本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种用于检测风弓形虫抗体的重组蛋白组合物及其制备方法。
背景技术：
：sag1和微线体蛋白mic2被认为在弓形虫侵染宿主过程中发挥了重要作用，在免疫方面sag1和mic2被认为是一种理想的诊断抗原，能够准确快速，灵敏的检测出弓形虫的感染，从而被广泛而深入研究。sag1是目前研究最多和研究最深入的一种膜蛋白，在不同虫株中具有高度保守性，sag1可以在原核表达系统，真核表达系统和昆虫表达系统进行表达，可以作为诊断抗原进行早期诊断。mic2是弓形虫入侵宿主细胞过程中必需存在的一个入侵因子，在弓形虫连接到宿主细胞的过程中发挥重要作用。mic2基因是保守序列，不能被敲除，缺失后会削弱虫体对宿主细胞的入侵能力。虽然目前现有技术中有用于检测弓形虫抗体的重组蛋白，但是仍存在假阳性及漏检问题，针对上述存在的问题，根据sag1和微线体蛋白mic2的性质，可以开发一种sag1和微线体蛋白mic2特异性表位的重组蛋白的复配组合物，用于检测弓形虫抗体。技术实现要素：本发明的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，可提高检出率，降低漏检的检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物。为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，所述重组蛋白由sag1特异表位的重组蛋白和mic2特异表位的重组蛋白组成。作为一种改进的技术方案，所述sag1特异表位的重组蛋白和mic2特异表位的重组蛋白在所述重组蛋白组合物中按照相同浓度、相同比例混合。作为一种改进的技术方案，所述sag1特异表位为sag1蛋白n端第48个氨基酸至316个氨基酸，所述mic2特异表位为mic2蛋白n端第75个氨基酸至468个氨基酸。本发明的另一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物的制备方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：(1)弓形虫抗体诊断抗原表位的筛选利用在线分析工具，分析弓形虫sag1和mic2的氨基酸序列全长，筛选出弓形虫sag1蛋白特异性抗原位于第48个氨基酸到第316个氨基酸；弓形虫mic2蛋白特异性抗原位于第75个氨基酸到第468个氨基酸；(2)弓形虫sag1和mic2蛋白抗原表位的基因克隆以弓形虫dna为模板，用sag1上、下游引物扩增弓形虫sag1蛋白抗原表位的基因片段；用mic2上、下游引物扩增弓形虫mic2蛋白抗原表位的基因片段；电泳胶回收目的片段，-20℃冻存备用；(3)分别构建sag1和mic2蛋白表达载体提取pgex-4t-1和pgex-4t-2质粒，将pgex-4t-1和pgex-4t-2分别双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；弓形虫sag1蛋白和mic2蛋白分别双酶切，电泳后胶回收双酶切目的片段；将双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3-10比例，用t4连接酶16℃过夜连接，得到重组质粒。作为一种改进的技术方案，所述制备方法还包括下列步骤：重组质粒的筛选和鉴定：将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3),涂布含氨苄青霉素的lb平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落，分别提取质粒，进行双酶切，跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体片段，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；蛋白工程菌高效表达：将鉴定阳性表达菌和对照菌接种至含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃恒温摇床振荡过夜，次日按1:100接种，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5-1mmol/liptg，37℃继续诱导2-6h；离心，收集沉淀菌体，再将沉淀菌体破碎，收集的上清和沉淀分别进行sds-page检测；发现pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2表达的目的蛋白均在上清中，即分别获得了高表达的sag1和mic2抗原性片段蛋白的工程菌；表达蛋白的纯化：将高效表达的重组蛋白工程菌离心，收集沉淀菌体，再将沉淀菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液内，冰浴超声菌体，离心，收集菌液上清；取上清与50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合均匀，离心，弃上清，收集沉淀并向沉淀中加入8-12倍标准体积的pbs混合均匀，离心，再弃上清，收集沉淀并向沉淀中加入1-3倍体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，混匀，离心，收集的上清在pbs中透析24-48h，离心取上清，即分别获得sag1和mic2抗原性目的蛋白，-20℃备用。作为一种改进的技术方案，步骤(2)的扩增条件：阶段i:94℃3min；阶段ii:94℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环；阶段iii:72℃5min。