一种茄子耐涝表型与SSR分子标记关联分析的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种茄子耐涝表型与ssr分子标记关联分析的方法。

背景技术：

雨涝是我国经常发生的严重自然灾害，往往给我国的国民经济造成严重损失。在20世纪后期气候变暖的背景下，我国南方雨涝变化的趋势是科学家普遍关心的事实。我国涝渍灾害以黄淮平原和长江中下游地区最为严重，占全国受灾面积3/4以上，对农作物生产危害很大。近年来，我国秦岭淮河以南的广大南方地区6-8月的雨涝范围在扩大，给作物安全优质生产带来的威胁日益严重。

茄子(solanummelongenal.)在世界大多数地区广泛栽培，联合国粮食及农业组织把茄子列为第四大蔬菜作物。中国是世界上最大的茄子生产国，也是茄子的次生起源中心，其栽培面积约占世界的50％。2012年，我国茄子的种植面积为80.1万公顷，总产量达到2882.5万吨。在我国南方地区，茄子极易遭到雨涝胁迫，如果栽培土壤过湿，茄子叶片会发黄，植株萎蔫甚至逐渐枯死。近年来，随着茄子种植面积的逐年扩大，我国很多地区已经实现了茄子全季节栽培。我国长江流域及其以南地区，由于季节性降雨，露地茄子开花结果期遭遇梅雨，长期阴雨条件下，由于排灌系统不良及地下水位升高等原因，造成土壤积水，严重影响茄子生产。茄子耐涝性状为复杂的数量性状，其遗传机制复杂。因此，了解茄子种质资源的多样性和亲缘关系，挖掘与茄子耐涝性状相关联的分子标记有利于相关优异等位基因的挖掘和分子标记辅助育种。

关联分析，又称连锁不平衡作图或关联作图，是一种定位和挖掘数量性状位点的新方法，它以自然群体为材料，以连锁不平衡(linkagedisequilibrium，ld)为基础，将目标性状的遗传变异与基因多样性结合分析，可直接鉴定出表型变异相关的基因位点或标记位点。连锁不平衡也被称为配子不平衡(gameticdisequlllbrium)或等位基因关联(allelicassociation)，指是一个群体内不同位点等位基因之间非随机性关联，包括两个标记间或两个基因/qtls间或一个基因/qtls与一个标记座位间的非随机关联。该法率先在动物与医学研究中使用，2001年首次应用于植物。与传统的连锁分析相比，关联分析具有三个优势：一是花费的时间少，一般以现有的遗传基础更加广泛的自然群体为材料，无需构建专门的作图分离群体；二是效率高，可以同时检测同一座位的多个等位基因，提供的等位变异更加丰富,位点的选择不再受两个亲本差异的限制；三是精度高，可达到单一基因的水平，可以计算每个等位变异的效应值。

涝害是全球性问题，严重影响了植物的生长发育。目前我国广大农村地区茄子种植大多采用露地栽培的种植模式，当茄子生长季遭遇长时间的降雨，就会严重影响茄子的生长发育，最终严重影响茄子的品质与产量。因此，提高茄子的耐涝能力是茄子育种研究中的一个重要目标。然而目前关于茄子耐涝性分子标记的研究还尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术中茄子耐涝性状相关分子标记的研究尚是空白这一现状，本发明通过筛选出多个与茄子耐涝性状相关联的分子标记，从而建立茄子耐涝分子标记辅助选择体系，提高茄子耐涝种质资源的选择效率，为茄子耐涝新品种的选育奠定基础。

本发明的目的通过以下技术手段获得：

步骤一：耐涝性鉴定：选择大于200份茄子材料进行淹涝处理，统计茄子耐涝表型数据；

步骤二：茄子材料群体结构分析，方法如下：

(1)提取每份茄子材料的基因组dna；

(2)首先选取亲缘关系较远的茄子基因组dna，对每对ssr引物进行筛选，得到条带清晰、特异性好的ssr引物，将筛选得到的特异性ssr引物用于每份茄子材料的全基因组分子标记扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果；

(3)对每份茄子材料进行群体结构划分，计算各茄子材料的q值，q值是第i材料其基因组变异源于第k群体的概率，绘制群体结构图；

步骤三：每份茄子材料亲缘关系分析：采用spagedi软件分析和统计扫描得到的多态性条带数据结果，可以得到群体内个体之间的亲缘关系情况，即k值(k值即kinship(亲缘关系)，数据组合形成k矩阵)；

步骤四：与茄子耐涝性状相关联的分子标记的确定：使用tassel2.1软件的mlm程序，以各个体q值作为协变量进行群体矫正，将每份茄子耐涝表型数据和亲缘关系得到的k值组合起来进行关联分析；

