人和小鼠PDX模型有关交叉污染检测试剂盒及检测方法与流程

本发明是关于在患者来源异种移植(pdx，patientderivedxenograft)模型中，检测患者来源基质肿瘤及小鼠基质肿瘤比率的。随着上述异种移植模型代的建立，人的癌组织及癌细胞消失，转变为小鼠基质，人与小鼠基质比率也随着变化，本发明是有关检测癌组织或癌细胞发生根源的方法的。更具体就是包括可检测小鼠与人的基因交叉污染的引物(primer)及探针(probe)的检测试剂，及其试剂盒和对人细胞的小鼠遗传因子交叉污染的检测方法。

背景技术：

最近互相竞争研究利用针对患者的抗癌治疗克服癌症。在抗癌治疗药物的开发过程中，决定新药剂能否投入临床试验的临床前评估是为选定高成功率治疗剂的重要过程，此时利用的理想模型要能够满足预测正确治疗反映，理解先行目标分子途径，药动学或药力学分析的简易性等多种条件。现在进行新抗癌治疗剂的临床前评估的三种主要模型有：转基因模型(geneticallyengineeredmodels)，基于人源肿瘤细胞株的异种移植模型(xenograftsderivedfrom人tumorcelllines)及把患者来源肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠的异种移植模型(tumorgraftsfrompatientsimplanteddirectlyintoimmunodeficientmice)。

在过去的几十年，基于代表多种癌的细胞株面板的异种植模型在实际临床中成功预测率低，被指为主要极限。为了克服此极限，提示了把外科切除的患者来源肿瘤组织移植到免疫缺陷鼠的pdx模型。患者来源异种移植(pdx，patientderivedxenograft)及细胞来源异种移植(cdx，cellderivedxenograft)肿瘤模型可提供新药开发所需的临床模型，pdx模型在小鼠模型更好地摘要患者的实际临床状况，广泛用在临床前研究中接近新的抗癌剂。pdx模型是把外科切除的患者组织移植到免疫缺陷鼠并成瘤的过程，异种移植的组织可依次传代培养、冻存及复苏(revive)。并且，在连续的传代过程中，初期保持的患者来源基质渐渐被小鼠基质代替，其绝对量减少，相对的肿瘤和基质的比率维持初时状态。通过在初期和后期传代异种组织进行的基因表现模式的对比，可推测随时间的基质特性变化，并且只对人和小鼠各个选择性基因表现进行矩阵分析，可分离肿瘤与肿瘤周围微环境进行分析。因此，在pdx及cdx肿瘤模型，测量患者来源基质的肿瘤与小鼠基质肿瘤的比率，需要简易检测在传代过程中初期维持的患者来源基质渐渐被小鼠基质细胞代替时可出现的小鼠来源组织交叉污染的方法。

在先技术文献，专利文献：(专利文献1)kr2014-0133399a、(专利文献2)us2015-0253340a1、(专利文献3)jp2012-175928a、(专利文献4)jp2007-209281a。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供：在pdx模型测量患者来源基质肿瘤与小鼠基质肿瘤的比率，检测有关交叉污染的试剂盒，及其检测交叉污染的方法。

本发明提供：在pdx模型或cdx模型移植组织及细胞的连续传代过程中，初期保持的患者来源基质渐渐被小鼠基质细胞代替，此时可发生的小鼠来源组织污染的简易检测方法。比如，本发明是有关检测人与小鼠异种移植细胞中包含的患者来源基质肿瘤与小鼠基质肿瘤比率的，包括引物(primer)与探针(probe)的检测试剂盒，可利用上述检测试剂盒分析小鼠来源组织的污染。尤其是，上述检测试剂盒在组织，pdx模型或cdx模型等的样本中迅速、正确自动检测污染与否及其基因型时特别有效。并且，根据上述检测方法，可掌握全部小鼠有关基因的污染，检测灵敏性及特异性高达近100％，可迅速检测基因的污染度。

