Taqman‑MGB探针检测绵羊BMPR‑IB基因A746G突变的试剂盒和方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及taqman-mgb探针检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变试剂盒和方法。

背景技术：

高繁殖力是世界绵羊生产共同追求的重要目标之一。但由于绵羊绝大多数产单羔，少数产双羔，故极大地影响了绵羊的繁殖性能，随着集约化养羊业的不断发展，如何提高绵羊繁殖力是养羊业获得较好经济效益的关键。多胎性状是绵羊重要的繁殖性状之一，也是绵羊多产、高产的基础，繁殖力的高低直接影响生产成本，进而影响经济效益，因此，绵羊的多胎性能引起人们的普遍关注，国内外纷纷引进或培育多胎绵羊品种。研究表明，大部分绵羊品种产羔数低，多羔的遗传力较低，仅为0.12，在一定程度上限制了我国绵羊生产性能的提高，同时，繁殖性状与生长速度呈负相关关系，因而影响了常规育种方法的效果和可操作性，选育周期长。分子标记辅助选择可以弥补常规表型选择方法的不足，提高选择的准确性并缩短世代间隔，提高育种效率。

自从1980年以来，研究人员开始筛选、鉴定控制绵羊排卵率和产羔率的主效基因，研究证实绵羊fecb基因实际为骨形态发生蛋白ib型受体（bmpr-ib）基因，bmpr-ib基因的突变能够显著增加绵羊排卵率，是中国美利奴羊、小尾寒羊、湖羊等绵羊排卵率和产羔数的主效基因。我们前期研究表明，中国美利奴羊（军垦型）bmpr-ib基因存在a746g碱基突变，该基因编码区746处的a→g突变的发生与fecb表型一致，在绵羊群体中存在3种基因型，其遗传效应表现为：bb纯合型与地方品种羊相比，平均排卵数增加3枚，每只母羊平均每胎能多产1.5只羔羊；b+杂合型与地方品种羊相比，平均排卵数增加1.5枚，每只母羊平均每胎能多产1.0只羔羊；++野生型产羔数与地方品种接近。bmpr-ib基因b等位基因在绵羊群体中存在，使得羊群的繁殖率比较高，该基因a746g碱基突变对绵羊排卵率呈加性效应，对窝产羔数呈部分显性效应。因此，bmpr-ib基因可用于多胎绵羊的分子育种。

通过对母羊bmpr-ib基因a746g碱基突变的检测，开展bmpr-ib基因标记辅助选择，组建bb基因型绵羊群体，是快速提高绵羊繁殖力的一个有效方法，能够使群体平均产羔数达到230%以上，极大的增加羔羊数量，提高养羊的经济效益。而建立bmpr-ib基因a746g碱基突变的检测方法是实现分子标记辅助选择的前提条件。目前，针对bmpr-ib基因a746g突变的检测方法主要有：测序法、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术（pcr-rflp）、聚合酶链式反应-单链构象多态性（pcr-sscp）、基因芯片法、荧光定量pcr方法（qpcr）。

测序法准确性高，但操作繁琐，成本较高。基因芯片是在核酸杂交基础上建立起来的新方法，在大规模样本检测或基因多态性位点检测方面具有很大优势，但是配套检测仪器设备要求高、仪器价格高、检测成本高。pcr-sscp方法存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp段的检出率为70-80%。pcr-rflp方法是一种常用的snps检测技术，2008年基于pcr-sscp和pcr-rflp技术已建立农业行业标准“绵羊多胎主效基因fecb分子检测规程（ny/t1672-2008）”，pcr-rflp方法成本低，结果比较直观，但是操作繁琐，检测时间长，不能适应在绵羊群体中开展大规模、并行的检测要求。qpcr方法包括突变阻滞扩增系统pcr（又名等位基因特异pcr）（arms-pcr）方法、高分辨率熔解曲线（hrm）方法、taqman探针法，qpcr方法的优点是操作简单，检测速度快，pcr产物无需进行后续实验分析即可判断结果，全过程在封闭的pcr管内进行，能最大程度的减少交叉污染。arms-pcr方法检测snp位点，操作麻烦，优化反应条件较难。hrm染料法对荧光染料、pcr仪器要求较高，仪器需要增加专门的hrm分析功能，不同基因型溶解曲线峰图差异不明显，实验要求比较高。taqman-mgb探针法是在普通taqman探针基础之上发展起来的，mgb探针是指带有一个小沟结合物基团的dna探针，它可与单链的靶dna形成极为稳定的异源双链，mgb探针相对于通常的探针序列更短一些，使荧光基团和淬灭基团的距离更近；其3'端标记了自身不发光的淬灭分子，以取代常规可发光的tamra等荧光标记，3'端增加的一个mgb分子可以稳定探针与模板的杂交，提高探针的退火温度和特异性，使荧光本底降低，荧光光谱分辨率得以大大改善，探针淬灭效果更好，分辨率更高，检测结果更加精确。利用taqman-mgb探针法可实现高通量、快速、准确的检测绵羊bmpr-ib的a746g突变，可以为多胎绵羊育种提供一种合适的基因检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供taqman-mgb探针检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变的准确、效果好、分辨率高的引物、探针；

