一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂与流程

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种快速区分兔瘟病毒(rhv)、仙台病毒(sv)和兔轮状病毒(lrv)的多重荧光免疫分析方法及试剂。

背景技术：

兔瘟病毒又称兔出血热病毒(rabbithemorrhagicdiseasevirus，rhv)可引起兔以呼吸系统出血、实质器官水肿、淤血及出血变化为特征的烈性传染病，该病传播速度快、发病急、发病率和死亡率极高，而被世界动物卫生组织列为b类动物传染病，被我国农业部兽医局列为二类动物疫病。兔轮状病毒(lapinerotavirus，lrv)为呼肠孤病毒科轮状病毒属成员，是导致家兔急性病毒性胃肠炎的主要原因，被认为只是一种温和型病原，但与其他病毒、细菌和寄生虫混合感染容易造成的暴发性肠炎，且流行病学调查发现其在兔群中具有较高的感染率，是当前严重威胁我国养兔业健康发展及阻碍我国实验动物标准化进程的重要病原体。仙台病毒(sendaivirus，sv)属于副粘病毒科呼吸道病毒属病毒，是引起啮齿动物细小系统疾病的主要病因，主要靠空气传播和直接接触传播，较高的相对湿度和较慢的空气流通速度可促进其传染，并难以从感染群体中清除，是实验啮齿类动物最难控制的疾病之一。

rhv、sv和lrv是兔病毒性传染病暴发流行的比较重要的病原体，这三种病毒是国标要求的必检项目。目前，国内外已建立了多种检测诊断方法，如电镜观察、ha和hi实验、琼脂糖扩散试验、荧光抗体技术及elisa等，此类检测方法操作简便，适用于普通病原抗体检测，但是具有较高的假阳性和假阴性，准确度和灵敏性有限。

随着分子生物学的快速发展，多重pcr已广泛应用于动物病毒混合感染的鉴别诊断，其原理是设计能够同时扩增出多种待测病原特定片段大小的多对引物，在pcr反应体系中加入多对引物，能够对多种病原进行鉴别诊断。多重rt-pcr因其灵敏性、特异性和操作的简单性被广泛应用于动物病毒的混合感，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性，而多重pcr是靠片段的大小来区别的，一般到了三重及以上，片段大小差别大，其每种病毒的扩增效率不一样，造成结果存在偏差。

技术实现要素：

本发明的目的在于一种快速区分rhv、sv、lrv的多重荧光免疫分析方法及试剂。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速区分rhv、sv和lrv的多重荧光免疫分析方法的引物，所述引物核苷酸序列如下所示：

rhv引物r1：5’-ctctccacaaaataacccattcaca-3’(seqidno：1)；

rhv引物r2：5’-ccaaccctggtccaatctcg-3’(seqidno：2)；

sv引物s1：5’-tgacaacaaacggagtaaacgc-3’(seqidno：3)；

sv引物s2：5’-accataggtccaaacagccattc-3’(seqidno：4)；

lrv引物l1：5’-atggttcgcttgtgtcttagttg-3’(seqidno：5)；

lrv引物l2：5’-atgcgttgggtgtagttcctgta-3’(seqidno：6)。

优选的，引物r1、s1和l1的5’端还通过间隔臂连接有tag序列。

优选的，引物r1、s1和l1的5’端的tag序列分别为：

引物r1的tag序列为：5’-cttaaactctacttacttctaatt-3’(seqidno：7)；

引物s1的tag序列为：5’-ctaaacatacaaatacacatttca-3’(seqidno：8)；

引物l1的tag序列为：5’-tactacttctataactcacttaaa-3’(seqidno：9)。

优选的，引物r2、s2和l2的5’端添加有生物素标记。

一种快速区分rhv、sv和lrv的多重荧光免疫分析的试剂，该试剂中含有上述任一项所述的引物。

优选的，该试剂中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、3种编码不同荧光色的荧光编码微球。

优选的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列。

一种快速区分rhv、sv和lrv的多重荧光免疫分析的方法，包括如下步骤：

从待测样品中提取病毒rna，以rna为模板，用权利要求1～4任一项所述的引物进行rt-pcr扩增；

将扩增产物、3种编码不同荧光色的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；

杂交结束后，对杂交产物进行分析，确定其病毒的类型；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

优选的，rt-pcr扩增的反应体系为：

rt-pcr扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s；循环30次；72℃终延伸10min。

优选的，所述杂交的反应体系和程序为：

45℃反应30min。

本发明的有益效果是：

本发明方法可以同时对兔瘟病毒、仙台病毒和轮状病毒进行检测，通过pcr获得目标扩增片段，再将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白(sa-pe)进行杂交，然后通过检测仪读取mfi值时，分辩不同类型的病原。