本发明辨别pdx细胞的检测试剂盒包括：以序列号1-4(即，seqidno.1-4)碱基序列组成的寡核苷酸引物，及以序列号9，10(即，seqidno.9、10)碱基序列组成的寡核苷酸探针。比如，上述以序列号1，2碱基序列组成的寡核苷酸引物可能是人性白蛋白基因扩增用引物，上述以序列号3，4碱基序列组成的寡核苷酸引物是小鼠白蛋白基因扩增用引物。上述以序列号1-4碱基序列组成的寡核苷酸引物与各基因特异部位互补配对，可扩增人性白蛋白基因及小鼠白蛋白基因。因此，利用包括上述以序列号1-4碱基序列组成的寡核苷酸引物，以序列号9，10碱基序列组成的寡核苷酸探针的检测试剂盒，测量人与小鼠异种移植细胞中包含的人性白蛋白基因及小鼠白蛋白基因比率，可分析pdx细胞的污染程度。

并且，上述检测试剂盒利用检测扩增基因的标识手段，辨别人与小鼠异种移植细胞中包含的基因比率为特征。在一个实施例中，上述标识手段可使用cy3，cy5，cy5.5，bodipy，alexa488，alexa532，alexa546，alexa568，alexa594，alexa660，若丹明(rhodamine)，tamra，fam，fitc，fluorx，rox，texasred，orangegreen488x，orangegreen514x，hex，tet，joe，oyster556，oyster645，bodipy630/650，bodipy650/665mcalfluororange546，calfluorred610，quasar670，hex，vic，bhq，bhq1，mgb，zen及生物素组成的群体中选择一个以上标识手段，最理想的是可使用fam，hex，mgb或者bhq1。

本发明辨别pdx细胞的检测试剂盒的另一实施例，还可包括：以序列号5-8(即，seqidno.5-8)碱基序列组成的寡核苷酸引物及以序列号11，12(即，seqidno.11、12)碱基序列组成的寡核苷酸探针。比如，上述以序列号5-8碱基序列组成的寡核苷酸引物可能是扩增人性papola基因的引物，上述以序列号7及8碱基序列组成的寡核苷酸引物是扩增小鼠papola基因的引物。上述以序列号5-8碱基序列组成的寡核苷酸引物与各基因的特异部位互补配对，可扩增人性papola基因及小鼠papola基因。因此，利用包括上述以序列号5-8碱基序列组成的寡核苷酸引物，以序列号11及12碱基序列组成的寡核苷酸探针的检测试剂盒，测量人与小鼠异种移植细胞中包含的人性papola基因及小鼠papola基因的比率，可检测pdx细胞的污染程度。

因此，本发明辨别pdx细胞的检测试剂盒，可包括：以序列号1-8(即，seqidno.1-8)碱基序列组成的寡核苷酸引物及以序列号9，12(即，seqidno.9-12)碱基序列组成的寡核苷酸探针。利用上述检测试剂盒，可以测量人与小鼠异种移植细胞中包含的人性白蛋白基因与小鼠白蛋白基因比率及人性papola基因与小鼠papola基因比率。

并且，本发明利用聚合酶链反应(pcr，polymerasechainreaction)，尤其是利用conventionalpcr，real-timepcr或ddpcr(dropletdigitalpcr)实时进行聚合酶链反应，可在pdx细胞中测量人与小鼠基因的比率。关于本发明，上述’聚合酶链反应’或’pcr(polymerasechainreaction)’是包括一般(非定量)pcr及定量pcr，比如，可用于指一般pcr及实时pcr都包括在内，或者根据上下文，可理解为单指’一般pcr’。

在一实施例，上述辨别pdx细胞的检测试剂盒中，寡核苷酸探针浓度可以是1pmol以上，此时，可提高检测pdx细胞污染程度的灵敏性。比如，在使用real-timepcr扩增基因时，寡核苷酸探针浓度是1pmol，使用ddpcr扩增基因时，寡核苷酸探针浓度可以是5pmol。

