本发明涉及一种合成脂肪酸甘油酯的方法。
背景技术：
甘油酯是人和动物饮食中最主要的脂质成分，尤其是在植物油脂和动物油脂中，甘油酯的含量通常大于90％，甚至高于99％。游离脂肪酸广泛存在于各种油脂中，在常见的动植物油脂的毛油中，游离脂肪酸的含量可以达到1％～5％，在某些高酸价油脂中可以达到25％以上。在油脂加工过程中，游离脂肪酸会作为副产物而分离出来，这就产生大量的天然动植物油脂的游离脂肪酸产品。游离脂肪酸性质不稳定，一般具有加工过程中产生的不良气味，不能作为动物饲料或人类食品原材料使用。因此，开发适宜的工艺方法，将脂肪酸转化成甘油酯是人们长期关注的重要课题。
脂肪酸甘油酯的合成方法主要有化学法及酶法两种，化学法为采用化学催化剂在高温下以甘油和脂肪酸为底物合成甘油酯，其反应效率高，但是由于其反应温度高，催化剂残留，不适用不饱和脂肪酸酯化等缺点而逐渐被酶法催化合成所取代。
cn102994580a公布的一种高纯度甘油三酯型pufa的制备方法中，以固定化脂肪酶催化多不饱和脂肪酸与甘油酯化制备甘油酯，脂肪酸的酯化率最高只能达到86.4％。钟南京等，酶法酯化脂肪酸与甘油合成1,3-甘油二酯中利用固定化脂肪酶催化甘油和脂肪酸酯化制备甘油二酯，脂肪酸转化率不超过78％。
游离脂肪酶催化脂肪酸与甘油进行酯化反应时，由于脂肪酶可以均匀分散于油相与甘油相的界面上，使得其催化效率非常高，酯化反应可以快速达到平衡状态。但是，游离脂肪酶在反应体系中需要一定量的水分以维持其分子结构和催化效率，而水是酯化反应中产物，水的存在及蓄积会导致酯化反应向逆反应方向偏移，所以采用游离脂肪酶催化的酯化反应达到平衡状态时，脂肪酸的酯化率偏低，通常在50～70％之间。
固定化脂肪酶在无溶剂体系中催化脂肪酸与甘油进行酯化反应时，可以通过脱水处理和增加甘油的添加量等方式提高脂肪酸的酯化率，达到提高脂肪酸转化率的目的。但是，水分含量过低和过量的甘油存在时会对脂肪酶的催化效率产生严重影响。特别是过量的甘油对固定化酶的包裹作用会极大地限制酯化反应体系的传质效率，延长了酯化反应达到平衡所需的时间(约24h)，降低了酶促酯化工艺的生产效率。
技术实现要素：
本发明针对现有的酶促酯化反应方法中存在的脂肪酸转化率低，酯化反应达到平衡所需时间长的缺点，提供了一种催化制备脂肪酸甘油酯的方法。首先采用游离脂肪酶对以甘油和脂肪酸为底物的体系进行第一步酯化反应，将大部分的脂肪酸酯化为甘油酯；分离反应体系中的油相后在高真空的无水体系中由固定化脂肪酶进行第二步酯化反应，进一步提高脂肪酸的转化率。本发明大大提高了脂肪酸与甘油酯化合成甘油酯的反应效率，缩短了反应时间；提高了脂肪酸的转化率，使反应的酯化率达到了99％以上。缩减了最后的分离工艺，所得产物的经济价值提高。
本发明为实现上述目的通过以下技术方案实现：
一种制备脂肪酸甘油酯的方法，包括如下步骤：
(1)将质量比(1～5)：1的甘油和游离脂肪酸混合，添加反应物总质量0.1％～2％的游离脂肪酶、反应物总质量1％～6％的水，于30～60℃下搅拌反应2～4h；
(2)离心分离上述反应中的油相与甘油相，甘油相留存循环使用，油相经脱水处理；
(3)向上述脱水后的油相中添加油相总质量1～5％的固定化脂肪酶，45～65℃下高真空反应4～8h，即得到脂肪酸甘油酯。
步骤(1)中所述游离脂肪酸与甘油的质量比为1:1～1:3，游离脂肪酶的添加量为底物总质量的0.1％～2％，水添加量为2％～5％。
步骤(1)所述反应温度为30～55℃，反应时间为3～4h。
步骤(3)高真空反应的温度为45～60℃，时间为3～5h，真空度小于200pa。
步骤(3)中所述固定化脂肪酶为无甘油酯酰基位置专一性的固定化脂肪酶。
所述固定化脂肪酶为novozym435。
步骤(1)中所述游离脂肪酶为来源于根酶属、曲霉属、毛酶属、细菌、酵母菌和胰脂肪酶中的一种或两种以上的混合物。
所述游离脂肪酶为lipozymetl100l脂肪酶或
