lincRNATUNAR在调节脑神经系统发育中应用的制作方法

本发明涉及基于lncrna的应用，特别涉及lincrnatunar在调节脑神经系统发育中应用。
背景技术：
：先天性脑发育不良(congenitalcerebraldysplasia)是一种异质性的疾病，新生儿脑发育异常,包括皮质增殖异常(abnormalcorticalproliferation)和神经元移行异常(abnormalneuronalmigration)[1]等多种类型。皮质增殖异常主要表现为小头畸形，小头畸形与神经系统异常和精神发育迟滞相关[2]。其诊断基础为颅底水平头围的测量，小于均值3sd以上为诊断标准。发生率约为1.6人每1000单胎分娩，只有14％出生时检测出的小头儿在1岁内诊断为小头畸形[2]。神经元移行异常的特点是脑回的缺失和皮层的增厚，并与大脑的其他异常有关，可表现为脑回缺如、脑回减少(无脑回)、单侧巨脑等[4]。这些疾病的相关发病机制尚不明确，无法进行有效的治疗，其针对性预防和治疗更为困难。虽然早发现、早干预胎儿脑发育异常,能减少出生缺陷,提高出生人口素质，但对其发病机制的探索仍非常迫切。长非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)是一类转录本长度大于200nt的rna分子，在基因调控方面发挥重要作用(chenandzhou2017)，例如：担任信号分子[5]，增强基因转录[6]、抑制下游基因转录[7]、以及作为蛋白质复合物的骨架[8]。lincrnatunar是进化上保守的，显示中枢神经系统特异性表达的模式，但是其功能并未明确。参考文献：1.chenm,leecp,leungky,huipw,tangmh.pilotstudyonthemidsecondtrimesterexaminationoffetalnasalboneinthechinesepopulation.prenataldiagnosis.2004feb；24(2):87-91.2.chenm,leecp,tangr,chanb,oucq,tangmh.first-trimesterexaminationoffetalnasalboneinthechinesepopulation.prenataldiagnosis.2006aug；26(8):703-6.3.chenm,wanghf,leungty,fungty,chanlw,sahotads,laoth,lautk.firsttrimestermeasurementsofnasalbonelengthusingthree-dimensionalultrasound.prenataldiagnosis.2009aug；29(8):766-70.4.chenm,lamyh,tangmh,leecp,sinsy,tangr,wonghs,wongsf.theeffectofethnicoriginonnuchaltranslucencyat10-14weeksofgestation.prenataldiagnosis.2002jul；22(7):576-8.5.chenm,lamyh,leecp,tangmh.ultrasoundscreeningoffetalstructuralabnormalitiesat12to14weeksinhongkong.prenataldiagnosis.2004feb；24(2):92-7.6.chenm,leecp,lamyh,tangry,chanbc,wongsf,tselh,tangmh.comparisonofnuchalanddetailedmorphologyultrasoundexaminationsinearlypregnancyforfetalstructuralabnormalityscreening:arandomizedcontrolledtrial.ultrasoundobstetgynecol.2008feb；31(2):136-46；discussion146.7.chenm,yangx,leungty,sahotads,fungty,chanlw,laott,lautk.studyontheapplicabilityoffrontomaxillaryfacialangleinthefirst-trimestertrisomy21fetusesinchinesepopulation.prenataldiagnosis.2009dec；29(12):1141-4.8.chenm,wanghf,leungty,sahotads,borensteinm,nicolaidesk,laott,lautk.frontomaxillaryfacialangleat11+0to13+6weeksinchinesepopulation.jmaternfetalneonatalmed.2011mar；24(3):498-501。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供lincrnatunar在调节脑神经系统发育中应用。发明人从美国ncbi的geo芯片公共数据库，通过共表达分析，成功预测长非编码tunar的在神经系统发育分子功能密切相关的信号通路：神经系统发育等通路，神经系统发育预后相关的tunar相关的319个靶基因。进一步的rna-seq测序结果表明在神经系统标本中，tunar高表达，而且相关的神经系统蛋白，也同时高表达，相关性非常显著(p<0.0001)。基于此发现，有望明确tunar导致大脑发育不良的机制，逐步建立神经细胞分化的分子调控网络，为寻求大脑发育不良的预防和药物治疗的新靶点提供理论依据。通过定量tunar表达量，可以用于脑神经系统疾病检测或筛查。抑制tunar表达量的试剂可以用于治疗脑神经系统疾病。抑制tunar表达产物活性的化合物或试剂可以用于治疗脑神经系统疾病。脑神经系统疾病选自新生儿脑发育异常、先天性脊柱裂。一种药物筛选方法，包括将药物作用于细胞或动物体，之后检测tunar或其同源基因、或表达产物的表达量，根据表达量确定药物是否入选。