本发明方法，能够同时对兔瘟病毒、仙台病毒和轮状病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明tag技术能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。

本发明的引物，对兔瘟病毒(rhv)、仙台病毒(sv)和轮状病毒(lrv)，均有很好的扩增性，及特异性，除可以与rhv、sv和lrv结合外，不与其他常见的兔病毒及细菌核酸结合，特异性强，准确性高。

附图说明

图1是兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒三种病毒质粒pcr的电泳图；

图2是兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒三种病毒质粒多重荧光免疫分析方法检测实验结果图；

图3是兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒三种病毒质粒多重荧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图；

图4是兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒三种病毒质粒多重荧光免疫分析方法检测特异性实验结果图；

图5是兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒三种病毒样品多重荧光免疫分析方法检测实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但不局限于此。

实施例1一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法的引物

经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对r1和r2、s1和s2、l1和l2对同时快速检测兔瘟病毒(rhv)、仙台病毒(sv)和兔轮状病毒(lrv)的效果最好，其核苷酸序列如下所示：

rhv引物r1：ctctccacaaaataacccattcaca(seqidno：1)；

rhv引物r2：ccaaccctggtccaatctcg(seqidno：2)；

sv引物s1：tgacaacaaacggagtaaacgc(seqidno：3)；

sv引物s2：accataggtccaaacagccattc(seqidno：4)；

lrv引物l1：atggttcgcttgtgtcttagttg(seqidno：5)；

lrv引物l2：atgcgttgggtgtagttcctgta(seqidno：6)。

本发明采用多重荧光免疫分析的方法对3种rhv、sv、lrv病原进行区分，故将上述引物作进一步的修饰，以满足相应的操作要求。其中引物r1、s1和l1的5’端通过间隔臂连接有tag序列，分别为：

引物r1的tag序列为：cttaaactctacttacttctaatt(seqidno：7)；

引物s1的tag序列为：ctaaacatacaaatacacatttca(seqidno：8)；

引物l1的tag序列为：tactacttctataactcacttaaa(seqidno：9)。

此外，引物r2、s2和l2的5’端还添加有生物素标记。

实施例2一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法的试剂

该试剂包括下列组分：

(1)实施例1所设计的用于多重荧光免疫分析的引物；

(2)3种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物中的tag序列互补配对；3种微球均购自luminex公司，其中rhv、sv、lrv分别对应的荧光编码微球号为mtag-a056、mtag-a062和mtag-029；

(3)链霉亲和素-藻红蛋白复合物。

实施例3兔瘟病毒、仙台病毒、兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法检测方法的建立

1、兔瘟病毒、仙台病毒、兔轮状病毒质粒的构建

用试剂盒minibestviralrna/dnaextractionkitver.4.0分别提取rhv、sv、lrv病毒的rna，反转录成cdna，分别用上述的引物对r1和r2、s1和s2、l1和l2进行pcr扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。用takara公司的试剂盒将纯化后的cdna连接至pmd-19t载体中，将连接产物转化至dh5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落pcr鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。

2、质粒pcr扩增

用实施例1所述的引物对r1和r2、s1和s2、l1和l2进行单重、两重、三重pcr扩增。

上游引物混合液的制备：将r1、s1和l1以1:1:1比例进行混合；下游引物混合液的制备：将r2、s2和l2以1:1:1比例进行混合。利用rhv、sv、lrv三种病原的特异性模板，以及两重模板、三重模板对上述三种病毒的特应性区域进行扩增。其中两重模板的制备：将两两质粒以1:1的比例进行混合，三重模板的制备：将三种质粒以1:1:1的比例进行混合。

pcr扩增反应体系如下：

扩增的反应程序为：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；

72℃终延伸10min。

pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。图中，m：100bpdnaladdermarker，1：rhv，2：sv，3：lrv，4：rhv+sv，5：rhv+lrv，6：sv+lrv，7：rhv+sv+lrv，8：pcrblank。