本发明又涉及，使用前述检测试剂盒参与辨别对人细胞的小鼠基因污染度的方法。

实施例的本发明辨别污染度的方法可利用前述检测试剂盒进行，因此，前述与检测试剂盒记载内容重复事项加以省略。

本发明辨别对人细胞小鼠基因污染度的一实施例包括：利用以序列号1-4碱基序列组成的寡核苷酸引物，用pcr方式扩增人性白蛋白基因及小鼠白蛋白基因的阶段；以序列号9及10碱基序列组成的寡核苷酸探针加水分解的阶段；及包括检测与上述探针配对的标识手段的阶段。依据上述污染度检测方法，在pdx模型可测量人的白蛋白基因及小鼠白蛋白基因的比率。

本发明检测污染度的另一实施例包括：使用以序列号5-8碱基序列组成的寡核苷酸引物进行pcr方式扩增人的papola基因及小鼠papola基因的阶段；以序列号11，12碱基序列组成的寡核苷酸探针加水分解的阶段；及包括检测与上述probe配对的标识手段的阶段。依据上述污染度检测方法，在pdx模型可测量人的papola基因及小鼠papola基因的比率。

更深入地，上述检测对人细胞的小鼠基因污染度的方法可执行如下。比如，上述污染检测方法可由如下7个阶段构成。

1.准备标准及对照群样本

本发明是关于检测在pdx模型储存过程中发生的小鼠基质细胞污染与否的，利用real-timepcr试剂盒的污染度检测方法。为此，有关各基因的标准及对照群样本由合成minigene准备。在一实施例，上述样本可在pdx模型或cdx模型的组织或患者来源离体组织(细胞)获得。

2.分离dna

从上述阶段1得到的各种样本，建立适当的方式分离dna。

3.单一(single)real-timepcr

研制了人性白蛋白基因，小鼠白蛋白基因，人性papola基因及小鼠papola基因，4种基因各个扩增的寡核苷酸引物，建立了适当real-timepcr条件，上述real-timepcr是用单一pcr进行的，改变各基因所属引物浓度，建立了各个条件。

4.确保克隆

合成含上述各基因所在dna片段的克隆。当本发明的检测试剂盒反映条件建立，上述克隆被用作标准及对照群的样本。

5.探针设计

设计了在real-timepcr过程中用加水分解反映掌握人性白蛋白基因、白鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因，4种house-keeping基因的寡核苷酸探针。

比如，与上述目标基因配对的目标probe是具有序列号912碱基序列的taqmanprobe，最好是在3’末端配对mgb或bhq。

6.在real-timepcr装备反映及检测条件的建立

把上述阶段4中得出的各类型克隆合成一个或两个，与以多种浓度组成的标准样本为主型，把小鼠与人性基因单一pcr扩增，进行加水分解后，使用realtimepcr分析，建立适当条件。

7.利用real-timepcr试剂盒，检测pdx样本

在上述阶段3进行pcr后，以测序反映确定基因类型的pdx样本dna为对象，重新进行单一real-timepcr，用realtimepcr装备分析。因此，检测了本发明试剂盒的灵敏性、特异性、再现性，重新建立了分析污染程度的最佳条件。

8.ddpcr装备中反映及检测条件的建立

把上述阶段4中得到的各类型克隆，合成一个或两个，与多种浓度组成的标准样本为主型，把小鼠与人性基因单一pcr扩增、进行加水分解后，用ddpcr装备分析，建立了适当条件。

9.利用ddpcr(dropletdigitalpcr)，检测pdx样本

在上述阶段3进行pcr后，以测序反映确定基因类型的pdx样本dna为对象，重新进行单一real-timepcr，用ddpcr装备分析。因此，检测了本发明试剂盒的灵敏性、特异性、再现性，重新建立了分析污染程度的最佳条件。

