/lph值为5.0的柠檬酸缓冲溶液，混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:10）启动反应，20℃、振荡速率140r/min的条件下，反应48h，反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反应液中柚皮苷转化率为98%，产物柚皮素纯度为95%；[emim]bf4反应液中柚皮苷转化率为99%，产物柚皮素纯度为98%；。
实施例6
在2个5ml带塞三角瓶中分别加入10mg柚皮苷，编号①、②，①中加入总体积为1ml的[bmim]bf4与缓冲溶液([bmim]bf4与缓冲液体积比为3:1)进行溶解，②中加入总体积为1ml的[emim]bf4与缓冲溶液([emim]bf4与缓冲液体积比为2:1)进行溶解，缓冲溶液为0.2mol/lph值为7.0的柠檬酸缓冲溶液，混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:5）启动反应，20℃、振荡速率60r/min的条件下，反应48h，反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反应液中柚皮苷转化率为96%，产物柚皮素纯度94%；[emim]bf4反应液中柚皮苷转化率为97%，产物柚皮素纯度为97%。
实施例7
在2个5ml带塞三角瓶中分别加入10mg柚皮苷，编号①、②，①中加入总体积为1ml的[bmim]bf4与缓冲溶液([bmim]bf4与缓冲液体积比为3:1)进行溶解，②中加入总体积为1ml的[emim]bf4与缓冲溶液([emim]bf4与缓冲液体积比为1:1)进行溶解，缓冲溶液为0.2mol/lph值为3.0的醋酸缓冲溶液，混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:5）启动反应，20℃下、振荡速率140r/min的条件下，反应48h，反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反应液中柚皮苷转化率为87%，产物柚皮素纯度96%；[emim]bf4反应液中柚皮苷转化率为89%，产物柚皮素纯度为98%；。
实施例8
在2个5ml带塞三角瓶中分别加入10mg柚皮苷，编号①、②，①中加入总体积为1ml的[bmim]bf4与缓冲溶液([bmim]bf4与缓冲液体积比为5:1)进行溶解，②中加入总体积为1ml的[emim]bf4与缓冲溶液([emim]bf4与缓冲液体积比5:1)进行溶解，缓冲溶液为0.2mol/lph值为7.0的柠檬酸缓冲溶液，混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:10）启动反应，35℃、振荡速率220r/min的条件下，反应48h，反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反应液中柚皮苷转化率为85%，产物柚皮素纯度97%；[emim]bf4反应液中柚皮苷转化率为89%，产物柚皮素纯度为98%；。
实施例9
在2个5ml带塞三角瓶中分别加入10mg柚皮苷，编号①、②，①中加入总体积为1ml的[bmim]bf4与缓冲溶液([bmim]bf4与缓冲液体积比为1:1)进行溶解，②中加入总体积为1ml的[emim]bf4与缓冲溶液([emim]bf4与缓冲液体积比为1:1)进行溶解，缓冲溶液为0.2mol/lph值为7.0的醋酸缓冲溶液，混合均匀后加入黑曲霉细胞gim3.25作为催化剂（底物柚皮苷与黑曲霉细胞干重比为1:10）启动反应，20℃、振荡速率220r/min的条件下，反应48h，反应结束后，反应液过滤去除菌体，滤液用等体积的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次减压蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解残留物，过滤，滤液在40℃下减压干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反应液中柚皮苷转化率为94%，产物柚皮素纯度98%；[emim]bf4反应液中柚皮苷转化率为99%，产物柚皮素纯度为97%。