另一个目的在于提供一种灵敏度高、准确率高，可规模检测、有效提高工作效率、简便实用的检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变的试剂盒及检测方法，适用于常用的荧光定量pcr仪，能够快速、准确对绵羊bmpr-ib基因a746g突变进行检测，并实现基因分型。

本发明所采取的技术方案是：

taqman-mgb探针检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变的引物、探针，其特征在于核苷酸序列如下：

其上游引物bmf的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示；

其下游引物bmr的核苷酸序列如序列表中seqidno：2所示；

其野生探针bpa的核苷酸序列如序列表中seqidno：3所示；

其突变探针bpg的核苷酸序列如序列表中seqidno：4所示；

所述野生探针bpa的5’一端标记有荧光基团1，3'一端标记有mgb淬灭基团；所述突变探针bpg的5’一端标记有荧光基团2，3'一端标记有mgb淬灭基团；

其中所述的荧光基团1或荧光基团2为fam、tet、vic、hex或rox中的一种，且荧光基团1与荧光基团2不相同。

利用所述引物、探针所构成的taqman-mgb探针检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变的试剂盒，包含阳性对照样品、dna提取液ⅰ、dna提取液ⅱ、2×lightcycler480probesmaster、一对引物bmf和bmr，以及其对应的探针bpa和bpg、ddh2o；

其中dna提取液ⅰ、dna提取液ⅱ，其组成成分如下：

dna提取液ⅰ：0.01mol/ltris，0.01mol/lnacl，0.005～0.01mol/lmgcl2﹒6h2o；

dna提取液ⅱ：10mmol/ltris，0.1mmol/ledta-na2﹒2h2o，0.1～1%tritonx-100。

作为优选,所述试剂盒中所包含的阳性对照样品为三个，分别对应绵羊bmpr-ib基因的++、b+和bb三种基因型。

一种利用所述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

（1）从绵羊血液中提取基因组dna:

（a）取无菌的1.5ml离心管，向其中加入混匀的edta抗凝血200µl和dna提取液ⅰ溶液600µl，充分混匀,室温静置10min；将离心管置于离心机中，6000rpm离心1min；

（b）取出离心管，倾去上清液，保留沉淀；向离心管中加入dna提取液ⅱ溶液60µl，充分振荡混匀；沸水浴中10min；

（c）取出离心管，置离心机中，12,000rpm离心10min，离心后上清液可用于后续实验；

（2）将骤（1）得到的dna分别加入到pcr反应液中，取一对引物和探针，进行实时荧光定量pcr扩增，获得绵羊的bmpr-ib基因包含a746g突变位点的基因片段；

（3）根据检测到的荧光信号对绵羊bmpr-ib基因a746g位点的三种基因型进行判定，即++、b+和bb基因型。

作为优选,所述的检测方法，步骤（2）中实时荧光定量pcr反应所使用的扩增体系为20µl，扩增体系中包含以下溶液或试剂：2×lightcycler480probesmaster10μl，10μmol/l上游引物bmf0.8μl，10μmol/l下游引物bmr0.8μl，10μmol/l野生探针bpa0.4μl，10μmol/l突变探针bpg0.4μl，基因组dna3μl，去离子水补齐至20µl。

作为优选,所述的检测方法，步骤（2）中实时荧光定量pcr反应所使用的扩增程序为95℃预变性10min；95℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1sec，45个循环。

根据bmpr-ib基因a746g基因型将绵羊群体分为三种类型，选择bb基因型个体组建多胎绵羊群体，从而实现多胎绵羊的分子标记辅助育种，即完成基于taqman-mgb探针检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变试剂盒和方法的应用。

所述绵羊血液中基因组dna提取原理：

批量检测中，应用相同起始edta-na2抗凝血，可以保证提取的基因组dna浓度的一致性，确保后续实时荧光定量pcr扩增条件的一致性，以及检测结果的准确性。抗凝血经dna提取液ⅰ处理，将血液中红细胞破裂，经离心除去红细胞碎片，保留白细胞；dna提取液ⅱ使分离的白细胞裂解，释放出基因组dna，经离心处理，上清中的dna可以用于实时荧光定量pcr，在短时间内实现基因组dna的提取。