附图说明图1是长非编码tunar相关的共表达基因的蛋白互作网络；图2是人脑组织标本中tunar与rab3c基因的相关性图，结果显示tunar与rab3c基因的相关性高；图3是人脑组织标本中tunar与dlg4基因的相关性图，结果显示tunar与dlg4基因的相关性高；图4是人脑组织标本中tunar与prmt8基因的相关性图，结果显示tunar与prmt8基因的相关性高；图5是人脑组织标本中tunar与cbln2基因的相关性图，结果显示tunar与cbln2基因的相关性高；图6是人脑组织标本中tunar与kcnc2基因的相关性图，结果显示tunar与kcnc2基因的相关性高；图7是脑低级别胶质瘤标本中tunar与snap25基因的相关性图，结果显示tunar与snap25基因的相关性高；图8是脑低级别胶质瘤标本中tunar与grin1基因的相关性图，结果显示tunar与grin1基因的相关性非常显著；图9是脑低级别胶质瘤标本中tunar与syn1基因的相关性图，结果显示tunar与syn1基因的相关性非常显著；图10是脑低级别胶质瘤标本中tunar与nsf基因的相关性图，结果显示tunar与nsf基因的相关性非常显著；图11是脑低级别胶质瘤标本中tunar与camk2a基因的相关性图，结果显示tunar与camk2a基因的相关性非常显著。具体实施方式下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。神经系统发育的预后长非编码rna基因的鉴定与功能预测1.2016年6月从美国ncbi的geo芯片数据，挖掘人神经系统发育相关的基因群数据，共6万张人类基因组表达谱数据。通过共表达分析，找出相关表达量相关的基因群：发明人通过对geoaffy芯片表达谱的进行共表达分析，就是将表达量与基因tunar有正相关关系的基因，例如通过correlation函数，找出正调控相关(corr>0.40)的前319个基因，(表1)。表1、tunar的在affyu133plus2人类芯片共表达正相关最高的319个基因基因共表达网络分析基因共表达网络分析(geneco-expressionnetworkanalysis)是基于基因间表达数据的相似性而构建的网络图，图1中的节点代表基因，具有相似表达谱的基因被连接起来形成网络。通过基因表达的相似性可分析基因产物可能的相互作用关系，从而了解基因间相互作用脉络及寻找核心基因，核心基因是重要的枢纽，在网络模块中起关键性作用。通过对tunar的共表达基因群(表1)做蛋白互作分析，发明人得到蛋白互作网络(protein-proteininteractionnetwork，ppi)(图1)，发现tunar是核心基因。开源的生物信息学在线软件david(databaseforannotation,visualizationandintegrationdiscovery)是重要的生物信息学工具，网站http://david.abcc.ncifcrf.gov提供来自基因组研究的大量基因列表的功能解释。使用david对tunar这个长非编码rna共表达基因进行go分析，结果如表2所示。表2：tunar的基因功能注解(geneontology,go)通路富集分析结果在表2的长非编码tunar相关通路富集分析的24条信号通路，发现与神经系统功能极其相关基因，举例如下：第2通路：synapticvesicle(突触小泡)的22个基因(kcnc2,syt1,kcnab2,syt4,gabrb2,syt5,ncs1,syt7,syngr1,syp,pacsin1,grin2b,sh2d5,snph,prrt1,dlg4,sv2b,gabrg2,stx1a,svop,cacng8,psd3,bsn,grm2,doc2a,stxbp5,chrm1,unc13a,neurl1,prkcz,rims1,amph,rims3,gad2,synpr,syn1,arhgap44,olfm3,camk2a,snap25,olfm1,lrfn2,gabra1,dlgap3,gabra4,grin1,slc6a17,syngr3,slc17a7,kcnj4,kctd16)第13通路：neurotransmittersecretion(神经递质分泌)的13个基因(ppfia2,rab3a,syt1,stx1a,gad2,syn1,nrxn3,snph,stxbp1,rims1,snap25,unc13a,apba1)第22通路：perikaryon(神经元胞体)的12个基因(kcnc2,slc8a2,cck,kcnb2,rbfox3,hpca,map2k4,eno2,ddn,htr5a,olfm1,neurl1)第23通路：neuronprojection(神经元的投射)的17个基因(syt1,stx1a,camk1g,stmn2,syt5,grin1,syp,synpr,doc2a,sstr3,grin2b,snph,sv2b,sv2a,snap25,unc13a,apba1).go功能分析的结果fdr都<0.001，富集非常显著。keggpathway分析指kegg通路分析，对差异基因进行通路分析，可以了解实验条件下显著改变的分子通路，在生物机制研究中显得尤为重要。tunar相关kegg通路富集分析如表3所示。表3：tunar的kegg通路富集分析结果idtermcountfdrhsa04721synapticvesiclecycle142.16e-08hsa04921oxytocinsignalingpathway187.31e-07hsa04724glutamatergicsynapse144.44e-05hsa05031amphetamineaddiction111.20e-04hsa04020calciumsignalingpathway162.42e-04hsa04713circadianentrainment124.55e-04hsa04728dopaminergicsynapse130.00133hsa04720long-termpotentiation100.00137hsa04727gabaergicsynapse110.00137tunar相关前9个kegg通路富集分析(表3)，发现其通路分析结果，举例如下：1)synapticvesiclecycle(突触囊泡循环)的14个基因(rab3a,syt1,stx1a,cplx2,stxbp1,atp6v1h,stx1b,rims1,slc17a7,atp6v0a1,snap25,dnm1,unc13a,nsf)2)dopaminergicsynapse(多巴胺能神经突触)的13个基因(caly,kcnj3,prkcb,grin2b,ppp3cb,gnb5,mapk9,calm3,camk2b,gng3,ppp2r2c,camk2a,calm1)3)gabaergicsynapse(gaba能突触)11个基因(gls2,gabrg2,gad2,gabra1,gabra4,gabrb2,gls,gnb5,gng3,nsf,prkcb)等神经系统功能密切相关。