从图1中可以看出，rhv的扩增产物大小约为161bp，sv的扩增产物大小约为148bp，lrv的扩增产物大小约为261bp，由于rhv和sv的扩增产物大小相近，所以多重pcr扩增产物的电泳条带难以清晰分辨。

3、将所得pcr产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白(sape)工作液杂交，包括以下步骤：

分别包被有特异anti-tag序列的3种微球，其中anti-tag序列能相应地与rhv、sv和lrv三种病毒引物上的tag序列互补配对。三种微球均购自luminex公司，具体的rhv、sv和lrv分别对应的荧光编码微球号为mtag-a056、mtag-a062和mtag-029。

荧光编码微球工作液的制备：将2500个/μl荧光编码微球用1.1×tmhybrdizationbuffer稀释到1μl约含有125个/种荧光编码微球。

sape工作液制备：将1mg/mlsape用1×tmhybrdizationbuffer稀释到10μg/μl。

充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入荧光编码微球工作液20μl，样品孔中加入5μlpcr产物，背景孔中加入5μlpcrblank产物，再加入75μl的sape工作液，充分混匀，于金属加热器中45℃孵育30min。

依照检测仪luminex200仪器的说明将杂交后的100μl上述反应液进行检测，结果如图2所示，图中“rhv+sv+lrv”表示三重pcr结果；“rhv”、“sv”、“lrv”分别对应rhv、sv、lrv进行的单重pcr，ntc为无模板对照(即阴性对照)；虽然多重模板的扩增产物无法用电泳分辨，但用检测仪luminex200仪器读取mfi值时，明显分辩不同类型的病毒。

结果判断标准(注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整)如下：

最低检测阈值(cutoff值)的确定：选取10只健康兔粪便或组织样品(每个样品平行重复3次)，分别读取mfi值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的mif值设定其为cutoff值。本发明所获得cutoff值为414.5，因此将本发明的cutoff值定为500。只有检测样品的mfi值高于500时，该实验数据才能进行有效分析。

待测样本的分析判断：1)当待测样本的mfi值＞500时，判断为阳性样本；2)待测样本的mfi值≤500时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。

实施例4：rhv、sv、lrv的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验

将制备的质粒测定浓度后，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至0.01fg/μl，用本发明的多重荧光免疫分析方法进行检测。

具体方法为：提取重组质粒，并作为模板，用上述引物进行rt-pcr扩增；将扩增产物、3种编码不同荧光色的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；杂交结束后，对杂交产物进行分析，确定其病毒的类型。

rt-pcr扩增的反应体系为：

rt-pcr扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s；循环30次；72℃终延伸10min。

将所得pcr产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白(sape)工作液杂交，所述杂交的反应体系和程序为：

45℃反应30min。

rhv、sv、lrv的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验结果如图3所示，实验结果表明，rhv、sv、lrv的灵敏度较高，检出限分别为1fg/pcr和10fg/pcr。

实施例5：rhv、sv、lrv的多重荧光免疫分析检测特异性实验

分别用兔瘟病毒、仙台病毒、兔轮状病毒、巴氏杆菌(pasteurella,pas.)和大肠杆(escherichiacoli；e.coli)等作为模板进行多重荧光免疫分析检测，方法同实施例4。实验结果如图4所示，只有rhv、sv、lrv为阳性，巴氏杆菌(pas.)和大肠杆菌(ecoli).的均为阴性，说明检测体系特异性良好。

实施例6：rhv、sv、lrv的多重荧光免疫分析检测重复性实验

三种病毒分别做了批内和批间试验，实验结果如表1所示。

表1rhv、sv、lrv的多重荧光免疫分析检测重复性结果

从表1结果可知，批内实验的变异系数在2％以下，批间实验的变异系数在3％以下，表明该方法的检测性能稳定，结果可靠，具有可重复性。

实施例7：样品的检测

将采集的兔粪便或组织样品，用试剂盒minibestviralrna/dnaextractionkitver.4.0提取rna，然后反转录获得cdna。以cdna作为模板，采用上述rhv、sv、lrv的多重荧光免疫分析检测方法进行检测，结果如图5所示。

图5结果表明：样品7、9、10均为阴性，1、3、4、6、8为sv阳性；2、4、5、6为lrv阳性样品。其中，样品4、6为sv、lrv混合感染样品。通过测序分析，结果一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>广东省实验动物监测所

<120>一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法及

试剂

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