经典方法中，通过酚/氯仿抽提基因组dna，先从血液样品中去除蛋白质，酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，有时还要重复几次，这样就大大增加了工作量。而且酚具有高度腐蚀性，易引起严重的烧伤；氯仿对中枢神经系统具有麻醉作用，对操作者的心、肝、肾有损害，吸入或经皮肤吸收引起急性中毒。因此，经典方法对操作人员的身体伤害较大。

虽然有相关的商品化血液基因组dna提取试剂盒，其提取基因组中多数都需要加入proteinasek，成本较高。

本发明中提供的快速从血液中提取基因组dna的方法，克服了经典方法中有害溶剂对人体危害的影响，具有提取的基因组dna步骤少、速度快、省时省力、成本低等特点。24个样品批次提取时间约为45min，比一般的动物血液基因组dna提取试剂盒减少约1h，比经典方法减少约2h。虽然应用琼脂糖凝胶电泳检测的基因组dna条带较弱、纯度较低，但是完全可以满足所述的taqman-mgb探针检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变位点。

所述的taqman-mgb探针检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变的方法是以快速提取的绵羊基因组dna为模版，在实时荧光定量pcr体系中同时加入上述引物和探针，引物用于绵羊bmpr-ib基因包含a746g的基因片段扩增，上述探针中在5’端分别加入2种不同荧光基团，即fam和vic，野生探针（bpa）和突变探针（bpg）分别与bmpr-ib基因的+和b等位基因完全配对。探针的3’端加入淬灭基团为mgb。taqman-mgb探针是利用taqdna聚合酶5’→3’外切酶活性切断探针，产生荧光信号。探针和模版特异性的结合在两条引物之间，由于探针5’端标记有报告基团（fam、vic），3′端标记有淬灭基团mgb。当探针完整时，5’端报告基团和3′端淬灭基团紧邻在一起，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着pcr的进行，taqdna聚合酶在链延伸中遇到与模版结合的探针，与模板完全配对的探针逐步被taqdna聚合酶5’→3’外切核酸酶活性切断，致使探针5’端上的报告基团与3’端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告基团所发射的荧光能量不能被吸收，产生荧光信号。而与模板不完全配对的探针不能被切断，故检测不到荧光信号。因此，仪器根据荧光信号及其对应的颜色就可以实现基因突变的检测，根据检测结果即可判定绵羊个体为bmpr-ib基因的++、b+或bb基因型。

本发明中的mgb探针具有3’端淬灭基团，不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，也将探针的tm值提高10℃左右，提高探针的退火温度和特异性，因此为了获得同样的tm值，mgb探针可以比普通的taqman探针设计的更短，既可以降低合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高，探针淬灭效果更好，分辨率更高，对单个碱基突变检测更敏感、准确，比传统的taqman探针检测和hrm检测等方法结果判读更容易。与pcr-rflp方法检测bmpr-ib基因多态性相比，根据pcr仪器的通用性，一次可以检测92个样品，且不需要进行pcr产物的酶切和电泳后续分析，在节省检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。由于全过程在封闭的pcr管内进行，也有效降低了pcr产物污染引起假阳性的风险，结果更易于准确判读。所提供的基于taqman-mgb探针的绵羊bmpr-ib基因a746g突变检测试剂盒和方法，可实现高通量、快速、准确的检测绵羊bmpr-ib的基因型，可以为多胎绵羊分子辅助育种提供一种合适的基因检测方法。该试剂盒及检测方法操作简单、检测速度快、准确性高，而且不需要进行pcr产物后续分析即可判型，反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。

附图说明

附图1，为本发明实施例1中基于taqman-mgb探针的绵羊bmpr-ib基因的a746g突变三种基因型的检测结果，图中标注的bb、b+和++分别对应bmpr-ib基因的bb、b+和++三种基因型。

附图2，为选取的1号、2号和3号绵羊样本，经基于taqman-mgb探针的bmpr-ib基因实时荧光定量pcr扩增产物的测序图谱，如图2所示，1号样本经pcr扩增及测序，证明在bmpr-ib基因746处碱基为a，对应bmpr-ib基因型为++基因型；2号样本经pcr扩增及测序，证明在bmpr-ib基因746处碱基为a/g杂合型，对应bmpr-ib基因型为b+基因型；3号样本经pcr扩增及测序，证明在bmpr-ib基因746处碱基为g，对应bmpr-ib基因型为bb基因型；经对比，基于taqman-mgb探针的绵羊bmpr-ib基因a746g突变检测结果与测序结果完全符合。