若p<0.05，则认为该标记位点是与茄子耐涝性紧密关联的分子标记，同时得到该标记位点的表型变异解释率r²。

进一步地，选择219份茄子材料，每份材料在穴盘中播种50粒种子，待茄子幼苗长至二叶一心时进行间苗移苗处理，每份材料选取25株长势一致的幼苗

进一步地，步骤一中，茄子材料进行淹涝处理过程如下：

(1)待茄子幼苗长至四叶一心时进行淹涝处理，具体是将穴盘放入水泥淹涝池中进行淹涝处理，池中放水至土壤表面2-3cm，淹涝期间保持水位的恒定，淹涝处理14d。

(2)涝处理14d后，将水泥淹涝池中的水全部放尽，对茄子幼苗进行正常的田间生长管理，7d后观察茄子幼苗的恢复情况，恢复级别根据植株的恢复和死亡情况分为5级，如下：

(3)根据恢复级别计算恢复指数，计算公式为：ri＝[(x1n1+x2n2+x3n3+...)/4n]×100

式中：ri——恢复指数；xi——各级涝害株数；ni——各涝害极值；n——调查总株数。

苗期耐涝性根据恢复指数分为3级，如下：

根据恢复指数值判定219份茄子材料的耐涝性强弱。恢复指数值越大，茄子耐涝性越差；恢复指数值越小，茄子耐涝性越强。

进一步地，步骤二中，所述操作如下：

(1)采用ctab法提取茄子基因组dna

(2)首先选取8份亲缘关系较远的茄子基因组dna，对813对ssr引物进行筛选，初步筛选出条带清晰、特异性好的ssr引物。再另外选取8份亲缘关系较远的茄子基因组dna对初步筛选淘汰的ssr引物进行再次筛选，第二遍筛选得到条带清晰、特异性好的ssr引物。共筛选出196对特异性ssr引物。将筛选得到的特异性ssr引物用于219份茄子材料的全基因组分子标记扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果。

(3)运用structre2.3软件对群体进行基于数学模型的类群划分，并计算材料相应的q值(第i材料其基因组变异源于第k群体的概率)。进行分析时，将mcmc(markovchainmontecarlo)开始时的不作数迭代(lengthofburn-inperiod)设为30000次，将不作数迭代后的mcmc(numberofmcmcrepsafterburn-in)迭代设为100000次，k值设为2～11，并假定每个ssr标记的位点相互独立，每个k值独立运算3次，然后依据似然值最大的原则选取一个合适的k值，并获得材料相应的q值。进一步地，步骤三中，所述操作如下：

采用spagedi软件分析和统计标记的相关信息，可以得到群体内个体之间的亲缘关系情况，即k值，此系数用于关联分析mlm模型。首先将spagedi.txt拖到软件中，依次输入相应的步骤，待程序运行完后，把数据复制到excel中进行处理。处理方法如下：对角线上的空格用1填充，小于1的数用0代替，最后所有的系数都乘以2。

进一步地，步骤四中，所述操作如下：

使用tassel2.1软件的glm(generallinearmodel)程序，以步骤二群体结构分析中所得到的的各个体q值和步骤三亲缘关系分析中得到的矩阵(k值)都作为协变量计入模型，以219份茄子涝胁迫后的统计数据(恢复指数)为表型，联合以上分子数据进行关联分析，若p<0.05，则认为该标记位点是与茄子耐涝性关联的分子标记，同时得到该标记位点的表型变异解释率r²(r²指位点频率相关系数的平方，处理软件得出的结果里默认r²为位点的表型变异解释率)。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

本发明将茄子耐涝性状与ssr分子标记进行关联分析，了解了茄子种质资源的多样性和亲缘关系，挖掘出与茄子耐涝性状相关联的分子标记，将有利于茄子优异等位基因的挖掘和分子标记辅助育种。

附图说明

图1k值所对应的lnp(d)趋势图。

图2k值所对应的δk趋势图。

图3219份茄子材料的群体结构图。

图4219份茄子材料kinship值分布图。

具体实施方式

下面结合具体方案实施例，进一步阐述本发明的步骤与分析方法。

实施例

1.供试219份茄子材料名称及来源，见表1

表1材料名称及来源

2.试验方法

(1)219份茄子材料涝胁迫表型鉴定

1)每份材料在穴盘中播种50粒种子，待茄子幼苗长至二叶一心时进行间苗移苗处理，每份材料选取25株长势一致的幼苗。待茄子幼苗长至四叶一心时进行淹涝处理。将穴盘放入水泥淹涝池中进行淹涝处理，池中放水至土壤表面2-3cm，淹涝期间保持水位的恒定，淹涝处理14d。

2)涝处理14d后，将水泥淹涝池中的水全部放尽，对茄子幼苗进行正常的田间生长管理，7d后观察茄子幼苗的恢复情况，恢复级别根据植株的恢复和死亡情况分为5级，如下：

3)根据恢复级别计算恢复指数，计算公式为：ri＝[(x1n1+x2n2+x3n3+...)/4n]×100

式中：ri——恢复指数；xi——各级涝害株数；ni——各涝害极值；n——调查总株数。

苗期耐涝性根据恢复指数分为3级，如下：

根据恢复指数值判定219份茄子材料的耐涝性强弱。恢复指数值越大，茄子耐涝性越差；恢复指数值越小，茄子耐涝性越强，恢复指数统计数据见表2。

表2涝渍胁迫条件下茄子苗期耐涝性的恢复指数分析

(2)219份茄子材料群体结构分析

1)采用ctab法提取219份茄子基因组dna，用0.8％琼脂糖凝胶检测dna纯度。将制备好的dna工作液调节浓度至50-100ng/μl，放-30℃冰箱保存备用。

