引物探针组合、PCR反应液、试剂盒及其应用的制作方法

【
技术领域：
】本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测百日咳鲍特氏菌的引物探针组合/pcr反应液、试剂盒及其应用。
背景技术：
：百日咳鲍特氏杆菌(bordetellapertussis)是革兰氏阴性杆菌，其为百日咳的致病菌，仅对人类致病。典型的百日咳病程持续数周并可分为3期。卡他期(1-2周)：流涕，低热，鼻炎和轻微的咳嗽(婴儿可出现呼吸暂停/呼吸衰竭)。痉咳期(2-6周)：阵发性痉咳，多为干咳，继之深长吸气，发出“鸡鸣样”哮吼声和咳嗽声后呕吐。恢复期(≥2周)：咳嗽发作的频率和严重程度逐渐减轻。百日咳鲍特氏杆菌潜伏期为5-21天，平均为7天。患者从出现卡他等前驱症状至出现症状后3周有传染性。百日咳的临床诊断标准为：咳嗽≥2周并伴有以下症状之一：阵发性痉咳，吸气时“鸡鸣样”哮吼声或无其他病因的咳嗽后呕吐。鲍特氏菌属下的其他种如副百日咳鲍特氏菌(bordetellaparapertussis)和霍氏鲍特氏菌(bordetellaholmesii)也能感染人类并导致类似百日咳的哮吼声症状。6个月以下的婴儿患百日咳多数会出现肺炎，癫痫，脑病和严重咳嗽的并发症，甚至死亡。青少年和成人由于没有典型的“鸡鸣样”哮吼常常被漏诊，从而增加了婴儿与儿童被传播感染的风险。虽然百日咳疫苗的接种被广泛推广，世界各地仍然频繁地出现百日咳爆发。这可能与百日咳疫苗的保护效力减退以及流行菌株的抗原变异有关。目前全世界每年约有48,500,000人发病，死亡人数约为295,000人。百日咳实验室诊断的金标准是鼻咽分泌物培养。但由于细菌培养时间长,技术要求高，灵敏度低(咳嗽3周的患者仅1％-3％培养阳性)，临床未能普及。血清学方法是采用elisa方法检测血清中的百日咳特异性抗体，灵敏度为20％-90％，可适用于免疫接种效果的监控，个体免疫状态的确定，流行病学调查。分别在急性期(起病2周内)和恢复期(起病4周后)检测血清百日咳毒素(pertussistoxin,pt)的igg可以辅助临床表现不典型的病例的诊断，如成人和青少年。pcr技术已经广泛应用到呼吸道分泌物的病原体检查，灵敏度最高(73％-100％)。目前使用的百日咳鲍特氏菌的realtime-pcr试剂盒中引物针对的靶序列有百日咳毒素基因(pt),is481等。但由于鲍特菌属内的不同种之间基因组同源性很高，部分试剂盒中引物和探针会非特异性地检测霍氏鲍特氏菌或支气管炎鲍特氏菌(bordetellabronchiseptica)，造成假阳性或定量结果不准确，易误导临床诊断。因此，有必要提供一种新的技术解决上述技术问题。技术实现要素：本发明的目的是克服上述技术问题，提供一种特异性好、灵敏度高、检测效率高的用于检测百日咳鲍特氏菌的引物探针组合。本发明的技术方案是：一种引物探针组合，包括用于检测百日咳鲍特氏菌的引物和用于检测百日咳鲍特氏菌的探针，所述用于检测百日咳鲍特氏菌的引物包括上游引物和下游引物，其中，所述用于检测百日咳鲍特氏菌的上游引物如序列表中seqidno.1所示；所述用于检测百日咳鲍特氏菌的下游引物如序列表中seqidno.2所示；所述用于检测百日咳鲍特氏菌的探针如序列表中seqidno.3所示；其中所述用于检测百日咳鲍特氏菌的探针的5＇端连接有fam荧光基团，其3＇端连接有tamra淬灭基团。本发明还提供一种pcr反应液。所述pcr反应液包括所述引物探针组合。优选的，所述pcr反应液还包括荧光定量pcr扩增试剂、内标质粒、用于扩增内标质粒中内标片段的引物和用于检测内标片段的探针，所述用于扩增内标质粒中内标片段的引物包括内标片段上游引物和内标片段下游引物，其中，所述内标片段上游引物如序列表中seqidno.4所示；所述内标片段下游引物如序列表中seqidno.5所示；所述用于检测内标片段的探针如序列表中seqidno.6所示；其中，所述用于检测内标片段的探针的5＇端连接有hex荧光基团，其3＇端连接有tamra淬灭基团。优选的，所述内标片段上游引物和所述内标片段下游引物的终浓度均为0.8μm，所述用于检测内标片段的探针的终浓度为0.4μm。优选的，所述内标质粒为以puc57为载体的内标片段重组质粒，其终浓度为1×103copy/ml。优选的，所述内标质粒中内标片段的dna序列如序列表中seqidno.7所示。本发明还提供一种试剂盒。所述试剂盒包括所述pcr反应液。优选的，所述试剂盒还包括阴性质控品、阳性质控品及工作标准品。优选的，所述阴性质控品为生理盐水。优选的，所述阳性质控品为1×105copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒。优选的，所述工作标准品包括第一工作标准品、第二工作标准品、第三工作标准品和第四工作标准品，其中，所述第一工作标准品为1×103copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒；所述第二工作标准品为1×104copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒；所述第三工作标准品为1×105copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒；所述第四工作标准品为1×106copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒。优选的，所述百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒的dna序列如序列表中seqidno.8所示。本发明还提供一种试剂盒在检测百日咳鲍特氏菌中的应用。与相关技术相比，本发明提供的引物探针组合和试剂盒，有益效果在于：一、根据百日咳鲍特氏菌的基因序列，设计出特异性好的引物对和探针，提供的试剂盒可以检测出百日咳鲍特氏菌，但不能检测出鲍特菌属内其它菌种与非鲍特菌属菌，说明试剂盒具有良好的特异性。二、提供的试剂盒中还包括用于扩增内标质粒中内标片段的引物和用于检测内标片段的探针，使试剂盒可以同时针对百日咳鲍特氏菌基因组上的特异目的片段和内标质粒进行双重荧光pcr扩增实时监控反应过程，降低试剂盒的假阴性率。【附图说明】图1为本发明实施例4提供的标准品pcr扩增曲线图；图2由图1得到的标准曲线图；图3为本发明实施例4提供的阴性对照组pcr扩增曲线图；图4为本发明实施例4提供的阳性对照组pcr扩增曲线图；图5为本发明实施例4提供的样本一pcr扩增曲线图；图6为本发明实施例4提供的样本二pcr扩增曲线图；附图中，cycle为循环数，fluorescence为荧光值，logquantity为百日咳目标基因起始浓度的对数值，cq为循环数。【具体实施方式】下面将结合附图和实施方式具体实施方式对本发明作进一步说明。实施例1一种引物探针组合，用于检测百日咳鲍特氏菌。本发明提供的引物探针组合，包括用于检测百日咳鲍特氏菌的引物和用于检测百日咳鲍特氏菌的探针，所述用于检测百日咳鲍特氏菌的引物包括上游引物和下游引物，其中，所述用于检测百日咳鲍特氏菌的上游引物如序列表中seqidno.1所示：5’-ggccggtgttcatggattcg-3’；所述用于检测百日咳鲍特氏菌的下游引物如序列表中seqidno.2所示：5’-cccaccggaatcaacagcttg-3’；所述用于检测百日咳鲍特氏菌的探针如序列表中seqidno.3所示：5’-fam-ccggccagcggatcaacccgcc-tamra-3’。其中，所述用于检测百日咳鲍特氏菌的探针的5＇端连接的fam为荧光基团，其3＇端连接的tamra基团为淬灭基团。实施例2一种pcr反应液，用于检测百日咳鲍特氏菌。本发明提供的pcr反应液包括：实施例1中所述的用于检测百日咳鲍特氏菌的引物和用于检测百日咳鲍特氏菌的探针、荧光定量pcr扩增试剂、内标质粒及用于扩增内标质粒中内标片段的引物和用于检测内标片段的探针。将各组分混合后加超纯水补足体系至25μl成为pcr反应液。所述用于检测百日咳鲍特氏菌的引物包括：用于检测百日咳鲍特氏菌的上游引物和检测百日咳鲍特氏菌的下游引物，且用于检测百日咳鲍特氏菌的上游引物和检测百日咳鲍特氏菌的下游引物的终浓度均为0.8μm，所述用于检测百日咳鲍特氏菌的探针的终浓度为0.4μm。所述荧光定量pcr扩增试剂包括来自roche公司的货号为#6402682001的faststartessentialprobesmaster试剂盒中的试剂faststartessentialprobesmastermix(2×)12.5μl。本发明还设计了用于扩增内标质粒中内标片段的引物和用于检测内标片段的探针，所述用于扩增内标质粒中内标片段的引物包括内标片段上游引物和内标片段下游引物，其中，所述内标片段上游引物如序列表中seqidno.4所示：5’-ggcatgtggaggaaggtggt-3’；所述内标片段下游引物如序列表中seqidno.5所示：5’-ccatggactggctctccgtt-3’；所述用于检测内标片段的探针如序列表中seqidno.6所示：5’-hex-acgcagccctgcttcgttcgccg-tamra-3’。在pcr反应液体系中，所述内标片段上游引物和所述内标片段下游引物的终浓度均为0.8μm，所述用于检测内标片段的探针的终浓度为0.4μm。