一种具有改善记忆功效的多肽及其分离制备方法和用途与流程

本发明属于蛋白质精深加工领域，具体涉及一种具有改善记忆功效的多肽及其分离制备方法和用途。

背景技术：

研究表明，阿兹海默症(alzheimer’sdiseases,ad)是一种与年龄相关的神经退行性疾病，其会导致人们在年龄增长的过程中，逐渐丧失认知功能。到目前为止，科研工作者们发现人类退行性疾病的病理非常复杂。在众多病例中，研究对于神经细胞的保护作用已成为人们预防、改善或治疗神经退行性疾病的突破点。

氧化应激加剧或人体机能老化均会损伤人体大脑中神经细胞，从而降低细胞活力。因此，为神经细胞提供营养成分，或添加功能活性成分，从而提高神经细胞的抗氧化、抗炎症能力，增强细胞存活率，对于提高、改善认知能力具有很重要的意义。

另外，部分食物来源活性成分已成为预防和/或治疗神经退行性疾病及抑郁等病症的潜在目标。尤其是对于老年痴呆症，日常饮食治疗更能避免药物干预治疗的不利因素。此外，食物蛋白来源的肽类物质，因具有来源稳定、价格低廉、制备工艺简单、无副作用等优点，逐渐成为人们研究的热点。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种具有改善记忆功效的多肽，其氨基酸序列为tyr-ser-gly-val-cys。

本发明的另一目的在于提供上述多肽的分离制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述多肽的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种多肽，其氨基酸序列为tyr-ser-gly-val-cys；

所述的多肽分子量为527.20da。

上述多肽的分离制备方法，包括如下步骤：

(1)将凤尾鱼去头去内脏，绞成肉糜，加水混合，加入占肉糜质量0.5～1.2％的混合酶，在45～60℃下酶解6～10h后，灭酶，冷却至室温后，离心，过滤收集滤液，为凤尾鱼酶解液；

步骤(1)所述的加水混合，水与肉糜的质量比为(1～3):1；

步骤(1)所述的混合酶，由木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶组成；其中，木瓜蛋白酶占肉糜质量的0.2～0.5％，碱性蛋白酶占肉糜质量的0.3～0.7％；所述的碱性蛋白酶优选alcalase2.4l；

步骤(1)所述的灭酶是将反应物在95℃下加热15min；

步骤(1)所述的离心优选在3500r/min转速下离心10min；

(2)将凤尾鱼酶解液添加至sephadexg-25凝胶柱，用去离子水以0.5～1.5ml/min的流速进行洗脱，检测波长为220nm，收集各洗脱峰并测定其对受损pc12细胞存活率的影响，选取使得受损pc12细胞存活率最高的洗脱峰所对应的组分进行下一步分离；

(3)采用反相高效液相色谱对步骤(2)选取的目标组分进一步纯化，收集各洗脱峰并测定其对受损pc12细胞存活率的影响，使得受损pc12细胞存活率最高的洗脱组分即为本发明的多肽tyr-ser-gly-val-cys；

步骤(3)所述的反相高效液相色谱优选以下参数：waterse2695hplc，2998pda检测器，色谱柱为xbridge^tmprepbeh130c18柱(10×150mm，5μm,waters,usa)，流动相为a相和b相；a相是质量分数0.1％的三氟乙酸超纯水溶液，b相为甲醇；

洗脱程序为：0-1min内采用的流动相中a与b体积比为(95:5)-(90:10)；1-35min内采用的流动相中a与b体积比为(95:5)-(60:40)或(90:10)-(70:30)；35-36min内采用的流动相中a与b体积比为60:40；36-40min内采用的流动相中a与b体积比为(60:40)-(95:5)或(60:40)-(90:10)，流速为1ml/min，检测波长为220nm。

步骤(2)和(3)中所述的受损pc12细胞存活率的测定方法如下：

pc12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株)培养采用prim1640培养基，并在培养基中添加5％胎牛血清和5％的马血清及双抗，在37℃和5％co2环境下培养；将传代后的细胞铺于96孔板，细胞密度为1.0×10⁵每孔，培养24h后，加入2ml洗脱液培养24h后加入30mm谷氨酸进行损伤，损伤时间为24h；在损伤时间结束后，加入0.5mg/mlmtt，继续培养4h，去除培养基，加入150μldmso，在550nm下测定吸光值；细胞存活率的计算公式为：

