本发明涉及医药实验领域，尤其涉及一种干燥综合征小鼠模型的造模方法。
背景技术：
干燥综合征(Sjogren Syndrome,SS)是一种以侵犯唾液腺和泪腺为主要特征的慢性炎症性自身免疫病。干燥综合征根据发病原因可分为原发性和继发性两种。原发性干燥综合征(primary Sjogren Syndrome,pSS)是一种全球性疾病，好发于女性和老年人，男女比例约为1:9～1:20。口干、眼干是该病典型的临床症状，部分患者还会出现间歇性腮腺炎和后期的猖獗性龋齿；此外包括其他不典型的腺外系统症状。
目前国内外主要的干燥综合征动物模型为鼠类，包括两大类，即自发型和诱发型。自发型动物模型，主要有非肥胖型糖尿病(NOD，non-obese diabetic disease)小鼠、新西兰黑鼠(NZB，New Zealand black)和新西兰白鼠(NZW,New Zealand white)杂交F1代小鼠、MRL/lpr小鼠等。自发型动物模型的选择一般继发于一种弥漫性结缔组织病，因其在发病前期或者发病过程都表现出与人类干燥综合征相似的症状而被用于动物模型进行研究。诱发型动物模型是一种主要在局部模拟人类干燥综合征的方法，主要包括注射抗原、接种病毒或组织匀浆等。目前有用Balb/c小鼠颌下腺匀浆与弗氏完全佐剂混合制成的抗原注射入同种小鼠足垫和背部皮下，并且用百日咳疫苗背部皮下加强免疫，以及用C57BL/6小鼠颌下腺匀浆与弗氏完全佐剂或不完全佐剂混合制成的抗原注射入同种小鼠的背部皮下等。在诱发型动物模型中，利用涎腺组织匀浆免疫同种或异种小鼠是一种比较常见的模型的构建方法。对于自发型动物模型虽其并发的许多器官受损与人类的干燥综合征颇为相似，但其高成本、长周期、不易控制以及成模率较低使得实验室的研究遇到诸多困难。而目前国内外的几种诱导的动物模型中存在不足，如用大鼠造模需要较高的经济成本，并且周期较长会导致大鼠的各组织器官功能渐退，从而影响了实验的准确性。此外，小鼠抗原诱导的途径、剂量、时间、次数以及佐剂的选择等均会影响模型的成功率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种较为理想的干燥综合征动物模型，相比其它模型有较高的成模率，易于掌握，给研究人类干燥综合征提供更可靠的模型。
本发明中将C57BL/6小鼠的颌下腺匀浆与弗氏佐剂制成乳化剂，通过皮内多点注射进入同种小鼠的尾背部，介导炎症免疫反应，使小鼠颌下腺产生淋巴细胞浸润，干扰其免疫系统。皮内多处注射的方式可以产生较强的免疫应答。抗原的注射分3次进行，在第0天和第7天用弗氏完全佐剂调整抗原浓度，第14天用弗氏不完全佐剂平行操作，加强局部免疫应答。
本发明是通过以下技术方案来达到目的：
一种干燥综合征小鼠模型的造模方法，包括以下步骤：
步骤一，小鼠颌下腺抗原的制备：按需要取C57BL/6小鼠，脱颈椎处死，新洁尔灭消毒，无菌条件下取出双侧颌下腺，剥离包膜及结缔组织，用PBS洗净后放入无菌青霉素小瓶中，按照每个颌下腺加入0.5ml PBS的量，向无菌青霉素小瓶中加入PBS，将瓶内的颌下腺剪碎，在冰浴中充分匀浆，3000r/15min/4℃的条件离心，弃去上层脂质，取上清液，采用BCA蛋白定量法定量颌下腺抗原浓度，用PBS将颌下腺抗原浓度调整至4mg/ml，加入等量FCA弗氏完全佐剂或FIA弗氏不完全佐剂，将小鼠颌下腺抗原浓度稀释至2mg/ml，反复吹打直至两液相互溶并呈乳白色状，即制得注射用的2mg/ml小鼠颌下腺抗原；
步骤二，将C57BL/6小鼠随机分组，保证各组的小鼠数量、体重、状态尽可能地相近；用剪刀或电动剃须刀将小鼠尾背部的毛剃掉以备注射抗原，正常对照组小鼠不作处理；
步骤三，分别在第0天，第7天于小鼠的尾背部皮内多点注射步骤一制备的FCA配制的2mg/ml小鼠颌下腺抗原，注射量为0.1ml/只；在第14天用同样的方法注射等量的步骤一制备的FIA配制的颌下腺抗原；对照组小鼠用同样的方法注射等量的生理盐水；
步骤四，造模6周左右，检测指标，筛选造模成功的小鼠。
优选的，步骤一中的C57BL/6小鼠为8周龄的雌性C57BL/6小鼠。
优选的，步骤四中的检测指标包括：
饮水量检测：于造模前一周开始检测，每周测一次；造模后饮水量开始逐渐上升；
小鼠状态观察：在造模后第3周前后开始，小鼠出现搔抓口唇、舔爪现象，随后这种现象逐渐明显。
唾液量检测：在造模第5周进行；在造模第5周及此后，模型组小鼠的唾液应比正常组低，并且逐渐减少。