另外，在一实施例中，包括本发明寡核苷酸探针，寡核苷酸引物及标识手段的检测试剂盒使用dna，是用在pdx模型或cdx模型样本中提取

提取dna的试剂commercial产品(manual方式或自动化方式)提取的dna。

包括：1)有关人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因，4种基因的real-timepcr扩增试剂，2)扩增基因时用作阳性对照群的质粒dna克隆，3)分析污染度用寡核苷酸探针，还可包括利用上述试剂盒的real-timepcr反映所需的所有反映溶液。

因此，本发明辨别人与小鼠有关基因交叉污染检测试剂盒及辨别pdx细胞的检测试剂盒及其检测污染方法，可迅速、正确分析在pdx模型或cdx模型中小鼠基因污染与否及其基因类型，进一步通过聚合酶链反应(polymerasechainreaction；pcr)可定量显示人与小鼠有关基因的污染程度。

与现有技术相比，发明的有益效果如下：

本发明是关于辨别pdx细胞的检测试剂盒及检测污染方法的，根据本发明可掌握全部小鼠有关基因的污染，检测灵敏性及特异性接近高达100％，检测迅速，对检测小鼠污染非常有效。

因此，本发明通过提早预测人与小鼠有关基因的污染，可用在利用pdx模型或cdx模型的抗癌剂有效性评估，对利用pdx模型或cdx模型的细胞银行做出具大的贡献，在医疗产业具有非常有用的效果。

附图说明

图1为本发明利用迷你克隆的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的conventionalpcr结果；

图2为本发明利用人性gdna和小鼠gdna的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的conventionalpcr结果；

图3，图4及图5为本发明利用迷你克隆0.01ng的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的real-timepcr结果；

图6及图7为本发明利用人性gdna和小鼠gdna的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的real-timepcr结果；

图8为本发明利用迷你克隆的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因的ddpcr结果；

图9为本发明利用迷你克隆的人性papola基因及小鼠papola基因的ddpcr结果；

图10为本发明利用人性gdna和小鼠gdna的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因的ddpcr结果；

图11为本发明利用与人性gdna和小鼠gdna的人性papola基因及小鼠papola基因的ddpcr结果；

图12为本发明利用与患者组织同一组织的pdx模型gdna的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因的real-timepcr结果；

图13为本发明利用与患者组织同一组织的pdx模型gdna的人性papola基因及小鼠papola基因的real-timepcr结果；

图14为本发明利用与患者组织同一组织的pdx模型gdna的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因的ddpcr结果；

图15为本发明利用与患者组织同一组织的pdx模型gdna的人性papola基因及小鼠papola基因的ddpcr结果。

具体实施方式

以下利用本发明的实施例更详细说明，但本发明的申请范围不只局限于如下提示的实施例。

本发明是关于迅速、正确检测在pdx模型或cdx模型的培养过程中发生的小鼠基因污染，也可在pdx模型或cdx模型银行sop时有用的污染检测试剂盒及其方法。

以下，如下说明的实施例可有多种形态的变形，本发明的范围并不局限于如下所述的实施例中。本发明的实施例是为向所属领域具有平常知识的人更能完整地说明本发明而提供的。

实施例

1)准备对照群样本及提取dna

本发明中利用dneasy，血液和组织试剂盒(blood&tissuekit)(qiagne，69506)提取了dna，但为执行本技术，使用商业产品提取了dna。使用本试剂盒提取dna的方法如下。

①把患者来源组织及患者来源异种移植或细胞来源异种移植组织装到离心管中，300xg离心分离5分钟，用200μlpbs化开。

②蛋白酶k添加20μl。

③加缓冲液al200μl，涡旋后，在56℃反应10分钟。加入乙醇(96-100％)200μl，涡旋后混合。

④把上述混合物装到插在2ml收集试管的dneasymini旋转柱中，以8,000rpm离心分离1分钟。(去除收集试管滤出的溶液)。

⑤把dneasymini旋转柱移到新的2ml收集试管中，加入缓冲液aw1500μl，以8,000rpm离心分离1分钟。(除去收集试管滤出的溶液)

⑥把dneasymini旋转柱移到新的2ml收集试管后，加缓冲液aw2500μl，以14,000rpm离心分离3分钟。(除去收集试管滤出的溶液).