2)依据合成引物的量，将引物干粉稀释成100mmol/l的母液，然后分别将上、下引物稀释到10mmol/l作为工作液备用。首先选取8份亲缘关系较远的茄子基因组dna，对813对ssr引物进行筛选，初步筛选出条带清晰、特异性好的ssr引物。再另外选取8份亲缘关系较远的茄子基因组dna对初步筛选淘汰的ssr引物进行再次筛选，第二遍筛选得到条带清晰、特异性好的ssr引物。共筛选出196对特异性ssr引物。将筛选得到的特异性ssr引物用于219份茄子材料的全基因组分子标记扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果。

①ssr的pcr扩增体系共10μl，其中2.5mmdntps0.2μl，dna(20ng/ul)1μl，primerpair(10μm)1μl，rtaq(5u)0.1μl，10×pcrbuffer(含mg2+)1μl，ddh206.7μl。

ssr的pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，55-60℃退火30sec，72℃延伸40sec，共40个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存备用。

②每一对ssr引物扩增出的条带，在不同迁移位置上有条带的读出条带大小，没有条带的记为“无”，对所有供试材料的等位基因进行记录。

3)运用structre2.3软件对群体进行基于数学模型的类群划分，并计算材料相应的q值(第i材料其基因组变异源于第k群体的概率)。进行分析时，将mcmc(markovchainmontecarlo)开始时的不作数迭代(lengthofburn-inperiod)设为30000次，将不作数迭代后的mcmc(numberofmcmcrepsafterburn-in)迭代设为100000次，k值设为2～11，并假定每个ssr标记的位点相互独立，每个k值独立运算3次，然后依据似然值最大的原则选取一个合适的k值，并获得材料相应的q值。结果显示对数似然函数值lnp(d)随着设定的k值的增大而持续增大，无法确定出可靠的k值(图1)；而当k值为3时，其模型能取得最大的δk值(图2)，并在拐点处。因此，可以确定将219份茄子品种分为3个亚群较合适，分别命名为pop1，pop2和pop3(图3)。pop1亚群类(红色)包括161份材料，主要是一些栽培品种和少量观赏品种，亲缘关系与亚群pop2、pop3较远；pop2亚群类(绿色)包含46份材料，主要来自我国北方的地方品种以及外国品种，少数来自南方品种；pop3亚群类(蓝色)共有12份材料，大部分为野生品种，其余2份材料来源于日本以及1份来源于台湾。

(3)219份茄子材料亲缘关系分析

采用spagedi软件分析和统计标记的相关信息，可以得到群体内个体之间的亲缘关系情况，即k值，此系数用于关联分析mlm模型。首先将spagedi.txt拖到软件中，依次输入相应的步骤，待程序运行完后，把数据复制到excel中进行处理。处理方法如下：对角线上的空格用1填充，小于1的数用0代替，最后所有的系数都乘以2。供试群体个体间的亲缘关系，结果如图4所示。亲缘关系kinship系数(k值)在0-2之间，大致分为4个范围。系数为0的占53.31％，说明供试群体中有二分之一以上的个体间不存在相关亲缘关系，反映了茄子材料具有一定的遗传多样性；其次系数是0-0.5的占45.93％，0.5-1之间的占0.26％，其余0.5％的在1-2之间，可见在196份茄子品种中还是有一部分材料存在一定亲缘关系，且只有极少数有着较近亲缘关系。

(4)与茄子耐涝性关联的分子标记的确定

使用tassel2.1软件的glm(generallinearmodel)程序，以步骤二群体结构分析中所得到的的各个体q值和步骤三亲缘关系分析中得到的矩阵(k值)都作为协变量计入模型，以219份茄子涝胁迫后的统计数据(恢复指数)为表型，联合以上分子数据进行关联分析，若p<0.05，则认为该标记位点是与茄子耐涝性关联的分子标记，同时得到该标记位点的表型变异解释率r²。

结果显示(表3)，检测的196个位点中，共有27个位点与茄子耐涝显著关联(p＜0.05)，占所有标记的13.78％。表3中列出了这27对ssr标记与茄子耐涝相关的表型解释率。这27对ssr标记分布于8条染色体上。分别是2、3、4、11号染色体上各1对，10号染色体2对，6、8号染色体上各3对，来自染色体1、9号上的标记最多，有5对。每个标记可解释涝胁迫抗性等级范围为0.0216-0.1448，平均表型解释率为0.0596。这27对标记中表型解释率最高的为emg21b11，表型解释率较低的是来自连锁群9上的标记emh11b18。

表3与茄子耐涝性相关的标记位点及其对表型变异的解释率

本发明获得的这27个与茄子耐涝性相关的分子标记将为今后茄子分子标记辅助育种在耐涝性茄子品种选育中的应用奠定重要基础。

以上就是对本发明具体实施例的详细描述。