上述的一种合成甘油三酯的方法中采取先由游离脂肪酶在高甘油的环境下催化反应，充分利用无溶剂体系中游离脂肪酶催化脂肪酸与甘油酯化反应的高效性，将体系中的脂肪酸酯化在甘油基团上。然后分离出反应体系中的油相，即甘油三脂(tag)、甘油二酯(dag)、单甘脂(mag)、游离脂肪酸(ffa)的混合物，回收了体系中的甘油及水分和游离脂肪酶。将油相再经固定化的脂肪酶在高真空度下催化酯化反应，由于此时体系中已没有水的存在，所以酯化反应向反应正方向偏移，大大提高了反应的酯化率，在最优条件下反应完成后的酯化率≥98％，产物中tag≥38％，dag≥50％，mag≤5％，ffa≤1％，此产物可以经过简单的精炼过程处理后直接作为油脂产品使用。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用两步法酯化合成脂肪酸甘油酯，通过两种脂肪酶在各自条件下的联合酯化，只需5～10h就可反应完毕，大大减少了反应时间，效率高。
(2)本发明提高了脂肪酸的酯化率，反应产物中98％以上都是甘油酯，减少了分离纯化步骤，此产品通过简单的精炼工艺即可作为油脂产品使用，节约了生产成本。
具体实施方式
以下通过实施例更详细地介绍本发明的实施。
实施例1(两步酶法)
取深海鱼油加工中的脂肪酸副产物为原料，其中脂肪酸含量为99.5％，在其脂肪酸中dha为20％，epa含量为22％。取此脂肪酸100g与100g甘油混合于反应容器中，加入4g的lipozymetl100l(来源于疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶)和5g水后置于50℃甘油浴中在搅拌下反应2h，液相色谱检测得此反应酯化率为62％。离心分离上述反应中的油相与甘油相，甘油相留存循环使用，油相经脱水处理；取上述油相100g置于反应容器中，加入1.6gnovozym435脂肪酶(来源于南极假丝酵母的脂肪酶)，置于55℃的恒温磁力搅拌器中，在100pa真空状态下搅拌反应5h后得到反应产物，液相色谱检测得，此时产物中，tag含量为41.73％，dag53.76％，mag3.85％，ffa0.65％；脂肪酸的酯化率为99.35％。
实施例2(两步酶法)
取大豆油脱臭精炼过程中的脱臭流出物为反应原料，其中脂肪酸含量为91.3％，取该复合物500g，甘油600g，水11g，
实施例3(两步酶法)
取大豆油精炼副产物酸化油，其中脂肪酸含量为51.5％、甘油三酯含量为48.3％，取该复合物500g，甘油250g，水11g，lipozymetl100l脂肪酶5g，混合后置于反应器中45℃搅拌反应4h。离心分离上述反应中的油相与甘油相，甘油相留存循环使用，油相经脱水处理；取上述油样400g加入8g的novozym435脂肪酶于100pa真空下搅拌反应4h后得到反应产物，液相色谱检测得，此时产物中，tag含量为66.5％，dag含量为30.27％，mag含量为2.09％，ffa含量为1.14％；脂肪酸的酯化率为97.78％。
对比实施例1(一步酶法)
取深海鱼油加工中的脂肪酸副产物为原料，其中脂肪酸含量为99.5％，在其脂肪酸中dha为20％，epa含量为22％。取此脂肪酸100g与100g甘油混合于反应容器中，加入1.6gnovozym435脂肪酶，置于55℃的恒温磁力搅拌器中，在100pa真空状态下搅拌反应24h后得到反应产物，液相色谱检测得脂肪酸的转化率为86.18％，此时产物中，tag含量为32.10％，dag43.96％，mag10.11％，ffa13.82％。
对比实施例2(一步酶法)
取油酸100g与100g甘油混合于反应容器中，加入1.6gnovozym435脂肪酶，置于55℃的恒温磁力搅拌器中，在100pa真空状态下搅拌反应24h后得到反应产物，液相色谱检测得脂肪酸的转化率为87.14％，此时产物中tag含量为33.51％，dag42.78％，mag10.84％，ffa12.86％。该方法催化10h时酯化率低，需要24h以上才能达到平衡；效率低。