作为一种改进的技术方案，步骤(2)中sag1和mic2的上、下游引物分别具有如下所示的序列：sag1上游引物序列为：5’-aagaattctcggatccccctcttg-3’sag1下游引物序列为：5’-atctcgagactggctgttcccgca-3’mic2上游引物序列为：5’-atcccgggctggacatttgctttcttat-3’mic2下游引物序列为：5’-aactcgagtggacacggtgaggtatt-3’。作为一种改进的技术方案，步骤(3)中的重组质粒为pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2。本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：本发明选择sag1和mic2两个代表性的抗原蛋白，分析两种蛋白氨基酸序列，挑选抗原性比较强的部分片断，作为重组蛋白的对象，大大提高了表达的产量和特异性，将两种重组蛋白复配得到的重组蛋白组合物具有较好的特异性和敏感性，将其用于诊断弓形虫抗体，大大提高了临床检出率，有效解决了检测时所存在的假阳性及漏检问题。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，由sag1特异表位的重组蛋白和mic2特异表位的重组蛋白按照相同浓度、相同比例混合组成的重组蛋白。其中sag1特异表位为sag1蛋白n端第48个氨基酸至316个氨基酸，mic2特异表位为mic2蛋白n端第75个氨基酸至468个氨基酸。实施例2一种诊断弓形虫抗体重组抗原组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)弓形虫抗体诊断抗原表位的筛选利用expasy、tmhmm、signalip4.1等在线分析工具，分析弓形虫sag1和mic2的氨基酸序列全长，筛选出弓形虫sag1蛋白特异性抗原位于第48个氨基酸到第316个氨基酸；弓形虫mic2蛋白特异性抗原位于第75个氨基酸到第468个氨基酸；(2)弓形虫sag1和mic2蛋白抗原表位的基因克隆sag1抗原表位dna序列两侧设计引物上游引物5-aagaattctcggatccccctcttg-3’ecori酶切位点下游引物5’-atctcgagactggctgttcccgca-3’xhoi酶切位点mic2抗原表位dna序列两侧设计引物上游引物5’-atcccgggctggacatttgctttcttat-3’smai酶切位点下游引物5’-aactcgagtggacacggtgaggtatt-3’xhoi酶切位点以弓形虫dna为模板，用sag1上下游引物扩增弓形虫sag1蛋白抗原表位的基因片段；用mic2上下游引物扩增弓形虫mic2蛋白抗原表位的基因片段；扩增条件：阶段i:94℃3min；阶段ii:94℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环；阶段iii:72℃5min；电泳胶回收目的片段，sag1目的片段为823bp，mic2目的片段为1198bp，-20℃冻存备用；(3)分别构建sag1和mic2蛋白表达载体提取pgex-4t-1和pgex-4t-2质粒，pgex-4t-1用ecori和xhoi双酶切，pgex-4t-2用smai和xhoi双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；用ecori和xhoi双酶切弓形虫sag1蛋白，smai和xhoi双酶切mic2蛋白，电泳后胶回收，-20℃备用；双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3-10比例，用t4连接酶16℃过夜连接。连接后的重组载体分别是pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2；(4)重组质粒的筛选和鉴定将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3),涂布含氨苄青霉素(50ug/ml)lb平板上，37℃恒温培养箱过夜。次日随机挑取5个转化菌落和2个对照菌落(质粒pgex-4t-1和pgex-4t-2)，分别提取质粒，pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2分别用ecori/xhoi和smai/xhoi双酶切，酶切后跑电泳。均能看见相应的目的片段和载体片段，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；而对照菌质粒酶切后未看见目的片段；(5)蛋白工程菌高效表达将鉴定阳性表达的菌和对照菌接种至2mllb培养基(60ug/ml氨苄青霉素)的试管中，37℃恒温摇床振荡过夜，次日按1:100接种，37℃恒温摇床振荡4h，加iptg(终浓度为1mmol/l)，继续37℃诱导4h；离心收集菌液，破碎后上清和沉淀均进行sds-page检测；发现pgex-4t-1/sag1和pgex-4t-2/mic2表达的目的蛋白均在上清中；对照菌中无目的蛋白条带，说明分别获得了高表达的sag1和mic2抗原性片段蛋白的工程菌；(6)表达蛋白的纯化高效表达的重组蛋白工程菌高速(10000rpm)低温(4℃)离心10min，将沉淀的菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液(50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt)内，冰浴超声菌体20min，高速(12000rpm)低温(4℃)离心30min，收集菌液上清；上清与50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，于室温下轻摇30min，混合物于4℃离心机中2100rpm/min转速下离心5min，弃上清，收集的沉淀中加入10倍标准体积的pbs，颠倒数次混匀(洗去未与树脂结合的蛋白)，将混合物于4℃离心机中2100rpm/min转速下离心5min，弃上清，收集的沉淀中加入1倍体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min(洗脱树脂上结合的蛋白)，4℃2100rpm/min转速下离心5min，上清移至新管中，重复2次，合并3次上清，在pbs(10mm，ph7.4)中透析48h，离心取上清即分别获得sag1和mic2抗原性目的蛋白，-20℃备用。