⑦把dneasymini旋转柱移到新的2ml收集试管后，以14,000rpm离心分离1分钟。(除去收集试管滤出的溶液).

⑧把dneasymini旋转柱装到干净的1.5ml或2ml微量离心管后，直接把缓冲液ae200μl滴入到dnase膜中。在室温反应3分钟，以8,000rpm离心分离。

这样提取的dna判定基准如下。

dna或rna在260nm波长显示最高吸光度，紫外线吸收辐射量与dna量成比，在260nm波长吸光度值为1.0时，ds-dna显示50μg/ml的浓度。因此，假设纯dna，在260nm波长的吸光度值为2.0，ds-dna显示100μg/ml的浓度。在类似波长可干涉物质有蛋白质，苯酚等，它们在280nm波长显示最高吸光度。如此，当存在干涉物质时，可利用260nm波长与280nm波长的吸光度比率(a260/a280)判断与其他物质的污染与否。当没有干涉物质的纯dna时，260nm波长与280nm波长的吸光度比率(a260/a280)显示值在1.8以上，当此值为2.0，可定义此为100％纯dna(或是rna)。若，被蛋白质或phenol等污染时，260nm波长与280nm波长的吸光度比率(a260/a280)显示值在1.8以下。此时，也可能是试料定量不准。当波长吸光度为1时，ds-dna显示50μg/ml，ss-dna是33μg/μl，rna是40μg/ml，低聚物显示25-35μg/ml浓度。

并且，提取dna的纯度测定值为a260/a280比率是1.8至2.1，a260/a230比率是1.5至2以上范围内。

2)标准及对照群样本的准备

上述基因型检测中成为标准物质的有关基因的人性白蛋白基因、小鼠的白蛋白基因、人性papola基因及小鼠的papola基因，包括以上4种基因的质粒dna克隆合成作备。

3)单一(single)real-timepcr

为了检测pdx模型或cdx模型培养过程中会产生的交叉污染，各个扩增了人与小鼠基因。为了把它们pcr扩增，先选择并研制了寡核苷酸引物。

本发明中发明的引物是利用按人与小鼠区分的housekeeping基因设计的。

本发明的引物是以检测4种基因，即人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的引物(序列号1-8，即，seqidn0.1-8)构成，人性白蛋白和papola基因及小鼠白蛋白及papola基因的pcr各扩增142，131，134，133bp长度的产物。各基因的pcrprime核酸序列显示在如下表1中。

表1

4)试剂盒probe的研制

为了研制人与小鼠有关基因寡核苷酸探针，研制了搜索选定housekeeping基因基因型的寡核苷酸probe(序列号9-12，即seqidn0.9-12)。

本发明的上述寡核苷酸探针设计根据本发明的目的，与人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因，4种基因各自特异配对的基因型特异探针(genotypespecificprobe)设计了寡核苷酸，确保dna序列利用电脑程序pyromarkassaydesign或primer3设计了基因型特异探针。

此时，上述寡核苷酸探针的长度设置为23±2bp的寡核苷酸，第1步设计了4种类型特异探针，为检测上述小鼠基质细胞污染(contamination)与否的人与小鼠有关基因型检测相关试剂及其试剂盒，各自以人性白蛋白和papola基因及小鼠白蛋白和papola基因，共4种基因为检测标识。比如，上述目标基因配对的目标探针是具有序号9-12碱基序列的taq人探针，与3末端的mgb或bhq配对为较理想。

上述寡核苷酸探针的序号及类型整理如下表2。

表2

5-1)常规pcr反应及检测条件的建立

上述3)单一(single)real-timepcr中建立的人与小鼠有关基因各类型克隆为主型，把人与小鼠有关基因在conventionalpcr扩增后，进行电泳确认各自的基因扩增。