附图3，为参照农业行业标准“绵羊多胎主效基因fecb分子检测规程（ny/t1672-2008）”，应用pcr-rflp方法，进行绵羊bmpr-ib基因a746g突变检测结果，图中m为dna分子量puc19dna/mspⅰ(hapⅱ)marker；1～12分别为不同样本pcr-rflp电泳分型结果，8为bb基因型，1、3、4、5、10、12为b+基因型，2、6、7、9、11为++基因型。

具体实施方式

实施例1：

参考附图1-图3，下面结合附图对实施例详细描述本发明的技术方案，本实施例实施步骤如下：

1、实验材料与样品采集：

选取498只中国美利奴（军垦型）肉用多胎品系、464只中国美利奴（军垦型）毛用多胎品系、663只多胎萨福克羊、150只萨福克羊、320只哈萨克羊和150湖羊为实验对象，共计2245只。

采用一次性注射器从绵羊颈静脉抽取约1ml的血液，注入经高压灭菌并装有约150µl2%无菌edta（ethylenediaminetetraaceticacid，edta）抗凝剂的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录羊号，-20℃保存备用。

2、主要药品和试剂：

三（羟甲基）氨基甲烷（tris），nacl，mgcl2﹒6h2o，edta-na2﹒2h2o，tritonx-100，生工生物工程（上海）股份有限公司；lightcycler480probesmaster，罗氏诊断产品（上海）有限公司。

3、主要仪器：

lightcycler®480高通量实时荧光定量pcr系统，roche公司；hico21高速离心机，生工生物工程（上海）股份有限公司。

4、引物和探针的设计与合成：

根据绵羊bmpr-ib基因a746gsnp位点设计引物和探针，上游引物bmf和下游引物bmr由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，野生探针bpa和突变探针bpg由上海辉睿生物科技有限公司合成。

上游引物（bmf）：5'-gtgttcttcactacagaggaggc-3'

下游引物（bmr）：5'-cctgaacatcgctaatacagactt-3'

野生探针（bpa）：5’-fam-caacaccgtctgatat-mgb-3'

突变探针（bpg）：5’-vic-caacaccgtccgatat-mgb-3'

5、绵羊基因组dna的快速提取：

（1）试剂配制：

配制绵羊基因组dna快速提取的试剂，如下：

dna提取液ⅰ（ph8.0）：0.01mol/ltris，0.01mol/lnacl，0.005～0.01mol/lmgcl2﹒6h2o；

dna提取液ⅱ（ph8.0）：10mmol/ltris，0.1mmol/ledta-na2﹒2h2o，0.1～1%tritonx-100。

（2）取无菌的1.5ml离心管（自备），向其中加入混匀的edta抗凝血200µl和dna提取液ⅰ溶液600µl，充分混匀,室温静置10min；将离心管置于离心机中，6000rpm离心1min。

（3）取出离心管，倾去上清液，保留沉淀；向离心管中加入dna提取液ⅱ溶液60µl，充分振荡混匀；沸水浴中10min。

（4）取出离心管，置离心机中，12,000rpm离心10min，离心后上清液可用于后续实验。

6、基于taqman-mgb探针的实时荧光定量pcr：

（1）以绵羊基因组dna为模版，利用前述的引物和探针，进行实时荧光定量pcr扩增，获得绵羊的bmpr-ib基因包含a746g突变的117bp基因片段。

20μl反应体系中包含以下溶液或试剂：

2×lightcycler480probesmaster10μl；

上游引物bmf（10μm）0.8μl；

下游引物bmr（10μm）0.8μl；

探针bpa（10μm）0.4μl；

探针bpg（10μm）0.4μl；

去离子水4.6μl；

基因组dna3.0μl。

其中2×lightcycler480probesmaster，包含faststarttaqdna聚合酶、pcr反应buffer、6.4mmmgcl2和dntp混合物。

根据实时荧光定量pcr仪器规格，通常为96孔，为提高加样一致性和速度，可制备除了基因组dna以外的混合pcr反应体系，考虑移液器和吸头误差，一般每个96孔板按100个反应体系计算，应用移液器将反应体系分至96孔板，每孔分别加入待检测的基因组dna样品，完成以后用封口膜封口，瞬时离心。

每个96孔板上设置一个空白对照ntc和三个已知基因型（bb、b+和++基因型）的绵羊基因组对照。

（2）将上述溶液混合均匀，按以下条件进行pcr反应。

95℃预变性10min；95℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1sec，45个循环。

7、基因分型：

反应结束后，应用lightcycler®480高通量实时荧光定量pcr系统配套软件lightcycler480softwarerelease1.5.1.62软件进行数据分析，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型（bb、b+和++基因型）（见图1）。