所述内标质粒为以puc57为载体的内标片段重组质粒，其终浓度为1×103copy/ml；所述内标质粒中内标片段的dna序列如序列表中为seqidno.7所示：tcacaagcaggagtgtgccaggagaaggccaaaccatccagtgccggtggtttgaccacgaggagtgcatcctgcacggagtcactgagctcgtgacctccacgctgctcgtcccctgcgctatcgagagggcactctctgtgtctcagctggtgccgctggcgcagagtgttttgggccccttaaagctcagcatggctggttctggagagatggaaaagagaaaggatttcccccatttgggtgcctcgggcatgtggaggaaggtggtccggcgaacgaagcagggctgcgtgaaggggatctgataacccacgtcaacggagagccagtccatgg。实施例3一种试剂盒，用于检测百日咳鲍特氏菌。本发明提供的用于检测百日咳鲍特氏菌的试剂盒，包括：pcr反应液、阴性质控品、阳性质控品及工作标准品。其中，pcr反应液如实施例2所述，在此不做赘述。所述阴性质控品为生理盐水。所述阳性质控品为1×105copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒；其中，百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒的dna序列如序列表中seqidno.8所示：cgtgacctccacgctgctcgtcccctgcgctattctgtcctcgcggctgccgcgccacaagcagatctggatcgagattttcggggtggtgttctttctgctgccggcgtgcaccctgatcatggttctgtcgtggccggtgttcatggattcgtacctgagcggcgagcagtcgtcgaactcgggcgggttgatccgctggccggtcaagctgttgattccggtggggtttgcgctgctggtgctggcggggctgtcgcacctgatcaagtgcatcgggtatcgagagggcactctctgtgtctcagctggtgccgctggcgcagtgttttgggcccct。所述工作标准品包括第一工作标准品、第二工作标准品、第三工作标准品和第四工作标准品，其中，所述第一工作标准品为1×103copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒；所述第二工作标准品为1×104copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒；所述第三工作标准品为1×105copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒；所述第四工作标准品为1×106copy/ml的以puc57为载体的百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒。所述工作标准品中，百日咳鲍特氏菌的基因片段重组质粒的dna序列如序列表中seqidno.8所示：cgtgacctccacgctgctcgtcccctgcgctattctgtcctcgcggctgccgcgccacaagcagatctggatcgagattttcggggtggtgttctttctgctgccggcgtgcaccctgatcatggttctgtcgtggccggtgttcatggattcgtacctgagcggcgagcagtcgtcgaactcgggcgggttgatccgctggccggtcaagctgttgattccggtggggtttgcgctgctggtgctggcggggctgtcgcacctgatcaagtgcatcgggtatcgagagggcactctctgtgtctcagctggtgccgctggcgcagtgttttgggcccct。本发明提供的用于检测百日咳鲍特氏菌的试剂盒可在-10℃±5℃避光条件下储存，避免反复冻融，该试剂盒适用的荧光定量pcr仪可选用：rochelightcycler480、abi7500、abi7300、bio-radiq5tm、stratagenemx3000p、stratagenemx3005p和达安7000等中的一种。实施例4采用本发明实施例3提供的用于检测百日咳鲍特氏菌的试剂盒，检测百日咳鲍特氏菌。