为了确认人与小鼠有关基因基因型的pcr组成及条件执行如下：

常规pcr组成及条件

1.组成

表3

如上表，准备pcr混合物。

2.程序(program)

表4

在pcr机用上述程序pcr后，确认电泳扩增的各个扩增子(pct产物)。

利用迷你克隆的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的conventionalpcr结果如图1所示，利用人的gdna与小鼠gdna的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的conventionalpcr结果如图2所示。

5-2)real-timepcr反应及检测条件的建立

上述3)单一(single)real-timepcr中建立的人与小鼠有关基因各类型克隆为主型，把人与小鼠有关基因用real-timepcr确认了各个基因的扩增。

为了确认人与小鼠有关基因基因型的real-timepcr的组成及条件执行如下：

real-timepcr组成及条件

1.组成

表5

2.程序

在pcr机利用如下程序pcr。

表6

但，合成探针的寡核苷酸5’末端标识手段，人使用fam，小鼠使用hex荧光；各寡核苷酸3’末端标识手段使用mgb或bhq1。

利用迷你克隆0.01ng的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的real-timepcr结果显示在图3，图4及图5中，利用人的gdna及小鼠gdna的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因、人性papola基因及小鼠papola基因的real-timepcr结果显示在图6及图7中。

5-3)ddpcr反应及检测条件的建立

上述3)单一(single)real-timepcr中建立的人与小鼠有关基因各类型克隆为主型，把人与小鼠有关基因用ddpcr确认各个基因扩增。

为了确认人与小鼠有关基因基因型的ddpcr组成及条件执行如下：

ddpcr组成及条件

1.组成

1.1片段基因minigene，pcr混合物制作如下表。

①在如下表同一条件，加入限制酶，在55℃反应5分钟。

表7

②用细胞核凝胶(neucleospingel)和pcr净化，纯化酶消化产物。

③qubit定量，利用其定量值计算复制数进行试验。

④miniclonepcr混合物制作如下表

表8

注意：引物最终浓度：900nm，探针最终浓度250nm。

1.2pdx样品提取的gdna，pcr反应混合物制作如下表。

表9

①gdna，异植肿瘤模型(patientderivedxenograftmodel，pdx)的聚合酶链反应(pcr)液在rt上培养10分钟，限制性内切酶点hindiii分解。

②在萃取柱支板(cartridgeholder)上安装微滴发生器的固相萃取柱(cartridge)。

③利用通道电子移液器(channelelectronicpipette)在pcr八联排管中取20ul，放置在固相萃取柱(cartridge)的样品槽中上样。

注意：将8通道电子移液器的速度设置成最慢再使用。

备注：假如固相萃取柱(cartridge)里的样品无法填充电子移液器的8个通道的话，在剩余的圆柱形装料器中将2倍浓度的微滴式数字聚合酶链超级反应液和蒸馏水按照1∶1的比例混合，各取20ul。

④取70ul的微滴发生油，置于固相萃取柱(cartridge)的油置槽中。

⑤区分微滴发生器垫圈的上下后进行安装，放入qx200^tm微滴发生器后，微滴自动生成。

⑥利用8通道复式移液器，取40ul的已生成的微滴，移至96孔反应板上。

⑦可刺穿密封膜的热封仪pierceablefoilheatseal(bio-rad，181-4040)的红线朝上，盖上反应板，用px1^tm聚合酶链热封仪(180℃，加热5秒)进行密封。

2.程序

在digitalpcrmachine中用如下程序pcr。

表10

但，合成探针probe的寡核苷酸5’末端标识手段，人使用hex荧光，小鼠使用fam荧光；各寡核苷酸3’末端标识手段使用mgb或bhq1。

利用迷你克隆的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因的ddpcr结果如图8所示，利用迷你克隆的人性papola基因及小鼠papola基因的ddpcr结果如图9所示。利用人性gdna与小鼠gdna的人性白蛋白基因、小鼠白蛋白基因的ddpcr结果如图10所示，利用人性gdna与小鼠gdna的人性papola基因及小鼠papola基因的ddpcr结果如图11所示。