++基因型：接近x轴区域，呈蓝色点。

bb基因型：接近y轴区域，呈绿色点。

b+基因型：位于x轴和y轴的中间区域，呈红色点。

8、数据统计分析：

根据检测结果，统计中国美利奴（军垦型）肉用多胎品系、中国美利奴（军垦型）毛用多胎品系、多胎萨福克羊、萨福克羊、哈萨克羊和湖羊不同基因型。

表1不同品种绵羊bmpr-iba746g位点基因型频率分布

注：cmmm代表中国美利奴（军垦型）肉用多胎品系；cmmw代表中国美利奴（军垦型）毛用多胎品系。括号中为绵羊只数。

可见，中国美利奴（军垦型）肉用多胎品系、中国美利奴（军垦型）毛用多胎品系和多胎萨福克羊群体中存在bmpr-ib基因三种基因型，中国美利奴（军垦型）肉用多胎品系和中国美利奴（军垦型）毛用多胎品系以++基因型为主；多胎萨福克以b+基因型为主；萨福克羊和哈萨克羊全部为++基因型；湖羊全部为bb基因型。

对检测结果的分析如下：

（1）条件优化：

taqman-mgb探针的实时荧光定量pcr检测过程中，基因组dna模版的使用量、pcr引物的扩增效率和特异性、探针的特异性和使用量、最适退火温度都成为成功检测的关键因素。因此在设计时，考虑了批量检测时间要短，pcr产物的长度要合适，检测过程中设置了一个空白对照ntc和三个已知基因型（bb、b+和++基因型）的绵羊基因组对照，pcr过程中对两步法和三步法及退火温度进行了条件摸索，并对pcr产物进行了抽样测序，确保了每一个样本检测结果的正确性。

经多次反复实验，确定了绵羊基因组dna快速提取试剂和提取方法，实时荧光定量pcr采用三步法，退火温度使用55℃，可以确保pcr的扩增效率和正确性。

（2）准确性和特异性检测：

每批次检测结束以后，随机选取++基因型、b+基因型和bb基因型的bmpr-ib基因pcr产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，基因序列用blast在线软件进行比对分析。序列比对结果证实pcr扩增序列为绵羊bmpr-ib基因包含a746g突变位点的基因片段，3个样本为++基因型、b+基因型和bb基因型（见图2），检测结果与测序结果完全一致，说明设计的引物和探针正确，特异性高。

（3）重复性检测：

从2245只绵羊样本中随机选出95只羊，每一个样本从基因组dna提取、应用taqman-mgb探针的实时荧光定量pcr检测，至少重复完成3次，结果表明所有样本经多次检测，分析结果都相同，重复检测正确率达到100%，说明探针设计合理，检测结果可靠。

（4）为了进一步证明检测结果的可靠性，实验中随机选择600只中国美利奴羊（军垦型）为实验材料，应用taqman-mgb探针的实时荧光定量pcr检测试剂盒对bmpr-ib基因进行基因分型，并参照农业行业标准“绵羊多胎主效基因fecb分子检测规程（ny/t1672-2008）”，应用标准中的pcr-rflp方法对bmpr-ib基因进行检测（图3），对比分析，结果表明，两种方法检测bmpr-ib的基因型结果一致，taqman-mgb探针的实时荧光定量pcr检测试剂盒和方法的检测准确率达到100%，其中++基因型个体数为282只，b+基因型个体数为271只，bb个体数为47只，说明建立的taqman-mgb探针检测bmpr-ib基因a746g突变的试剂盒和方法能够实现绵羊多胎主效基因bmpr-ib基因型的检测。

以上检测试剂盒中所包含的阳性对照样品、dna提取液ⅰ、dna提取液ⅱ、2×lightcycler480probesmaster、两对引物及其对应的探针，以及检测方法能够准确检测绵羊多胎性状主效基因bmpr-ib基因的不同基因型，选择bb基因型绵羊个体进行组群，从而能够实现准确、快速、并行的绵羊多胎性状主效基因标记辅助育种。

上述实施例是提供给熟悉本领域内的人员来实现或使用本发明的，熟悉本领域的人员可在不脱离本发明的发明思想的情况下，对上述实施例做出种种修改或变化，因而本发明的保护范围并不被上述实施例所限，而应该是符合权利要求书提到的创新性特征的最大范围。

<110>新疆农垦科学院

<120>基于taqman-mgb探针检测绵羊bmpr-ib基因a746g突变的试剂盒和方法

<141>2017-05-26

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