一株枯草芽孢杆菌BBD012及防治番茄病害中的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体的说是一种枯草芽孢杆菌bbd012及防治番茄病害中的应用。

背景技术：

番茄灰霉病是番茄上危害较重且常见的病害，各菜区都发生。除危害番茄外，还可危害害茄子、辣椒、黄瓜、瓠瓜等20多种作物。低温、连续阴雨天气多的年份危害严重。发病严重时造成茎叶枯死和大量的烂花、烂果，直接影响产量。番茄灰霉病已成为我国保护地番茄生产的主要病害，灰霉病是由半知菌亚门真菌灰葡萄孢(botrytiscinerea)侵染所致。

番茄叶霉病由番茄叶霉病菌（fulviafulva）侵染所致，在番茄的叶、茎、花、果实上，都会出现症状，但是常见症状是发生在叶片上，初期在叶片背面出现一些退绿斑，后期变为灰色或黑紫色的不规则形霉层，叶片正面在相应的部位退绿变黄，严重时，叶片常出现干枯卷缩。从发病的顺序看，经常从植株下部向上蔓延、温度从9℃到34℃之间，病原都能生长发育，发育的最适温度是20～25℃。在最适温度且湿度较大(相对湿度在80%以上)时，仅需10天到半月就可普遍发病。

目前番茄抗病育种还没有突破性进展，国内防治番茄灰霉病和叶霉病主要依靠化学药剂。然而，长期、连续用药使灰霉病菌和叶霉病产生了抗药性，导致化学药剂防治效果逐年下降，并且化学药剂残留严重污染农产品和环境，危及人畜健康。生物防治已经成为控制病害的重要手段，而植物内生细菌作为植物病害生物防治的潜在资源菌具有独特的优势，并且已经显示出很好的利用前景。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种嗜温性的好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，其抑制植物病原菌的范围很广，包括根部病害、枝干病害、叶、花部病害和收获后果品病害，是一种理想的生防微生物。

技术实现要素：

本发明目的是提供一株枯草芽孢杆菌bbd012，分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）bbd012，保藏编号为cctccno：m2017097。

本发明的另一目的是提供一种防治番茄灰霉病和/或叶霉病制剂。

所述枯草芽孢杆菌bbd012可用于抑制番茄灰霉病菌和番茄叶霉病菌。

所述防治番茄灰霉病和/或叶霉病制剂为枯草芽孢杆菌bbd012培养液。

所述枯草芽孢杆菌bbd012培养液中含有菌落4×10⁸cfu·ml^–1。

所述枯草芽孢杆菌bbd012培养液的制备方法为：接种枯草芽孢杆菌bbd012单菌落于lb液体培养基中，28℃的恒温振荡培养箱中160r·min^-1培养24h，采用无菌水将培养后所得菌液的菌落稀释至4×10⁸cfu·ml^–1。

所述制剂治疗和预防番茄灰霉病和/或叶霉病的方法，采用枯草芽孢杆菌bbd012培养液对番茄植株进行喷雾，即将枯草芽孢杆菌bbd012培养液喷在番茄叶片的正反面。

有益效果

本发明的枯草芽孢杆菌bbd012筛选自白扁豆植株，该菌株在与宿主植物协同进化的过程中，形成了稳定的生态关系，内生细菌可以通过自身产生或诱导宿主产生一些抗菌的物质，或通过与植物病原菌竞争生态位和营养物质对植物病害起到防治作用。枯草芽孢杆菌bbd012对番茄灰霉病菌和叶霉病菌具有良好拮抗效果，且该菌株对三种桂花病菌（刺球壳、葡萄座腔菌、炭疽病菌）也有一定的拮抗作用，通过试验证实枯草芽孢杆菌bbd012菌对番茄灰霉病和叶霉病的的防治效果分别达到64.9%和58.0%，具有很好的防病效果。

生物材料的保藏

一株枯草芽孢杆菌bbd012，分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）bbd012，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称为cctcc，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno：m2017097，保藏日期为2017年3月8日。