细胞存活率(％)＝(asample-ablank)/(acontrol-ablank)×100％

其中，asample、ablank、acontrol分别代表550nm波长检测下，样品、pbs空白以及正常对照组的吸光值。

上述测定方法又称mtt法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。

本发明的多肽可用于制备具有改善记忆功效的药品、保健品或食品。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明多肽所用的原料为凤尾鱼，来源广泛，价格低廉，目前凤尾鱼多用作制作鱼罐头，现在将其作为原料，开发成改善记忆肽，可显著提高凤尾鱼的附加值。

(2)本发明采用生物酶解技术及色谱分离技术制备出一种具有明显改善记忆作用的蛋白肽，制备方法简单可行，制得的产品纯度高。

(3)本发明提供的改善记忆肽的生物活性优良，具有良好的神经细胞保护作用，可以作为功能性成分，用于保健品中。

(4)本发明提供的改善记忆肽为五肽产品，其肽分子量小，可被人体直接吸收。

(5)本发明得到的五肽产品，通过化学合成并经实验验证其神经细胞保护效果。

附图说明

图1为凤尾鱼酶解产物的sephadexg-25凝胶色谱分离洗脱曲线。

图2为凤尾鱼酶解产物sephadexg-25凝胶色谱洗脱组分对受损pc12细胞的存活率影响。

图3为凝胶色谱目标收集组分的反相高效液相色谱分离洗脱曲线。

图4反相高效液相色谱分离洗脱组分对受损pc12细胞的存活率影响。

图5为改善记忆肽的氨基酸序列质谱分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

一种改善记忆的多肽，由以下步骤制得：

(1)将凤尾鱼去头去内脏，过绞肉机绞成肉糜，加入肉糜质量2倍的水，加入凤尾鱼肉糜质量0.25％的木瓜蛋白酶0.25％的alcalase2.4l，在55℃下保温水解7h，酶解结束后在95℃温度下加热15min进行灭酶，冷却至室温后，在3500r/min转速下离心10min，过滤收集滤液，获得凤尾鱼酶解液；

(2)采用sephadexg-25凝胶柱对凤尾鱼酶解液进行分离纯化，用去离子水以0.5ml/min的流速进行洗脱，检测波长为220nm，洗脱曲线如图1，共收集到6个洗脱峰，通过测定各洗脱峰对受损pc12细胞存活率的影响(图2)，发现组分fr.4活性最高，选取fr.4组分进入反相高效液相色谱(waterse2695hplc，2998pda检测器)进一步纯化，色谱柱为xbridge^tmprepbeh130c18柱(10×150mm,5μm,waters,usa)，流动相为a相(0.1％的三氟乙酸超纯水溶液)和b相(乙腈)，洗脱程序为：0-1min内a:b为90:10(体积比，下同),1-35min内a:b为90:10-70:30，35-36min内a:b为70:30，36-40min内a:b为70:30-90:10，流速为1ml/min，检测波长为220nm，洗脱曲线见图3，共收集到10个峰，通过测定各洗脱峰对受损pc12细胞存活率的影响(图4)，发现组分f5活性最高，收集组分f5，得到改善记忆肽。

(3)最后采用电喷雾串联质谱对组分f5进行序列分析(图5)，测得改善记忆肽的氨基酸序列为tyr-ser-gly-val-cys。

本发明多肽的神经细胞保护作用实验如下所示：

pc12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株)培养采用prim1640培养基，并在培养基中添加5％胎牛血清和5％的马血清及双抗，在37℃和5％co2环境下培养；将传代后的细胞铺于96孔板，细胞密度为1.0×10⁵每孔，培养24h后，加入2ml洗脱液，继续培养24h后加入30mm谷氨酸进行损伤，损伤时间为24h；在损伤时间结束后，加入0.5mg/mlmtt，继续培养4h，去除培养基，加入150μldmso，在550nm下测定吸光值；细胞存活率的计算公式为：

细胞存活率(％)＝(asample-ablank)/(acontrol-ablank)×100％

其中，asample，ablank，acontrol分别代表550nm波长检测下，样品，pbs空白以及正常对照组的吸光值。

本发明制备的改善记忆肽及脑活素(cerebrolysin)对受损的pc12细胞存活率的影响见表1。

表1改善记忆肽及脑活素对受损pc12细胞的影响

注：改善记忆肽及脑活素浓度均为1mg/ml。

已有文献表明，由于人体机能老化导致的记忆下降多与神经细胞的损伤及凋亡相关。由表1可知本发明的改善记忆肽具有优秀的神经细胞保护作用，具有潜在改善大脑中神经递质紊乱状态并降低神经细胞凋亡率的作用，表明发明提供的改善记忆肽具有很强的神经细胞保护功能，可用于药品、保健品和食品等行业中。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。