实施例3阳性表达菌重组质粒测序将上述阳性表达菌用质粒提取试剂盒提取质粒送于上海生工测序。重组质粒内的sag1基因片段的dna序列完全正确，结果如下：tcggatccccctcttgttgccaatcaagttgtcacctgcccagataaaaaatcgacagccgcggtcattctcacaccgacggagaaccacttcactctcaagtgccctaaaacagcgctcacagagcctcccactcttgcgtactcacccaacaggcaaatctgcccagcgggtactacaagtagctgtacatcaaaggctgtaacattgagctccttgattcctgaagcagaagatagctggtggacgggggattctgctagtctcgacacggcaggcatcaaactcacagttccaatcgagaagttccccgtgacaacgcagacgtttgtggtcggttgcatcaagggagacgacgcacagagttgtatggtcacagtgacagtacaagccagagcctcatcggtcgtcaataatgtcgcaaggtgctcctacggtgcagacagcactcttggtcctgtcaagttgtctgcggaaggacccactacaatgaccctcgtgtgcgggaaagatggagtcaaagttcctcaagacaacaatcagtactgttccgggacgacgctgactggttgcaacgagaaatcgttcaaagatattttgccaaaattaactgagaacccgtggcagggtaacgcttcgagtgataagggtgccacgctaacgatcaagaaggaagcatttccagccgagtcaaaaagcgtcattattggatgcacagggggatcgcctgagaagcatcactgtaccgtgaaactggagtttgccggggctgcagggtcagcaaaatcggctgcgggaacagccagt重组质粒内的mic2基因片段的dna序列完全正确，结果如下：ctggacatttgctttcttatcgattcgtctggaagcataggaatacagaatttccgtctagtaaaacagttcctccacacctttttaatggtgttgcccattggcccagaagaagttaacaatgcagttgttacttactcgacggacgttcacctgcaatgggatctacagagtccgaacgcggttgacaagcagctcgcggcgcatgcggtgctagacatgccgtataaaaagggcagtaccaacaccagtgatggactgaaggcctgcaaacaaattctgtttacaggttcgcgcccaggacgcgaacatgtgccgaagctagtgattggaatgacagatggcgaatcggattctgattttcgcaccgtgagagcggcaaaggagattcgtgagcttggaggcatcgtcacagtccttgcagtcggtcattacgtcaaacatagtgagtgccgaagcatgtgtgggtgcagtggtacgagcgatgatgacagtccgtgtcccctgtatcttcgggctgactgggggcagctcgcgacggcgattaaaccgatgcttaaagaggtttgtaagacactcccccaggatgccatttgctcggattggtccgcatggagcccctgcagtgtatcctgcggtgacggaagccaaatcaggacgcgaactgaggtttctgctccgcaacctggaacaccaacatgtccggactgccctgcgcccatgggaaggacttgcgtggaacaaggcggacttgaagaaattcgtgaatgcagtgcgggggtatgtgctgttgacgctggatgtggcgtctggggagagtggtccgcctggagcgcgtcttgcggaaatgccacaaggaagcgagagcgaacgcgttacaatgacccaccaccccagggggcaggccgtcggtgtgaaaatcaggatccgccggtgttacaggagcagacagaagaagcaactcttgctccttgcataactataccgccaactcccccagaatgggctgcatggagcgactgcactgtcacgtgtggcggtggcaatcggcatcgagtgagaaacgcactgccaccaggactggggtcgcagaacggagaaagtgacgaatcgctcgtgtccaaactgtggcctgggacagatctacgacaggaggaagcatgtaatacctcaccgtgtcca实施例4用纯化的重组蛋白检测弓形虫抗体将纯化的2种重组蛋白同等浓度下1:1混合，用碳酸盐缓冲液(50mm，ph9.6)稀释后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜。洗涤后加200ul/孔10％小牛血清的pbs37℃水浴封闭2h，洗涤后4℃备用。间接酶联免疫法检测5份抗弓形虫阳性血清及5份正常人血清。使用450nm波长测定od值。结果显示(见表1)融合蛋白组合物能与5份抗弓形虫阳性血清反应，不与5份正常人血清反应，说明该组合物有较好的抗原性和特异性。表1间接酶联免疫法实验结果(a450值)12345抗弓形虫igm阳性血清1.2861.4711.8691.3661.881正常人血清0.0210.0190.0350.0280.033本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。