颌下腺组织病理学检测：在第6周，分别从模型组和正常组中取出2～3只小鼠，处死，取颌下腺做病理检查，用H&E染色法检测，模型组颌下腺存在明显的淋巴细胞浸润、成灶，而正常组无明显浸润。
优选的，所述唾液量检测：方法是测量前小鼠腹腔注射2.4％的戊巴比妥钠0.05ml，以呼吸平稳，眼角膜反射消失，四肢肌群松弛为麻醉标准；完全麻醉后使小鼠处于头低的稍稍倾斜状态,可以用取暖器给予温度，腹腔注射0.025mg/mL毛果芸香碱溶液0.1ml，5min后，将事先称好的棉花小球塞入小鼠口中，10min后取出；用湿重法求出小鼠唾液重量。
优选的，所述颌下腺组织病理学检测，在第6周，分别从模型组和正常组中取出2～3只小鼠，处死，取颌下腺做病理检查，用H&E染色法检测，颌下腺的处理应先放于10％的福尔马林中浸泡24h后，依次进行冲洗、脱水和透明、浸蜡、包埋、石蜡切片以及最终的H&E染色；模型组颌下腺存在明显的淋巴细胞浸润、成灶，而正常组无明显浸润。
本发明的优点是：
(1)本发明的干燥综合征小鼠模型的造模方法，注射方式为皮内注射，因皮内注射刺激免疫系统产生的应答强于皮下注射及其他途径。
(2)本发明的干燥综合征小鼠模型的造模方法，以2mg/ml的浓度给予0.1ml/只较适宜，过高或过低易诱导免疫耐受。
(3)本发明的干燥综合征小鼠模型的造模方法，注射抗原的次数和间隔适宜，频繁注射可能引起小鼠生理和精神状态低下，易于死亡。
(4)本发明的干燥综合征小鼠模型的造模方法，8周龄的雌性C57BL/6小鼠为较理想的动物。
本发明的干燥综合征小鼠模型的造模方法成模率高，造模时间短；理想的动物模型会给研究干燥综合征提供更好的实验方法。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例
1颌下腺抗原的制备：
取4只C57BL/6小鼠，脱颈椎处死，置于新洁尔灭中消毒15min，在超净台里无菌取出双侧颌下腺，分离包膜及结缔组织，用PBS洗净后放入无菌青霉素小瓶中，向瓶中加入2ml PBS，用眼科剪将瓶中的颌下腺剪碎，在冰浴中用电动匀浆器充分匀浆，转入EP管中离心，离心条件为3000r/15min/4℃，弃去上层脂质，取上清液，进行BCA蛋白定量，用PBS将抗原浓度调整至4mg/ml，加入等量的弗氏完全佐剂(FCA)或弗氏不完全佐剂(FIA)，将抗原浓度稀释至2mg/ml，反复吹打直至两液相互溶并呈乳白色状即可，若不及时注射，则可放于4℃冰箱保存备用，使用前仍需反复摇晃均匀。
2分组：
将40只C57BL/6小鼠随机分组，保证各组的小鼠数量、体重、状态尽可能地相近；用剪刀或电动剃须刀将小鼠尾背部的毛剃掉以备注射抗原，正常对照组小鼠可不作处理。
3抗原的注射：
分别在第0天，第7天于小鼠的尾背部皮内多点注射FCA配制的颌下腺抗原0.1ml/只；在第14天用同样的方法注射等量的FIA配制的颌下腺抗原。对照组小鼠不作处理或用同样的方法注射等量的生理盐水。
4模型的检测指标
4.1观察：3次造模后，观察小鼠的状态，约在第3周前后开始，小鼠出现搔抓口唇、舔爪现象，并且这种现象逐渐明显；
4.2饮水量：从造模前开始测，每周测一次，造模后饮水量逐渐上升；
4.3唾液量：约在造模第5周进行。方法是测量前小鼠腹腔注射2.4％的戊巴比妥钠0.05ml，以呼吸平稳，眼角膜反射消失，四肢肌群松弛为麻醉标准。完全麻醉后使小鼠处于头低的稍稍倾斜状态，需要时用取暖器给予温度，腹腔注射0.025mg/mL毛果芸香碱溶液0.1ml，5min后，将事先称好的棉花小球置入小鼠口中，10min后取出。用湿重法求出小鼠唾液重量。在造模第5周及此后，模型组小鼠的唾液量比正常组低，并且逐渐减少；
4.4颌下腺组织病理学检测：
在第6周，分别从模型组和正常组中取出2～3只小鼠，处死，取颌下腺做病理检查(H&E染色)。颌下腺的处理应先放于10％的福尔马林中浸泡24h后，依次进行冲洗、脱水和透明、浸蜡、包埋、石蜡切片以及最终的H&E染色。模型组颌下腺存在明显的淋巴细胞浸润，成灶，并且正常组无浸润或存在轻度浸润。
颌下腺Chisholm和Mason评判标准分级
注：一个淋巴细胞浸润灶是指有50个或更多的淋巴细胞
5.造模完成
造模6周左右，根据造模组小鼠的唾液量和颌下腺组织病理学评分分级判断造模是否成功；将造模组的小鼠唾液量与对照组小鼠唾液量对比，造模组的小鼠唾液量明显减少的，且颌下腺组织病理学评分Ⅱ级以上判断为造模成功的小鼠。