临床试验如下：样品采集：采集373例临床初步怀疑为百日咳的患者的咽拭子标本。用棉拭子取咽部分泌物，置入装有生理盐水试管中，密封送检。所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。样本提取：将咽拭子管振荡1-2分钟，取1-1.5ml至离心管中，15000rpm离心5分钟。去除上清，留约50μl混匀，加等量的dna提取液，100℃恒温金属浴10分钟。dna提取液成分为naoh(25mm)，tris-hcl(10mm,ph＝8.0)，tritonx-100(1％)，np-40(1％)，chelex-100(2％)，edta(0.1mm,ph＝8.0)。其中，tris-hcl表示三(羟甲基)氨基甲烷，tritonx-100表示聚乙二醇辛基苯基醚，np-40表示乙基苯基聚乙二醇，chelex-100表示聚苯乙烯二乙烯基苯，edta表示乙二胺四乙酸二钠。加样体系：本发明中的pcr反应液包括pcr扩增试剂、用于检测百日咳鲍特氏菌的引物和用于检测百日咳鲍特氏菌的探针、内标质粒及用于扩增内标质粒中内标片段的引物和用于检测内标片段的探针，具体如实施例2所述，加样体系如下：样本孔组分名称加量引物seqidno：1终浓度0.8μm引物seqidno：2终浓度0.8μm引物seqidno：4终浓度0.8μm引物seqidno：5终浓度0.8μm探针seqidno：3终浓度0.4μm探针seqidno：6终浓度0.4μm内标质粒终浓度103copy/mlfaststartessentialprobesmastermix(2×)体积12.5μl样本5μl总体积25μl阴性对照孔阳性对照孔组分名称加量引物seqidno：1终浓度0.8μm引物seqidno：2终浓度0.8μm引物seqidno：4终浓度0.8μm引物seqidno：5终浓度0.8μm探针seqidno：3终浓度0.4μm探针seqidno：6终浓度0.4μm内标质粒终浓度103copy/mlfaststartessentialprobesmastermix(2×)体积12.5μl阳性质控品5μl总体积25μl标准品孔荧光定量pcr反应：对应上述加样体系，将试剂盒中各成分分别装入pcr仪的各pcr反应管中，进行pcr扩增反应，具体反应步骤如下：95℃、10min，1个循环；95℃、10s，60℃、30s(收集荧光)，40个循环；40℃、10s，1个循环。结果判定：内参(hex)样本(fam)判定结果阴性阳性有效阴性阴性无效阳性阴性有效阳性阳性有效其中，扩增试验中当cq值小于28为阳性；cq值大于32为阴性；28≤cq≤32为临界阳性。以下分别通过标准品组、阴性对照组、阳性对照组和样品组的pcr扩增曲线图，详细说明本发明提供的试剂盒的性能。标准品扩增曲线与标准曲线请参阅图1，为本发明实施例4提供的标准品pcr扩增曲线图。图1中曲线a表示浓度为106copy/ml的工作标准品的扩增曲线；曲线b表示浓度为105copy/ml的工作标准品的扩增曲线；曲线c表示浓度为104copy/ml的工作标准品的扩增曲线；曲线d表示浓度为103copy/ml的工作标准品的扩增曲线。其余曲线为对应的内标质粒扩增曲线。由图1可以得出不同浓度的工作标准品和对应的内标质粒在扩增实验中的cq值，结果如下：标准品浓度(copy/ml)百日咳目的基因cq值内参基因cq值10324.8328.2610421.5927.8010518.2927.5810614.8927.63请参阅图2，为由图1得到的标准曲线图。标准曲线方程：y＝-3.3443x+35.96，r2＝1，标准偏差0.1。阴性对照组pcr扩增曲线请参阅图3，为本发明实施例4提供的阴性对照组pcr扩增曲线图。图3中曲线a表示百日咳目的基因(fam荧光)pcr扩增曲线，曲线b表示内标质粒(hex荧光)pcr扩增曲线。结合图2所示的标准曲线可以的得出：cq浓度fam--hex28.851.337e+2阳性质控品pcr扩增曲线请参阅图4，为本发明实施例4提供的阳性质控品pcr扩增曲线图。图4中曲线a表示百日咳目的基因(fam荧光)pcr扩增曲线，曲线b表示内标质粒(hex荧光)pcr扩增曲线。结合图2所示的标准曲线可以得出：cq浓度fam18.291.922e+5hex27.583.205e+2样本pcr扩增曲线本实施例中仅展示其中的两个样本(样本一、样本二)的pcr扩增曲线。请参阅图5，为本发明实施例4提供的样本一pcr扩增曲线图。图5中曲线a表示百日咳目的基因(fam)pcr扩增曲线，曲线b表示内标质粒(hex)pcr扩增曲线。