sequencelisting<110>潍坊汉唐生物工程有限公司<120>一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物及其制备方法<130>1<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>807<212>dna<213>sag1特异表位的基因序列<400>1tcggatccccctcttgttgccaatcaagttgtcacctgcccagataaaaaatcgacagcc60gcggtcattctcacaccgacggagaaccacttcactctcaagtgccctaaaacagcgctc120acagagcctcccactcttgcgtactcacccaacaggcaaatctgcccagcgggtactaca180agtagctgtacatcaaaggctgtaacattgagctccttgattcctgaagcagaagatagc240tggtggacgggggattctgctagtctcgacacggcaggcatcaaactcacagttccaatc300gagaagttccccgtgacaacgcagacgtttgtggtcggttgcatcaagggagacgacgca360cagagttgtatggtcacagtgacagtacaagccagagcctcatcggtcgtcaataatgtc420gcaaggtgctcctacggtgcagacagcactcttggtcctgtcaagttgtctgcggaagga480cccactacaatgaccctcgtgtgcgggaaagatggagtcaaagttcctcaagacaacaat540cagtactgttccgggacgacgctgactggttgcaacgagaaatcgttcaaagatattttg600ccaaaattaactgagaacccgtggcagggtaacgcttcgagtgataagggtgccacgcta660acgatcaagaaggaagcatttccagccgagtcaaaaagcgtcattattggatgcacaggg720ggatcgcctgagaagcatcactgtaccgtgaaactggagtttgccggggctgcagggtca780gcaaaatcggctgcgggaacagccagt807<210>2<211>1182<212>dna<213>mic2特异表位的基因序列<400>2ctggacatttgctttcttatcgattcgtctggaagcataggaatacagaatttccgtcta60gtaaaacagttcctccacacctttttaatggtgttgcccattggcccagaagaagttaac120aatgcagttgttacttactcgacggacgttcacctgcaatgggatctacagagtccgaac180gcggttgacaagcagctcgcggcgcatgcggtgctagacatgccgtataaaaagggcagt240accaacaccagtgatggactgaaggcctgcaaacaaattctgtttacaggttcgcgccca300ggacgcgaacatgtgccgaagctagtgattggaatgacagatggcgaatcggattctgat360tttcgcaccgtgagagcggcaaaggagattcgtgagcttggaggcatcgtcacagtcctt420gcagtcggtcattacgtcaaacatagtgagtgccgaagcatgtgtgggtgcagtggtacg480agcgatgatgacagtccgtgtcccctgtatcttcgggctgactgggggcagctcgcgacg540gcgattaaaccgatgcttaaagaggtttgtaagacactcccccaggatgccatttgctcg600gattggtccgcatggagcccctgcagtgtatcctgcggtgacggaagccaaatcaggacg660cgaactgaggtttctgctccgcaacctggaacaccaacatgtccggactgccctgcgccc720atgggaaggacttgcgtggaacaaggcggacttgaagaaattcgtgaatgcagtgcgggg780gtatgtgctgttgacgctggatgtggcgtctggggagagtggtccgcctggagcgcgtct840tgcggaaatgccacaaggaagcgagagcgaacgcgttacaatgacccaccaccccagggg900gcaggccgtcggtgtgaaaatcaggatccgccggtgttacaggagcagacagaagaagca960actcttgctccttgcataactataccgccaactcccccagaatgggctgcatggagcgac1020tgcactgtcacgtgtggcggtggcaatcggcatcgagtgagaaacgcactgccaccagga1080ctggggtcgcagaacggagaaagtgacgaatcgctcgtgtccaaactgtggcctgggaca1140gatctacgacaggaggaagcatgtaatacctcaccgtgtcca1182<210>3<211>24<212>dna<213>sag1上游引物序列<400>3aagaattctcggatccccctcttg24<210>4<211>24<212>dna<213>sag1下游引物序列<400>4atctcgagactggctgttcccgca24<210>5<211>28<212>dna<213>mic2上游引物序列<400>5atcccgggctggacatttgctttcttat28<210>6<211>26<212>dna<213>mic2下游引物序列<400>6aactcgagtggacacggtgaggtatt26当前第1页12