kegg富集通路分析的结果fdr值都<0.0014，统计学意义显著。keggpathway分析指kegg通路分析，对差异基因进行通路分析，可以了解实验条件下显著改变的分子通路，在生物机制研究中显得尤为重要。rna-seq转录组测序验证实验rna-seq测序技术，就是把mrna,小rna与ncrna等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。样品提取总rna后，要选择质量合格的totalrna作为mrna测序的建库起始样品，其质量要求通过agilent2100bioanalyzer检测结果rin≥7，28s和18s的rna的比值大于或等于1.5：1，起始量的要求范围是0.1∽1ug。用qubitrnaassaykit对起始的totalrna进行准确定量。对于真核生物，用带有oligo(dt)的磁珠富集mrna，向得到的mrna中加入fragmentationbuffer使其片断成为短片段，再以片断后的mrna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成cdna第一链，并加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成cdna第二链，经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱经末端修复、加碱基a，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行pcr扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用illuminahiseq进行测序。rna-seq测序的实验表明tunar在神经系统中高表达，利用rna-seq测序与生物信息数据分析流程、基因表达量(fragmentperkilobase，fpkm)的计算方法，分析人体神经系统组织标本的rna-seq高通量测序数据，其中长非编码rna基因tunar在脑与神经系统等相关组织内高表达，而且相关性非常显著。从rna-seq测序结果，发明人找出tunar相关的调控基因群，将表达量与tunar有正相关的关系的基因，通过correlation函数，找出相关性大于0.40的相关基因，显著正调控的基因一共有319个，其中表4显示了10个tunar在脑神经系统最相关的基因。表4：tunar在神经系统相关组织的共表达分析结果基因组织标本数目相关性p-值rab3c正常脑组织11460.73021.69e-191dlg4正常脑组织11460.65659.32e-76prmt8正常脑组织11460.57862.87e-55cbln2正常脑组织11460.53251.59e-45kcnc2正常脑组织11460.43897.73e-30snap25脑低级别胶质瘤5230.80103.40e-118grin1脑低级别胶质瘤5230.77764.53e-107syn1脑低级别胶质瘤5230.79141.96e-113nsf脑低级别胶质瘤5230.70953.30e-81camk2a脑低级别胶质瘤5230.71401.10e-82以tunar为x-轴,log2(fpkm+0.001)，另一相关基因为y-轴,log2(fpkm+0.001)制图，分析tunar与基因间的相关情况。相关图如图2～11所示。图2是人脑组织标本中tunar与rab3c基因的相关性图，结果显示tunar与rab3c基因的相关性高；图3是人脑组织标本中tunar与dlg4基因的相关性图，结果显示tunar与dlg4基因的相关性高；图4是人脑组织标本中tunar与prmt8基因的相关性图，结果显示tunar与prmt8基因的相关性高；图5是人脑组织标本中tunar与cbln2基因的相关性图，结果显示tunar与cbln2基因的相关性高；图6是人脑组织标本中tunar与kcnc2基因的相关性图，结果显示tunar与kcnc2基因的相关性高；图7是脑低级别胶质瘤标本中tunar与snap25基因的相关性图，结果显示tunar与snap25基因的相关性高；图8是脑低级别胶质瘤标本中tunar与grin1基因的相关性图，结果显示tunar与grin1基因的相关性非常显著；图9是脑低级别胶质瘤标本中tunar与syn1基因的相关性图，结果显示tunar与syn1基因的相关性非常显著；图10是脑低级别胶质瘤标本中tunar与nsf基因的相关性图，结果显示tunar与nsf基因的相关性非常显著；图11是脑低级别胶质瘤标本中tunar与camk2a基因的相关性图，结果显示tunar与camk2a基因的相关性非常显著。可以合理预见：通过定量tunar表达，可以很好地对脑神经系统疾病检测或筛查；定量tunar表达量的试剂可以用于制备脑神经系统疾病检测或筛查试剂。特别的，定量tunar表达量的试剂为rna或dna定量试剂。抑制tunar表达量对脑神经系统疾病的治疗具有积极意义；抑制tunar表达量的试剂可以用于制备治疗脑神经系统疾病药物。抑制tunar表达产物活性的化合物或试剂对脑神经系统疾病的治疗具有积极意义；通过检测化合物对tunar或其同源基因、或表达产物表达量的影响，可以很好地减少脑神经系统疾病，特别是新生儿脑发育异常、先天性脊柱裂等脑神经系统疾病药物筛选的工作量，大幅降低药物筛选的成本。当前第1页12