附图说明

图1是本发明枯草芽孢杆菌bbd012对番茄叶霉病菌的抑菌效果图；

图2是本发明枯草芽孢杆菌bbd012对番茄灰霉病菌抑菌效果的图；

图中：左为对照，右为抑菌效果。

具体实施方式

实施例1

采用预防番茄灰霉病的制剂进行盆栽番茄防治：

步骤一、接种枯草芽孢杆菌bbd012单菌落于200mllb液体培养基中，28℃的恒温振荡培养箱中160r.min^-1培养24h，将所培养的菌液稀释至4×10⁸cfu.ml^–1，制备出预防番茄灰霉病的制剂；

步骤二、取长至5-6叶，长势一致的盆栽番茄，用治疗和预防番茄灰霉病制剂喷雾至番茄叶片正反面，以清水作为对照，24h后将番茄灰霉病菌的孢子悬浮液1×10⁷个孢子/ml（将少许无菌水注入已长满灰霉病菌的pda平板内，将琼脂表面的孢子刮下，倒入无菌容器内，充分振荡后用灭菌的纱布过滤，于血球计数板中计数）喷雾接种其上。番茄植株培养于人工气候箱（23℃，r≧90%）中。每个处理3盆，每盆3株，重复3次。接种后7d调查番茄的发病情况，病情分级采取5级标准。0级：无病斑，叶片无症状，植株健康；1级：病斑面积占总叶片的10%以下；2级：病斑面积占总叶片的10%-50%；3级：病斑面积占总叶片的50%以上；4级：植株死亡。

病情指数=100×[σ（各级病叶数×病害级别数）]/（调查总叶数×4）防治效果（%）=[（对照病情指数-拮抗菌株处理后病情指数）]/对照病情指数]×100

结果表明：喷雾治疗和预防番茄灰霉病制剂的番茄植株比用清水处理的病情指数降低23.1，防治效果为64.9%（见表1）。

表1枯草芽孢杆菌bbd012对番茄灰霉病的防治效果

实施例2

采用预防番茄叶霉病的制剂进行盆栽番茄防治：

步骤一、接种枯草芽孢杆菌bbd012单菌落于200mllb液体培养基中，28℃的恒温振荡培养箱中160r.min^-1培养24h，将所培养的菌液稀释至4×10⁸cfu.ml^–1，制备出预防番茄灰霉病的制剂；

步骤二、取长至5-6叶，长势一致的盆栽番茄，用治疗和预防番茄灰霉病制剂喷雾至番茄叶片正反面，以清水作为对照，24h后将番茄灰霉病菌的孢子悬浮液1×10⁷个孢子/ml（将少许无菌水注入已长满灰霉病菌的pda平板内，将琼脂表面的孢子刮下，倒入无菌容器内，充分振荡后用灭菌的纱布过滤，于血球计数板中计数）喷雾接种其上。番茄植株培养于人工气候箱（23℃，r≧90%）中。每个处理3盆，每盆3株，重复3次。接种后7d调查番茄的发病情况，病情分级采取5级标准。0级：无病斑，叶片无症状，植株健康；1级：病斑面积占总叶片的10%以下；2级：病斑面积占总叶片的10%-50%；3级：病斑面积占总叶片的50%以上；4级：植株死亡。

病情指数=100×[σ（各级病叶数×病害级别数）]/（调查总叶数×4）防治效果（%）=[（对照病情指数-拮抗菌株处理后病情指数）]/对照病情指数]×100

结果显示：接种bbd012菌株后接种番茄叶霉病菌的番茄植株比用清水处理的病情指数降低17.7，防治效果为58.0%（见表2）。

表2：枯草芽孢杆菌bbd012对番茄叶霉病的防治效果

实施例3

枯草芽孢杆菌bbd012菌株的筛选、分离和纯化:

步骤一、培养基的制备：

细菌平板培养用lb培养基（胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；氯化钠10g/l；琼脂粉18g/l），液体培养用lb液体培养基（不加琼脂粉），真菌培养及平板对峙试验用pda培养基（马铃薯200g/l；葡萄糖20g/l；琼脂粉18g/l）。