6)利用hu-moid试剂盒在临床样本(如pt：制作pdx之前患者的组织样本)及pdx样本(dp.p0：pdx0代样本，p1：pdx1代样本)中检测。

依照上述5-2)real-timepc反应及检测条件的建立及5-3)ddpcr反应及检测条件的建立中记述的方法，种植临床样品及同一组织进行传代培养，利用得到的pdx模型组织进行real-timepcr及ddpcr检测。

使用与患者组织同一组织pdx模型利用gdna的人性白蛋白基因及小鼠白蛋白基因的real-timepcr结果显示在图12中，使用与患者组织同一组织pdx模型利用gdna的人性papola基因及小鼠papola基因的real-timepcr结果显示在图13中。

如图12所示，在pdx002-pt(患者002)人性白蛋白基因显示为29.91，小鼠白蛋白基因显示为35.26，在pdx002-p0(患者002的pdx0代)人性白蛋白基因显示为27.56，小鼠白蛋白基因显示为25.68，在pdx002-1-1-p1(患者002的pdx1代)人性白蛋白基因显示为27.34，小鼠白蛋白基因显示为26.59。另外，在pdx005-pt(患者005)人性白蛋白基因显示为29.96，在pdx005-1-p0(患者005的pdx0代)人性白蛋白基因显示为27.77，小鼠白蛋白基因显示为28.24。即，上述结果显示pdx模型每代的人性白蛋白基因及小鼠白蛋白基因，由此可知小鼠来源组织的污染程度。

并且，如图13所示，在pdx002-pt(患者002)人性papola基因显示为29.17，在pdx002-p0(患者002的pdx0代)人性papola基因显示为27.21，小鼠papola基因显示为27.01。在pdx002-1-1-p1(患者002的pdx1代)人性papola基因显示为27.17，小鼠papola基因显示为28.75，在pdx005-pt(患者005)人性papola基因显示为28.75，pdx005-1-p0(患者005的pdx0代)人性papola基因显示为26.83，小鼠papola基因显示为29.58。即，上述结果显示pdx模型每代的人性papola基因及小鼠papola基因，由此可知小鼠来源组织的污染程度。

使用与患者组织同一组织pdx模型利用gdna的人性白蛋白基因及小鼠白蛋白基因的ddpcr结果显示在图14中。使用与患者组织同一组织pdx模型利用gdna的人性papola基因及小鼠papola基因的ddpcr结果显示在图15中。

如图14所示，在pdx002-pt(患者002)人性白蛋白基因显示为84，在pdx002-1-p0(患者002的pdx0代)人性白蛋白基因显示288，小鼠白蛋白基因显示410。在pdx002-1-1-p1(患者002的pdx1代)人性白蛋白基因显示396，小鼠白蛋白基因显示208。另外，在pdx005-pt(005)人性白蛋白基因显示102，在pdx005-1-p0(患者005的pdx0代)人的白蛋白基因显示336，小鼠白蛋白基因显示为68.即，上述结果显示在pdx模型每代的人性白蛋白基因及小鼠白蛋白基因，由此可知小鼠来源组织的污染程度。

另外，如图15所示，在pdx002-pt(患者002)人性papola基因显示为106，在pdx002-1-p0(患者002的pdx0代)显示人性papola基因为236，小鼠papola基因为388，在pdx002-1-1-p1(患者002的pdx1代)显示人性papola基因为290，小鼠papola基因为202。并且，在pdx005-pt(患者005)显示人性papola基因为392，小鼠papola基因为60。即，上述结果显示在pdx模型每代的人性papola基因及小鼠papola基因，由此可知小鼠来源组织的污染程度。

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<120>人和小鼠pdx模型有关交叉污染检测试剂盒及检测方法

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