结合图2所示的标准曲线，可以得出：cq浓度fam22.997.556e+3hex28.881.309e+2请参阅图6，为本发明实施例4提供的样本二pcr扩增曲线图。图6中曲线a表示百日咳目的基因(fam)pcr扩增曲线，曲线b表示内标质粒(hex)pcr扩增曲线。结合图2所示的标准曲线，可以得出：cq浓度fam35.381.491e+0hex29.021.189e+2灵敏度与特异度判定：与临床诊断为金标准：项目灵敏度特异度本试剂盒0.9650.933需要说明的是，本发明提供的引物探针组合、试剂盒对肺炎支原体(m.pneumonia)、eb病毒(epstein-barrvirus)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、人类巨细胞病毒(humancytomegalovirus)、肠道病毒(enterovirus)等病原体物种无交叉反应。与相关技术相比，本发明提供的引物探针组合和试剂盒，有益效果在于：一、根据百日咳鲍特氏菌的基因序列，设计出特异性好的引物对和探针，提供的试剂盒可以检测出百日咳鲍特氏菌，但不能检测出鲍特菌属内其它菌种与非鲍特菌属菌，说明试剂盒具有良好的特异性。二、提供的试剂盒中还包括用于扩增内标质粒中内标片段的引物和用于检测内标片段的探针，使试剂盒可以同时针对百日咳鲍特氏菌基因组上的特异目的片段和内标质粒进行双重荧光pcr扩增实时监控反应过程，降低试剂盒的假阴性率。以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。序列表<110>深圳市儿童医院深圳市泰尔迪恩生物信息科技有限公司<120>引物探针组合、pcr反应液、试剂盒及其应用<130>20170522<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ggccggtgttcatggattcg20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2cccaccggaatcaacagcttg21<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3ccggccagcggatcaacccgcc22<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ggcatgtggaggaaggtggt20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5ccatggactggctctccgtt20<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6acgcagccctgcttcgttcgccg23<210>7<211>339<212>dna<213>人工序列<400>7tcacaagcaggagtgtgccaggagaaggccaaaccatccagtgccggtggtttgaccacg60aggagtgcatcctgcacggagtcactgagctcgtgacctccacgctgctcgtcccctgcg120ctatcgagagggcactctctgtgtctcagctggtgccgctggcgcagagtgttttgggcc180ccttaaagctcagcatggctggttctggagagatggaaaagagaaaggatttcccccatt240tgggtgcctcgggcatgtggaggaaggtggtccggcgaacgaagcagggctgcgtgaagg300ggatctgataacccacgtcaacggagagccagtccatgg339<210>8<211>340<212>dna<213>人工序列<400>8cgtgacctccacgctgctcgtcccctgcgctattctgtcctcgcggctgccgcgccacaa60gcagatctggatcgagattttcggggtggtgttctttctgctgccggcgtgcaccctgat120catggttctgtcgtggccggtgttcatggattcgtacctgagcggcgagcagtcgtcgaa180ctcgggcgggttgatccgctggccggtcaagctgttgattccggtggggtttgcgctgct240ggtgctggcggggctgtcgcacctgatcaagtgcatcgggtatcgagagggcactctctg300tgtctcagctggtgccgctggcgcagtgttttgggcccct340当前第1页12