步骤二、采集健康白扁豆植株的叶片3g，在75%的酒精中浸泡30s，然后用1%的次氯酸钠消毒3min，用无菌蒸馏水冲洗5次后，取最后一次的冲洗液200μl涂布于lb培养基平板上；消毒后的叶片于无菌的研钵中研磨，加入5ml无菌蒸馏水混匀，取研磨液200μl，涂布于lb培养基平板上。在28℃下培养，逐日观察，如最后一次冲洗液涂布的培养基中无菌落，研磨液涂布的培养基中长出的菌落是内生菌，进行纯化培养后，4℃冰箱中保存备用。

步骤三、拮抗活性测定

番茄灰霉病菌、番茄叶霉病菌、桂花叶斑病菌(刺球壳)、桂花炭疽病菌和桂花叶斑病菌（葡萄座腔菌）活化培养，制成8mm的菌饼放置于pda培养基中心，四周40mm处分别放置四片8mm大小含有内生细菌的滤纸片，置于28℃培养箱内培养4~5天，测量抑菌圈半径并计算抑菌率。

结果显示从健康白扁豆的叶片中共分离出19株内生细菌，其中分离得到的bbd012抑菌活性最强，对番茄叶霉病菌抑菌率达65.32%，图1；对番茄灰霉病菌抑菌率达79.52%，图2；对其他三种病原菌也有一定程度的抑制作用，表3。

表3菌株bbd012发酵液对5种病原真菌的抑菌率

步骤四、强拮抗内生菌株的鉴定

1、形态及生理生化鉴定

方法参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(buchanan＆gibbons，1984)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，1999)。

1）形态特征

菌株bbd012细胞为杆状、单生、鞭毛周生，革兰氏染色阳性。菌落呈白色、不透明，边缘不规则。

2）生理生化特征

菌株bbd012为好氧菌，不能运动，可以利用蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，但不能利用乳糖，可以水解淀粉和明胶，可分解牛奶产酸，柠檬酸盐试验、v-p试验、硝酸盐还原试验和接触酶试验呈阳性，苯丙氨酸脱氢酶实验、甲基红试验和氧化酶试验呈阴性，最适生长ph7.0，最适生长温度30℃。

2、16srdna和gyra基因序列测定

以细菌基因组dna快速抽提试剂盒（上海生工生物工程公司refb518225-0050）提取的菌株bbd012基因组dna为模板。16srdnapcr扩增采用引物16sl：5'-acggctaccttgttacgacct-3'（其序列如seqidno:1）和引物16sr：5'-agagtttgatcctggctcag-3'（其序列如seqidno:2）。gyra基因pcr扩增采用引物gyra-f：cgatcaggaaatgcgtacgtcctt（其序列如seqidno:3）和引物gyra-r：caaggtaatgctccaggcattgct（（其序列如seqidno:4））。反应体系(50μl)：10×buffer5.0μl、dntps(2.5mmol·l^-1)4.0μl、引物16sr(10pmol·l^-1)2.0μl、引物16sl(10pmol·l^-1)2.0μl、taq酶(5u·μl^-1)0.5μl、模板dna(50ng·μl^-1)2μl、ddh2o34.5μl。pcr反应程序:94℃5min，94℃1min，50℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。将pcr产物经纯化后送上海生工生物工程公司测序。根据测序结果，用blast软件从genbank数据库中调出相关菌株的16srdna序列和gyra基因序列，分别用clustalwv1.82软件进行多序列比对，之后用mega4.1软件进行序列分析，采用邻接法(neighbor-joining，nj法)进行系统发育分析和同源性比较。

结果显示：菌株bbd012的16srdna（基因序列如seqidno：5所示）和gyra基因序列（如seqidno：6所示）与bacillussubtilis同源性均高达99%。结合其形态特征、生理生化特性、16srdna和gyra基因序列分析，将该菌株鉴定为b.subtilisbbd012。

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<110>河南科技大学

<120>一株枯草芽孢杆菌bbd012及防治番茄病害中的应用

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