本发明属于基因检测
技术领域：
，具体涉及一种TaqMan-MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的引物及其应用。
背景技术：
：酒精代谢过程产生的乙醇和乙醛的过量富集及硝酸甘油代谢的受阻经常会给人带来健康隐患，如酒精性肝病，神经疾病，心血管疾病，食管癌，胃癌等疾病。人类乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase,ALDH)是酒精代谢的关键酶。ALDH有19种同工酶，其中ALDH2最为重要，具有脱氢酶活性，对人体内乙醛的氧化发挥主要的作用(即与体内代谢酒精的能力直接相关)。ALDH2主要作用为乙醇代谢通路中的第二相代谢的催化剂，在线粒体内将乙醛转化为乙酸释放入血液，而后血液将乙酸输送到其他组织进入三羧酸循环，最后氧化为CO2。分子生物学研究显示，ALDH2是一个四聚体，只要其中的一个亚基缺少或发生结构改变就足以导致其酶活性的丧失或活性下降。迄今为止，研究者在人类ALDH2基因的序列上发现了84个单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位点，但研究主要集中在rs671位点上，即ALDH2基因第12外显子中的一个SNP，导致赖氨酸替代了原有的谷氨酸(Glu504Lys)。Glu504Lys是ALDH2基因上最重要的一个SNP位点，该位点与ALDH2蛋白的空间结构有关，因此影响该酶的活性。在人群中，ALDH2酶的基因以3种形式出现，具有正常催化乙醛活性的野生纯合型G/G，即ALDH2*1*1；催化活性下降的突变杂合子型G/A(只有ALDH2蛋白正常水平的6.25％)，即ALDH2*1*2；失去催化活性的突变纯合子型A/A，即ALDH2*2*2。ALDH2基因的变异对乙醛的催化活性的影响是影响饮酒人群肿瘤发生的重要因素，其中以其rs671位点的多态性最为显著。最新的研究成果表明，ALDH2除了具有脱氢酶活性以外还具有酯酶活性，可以催化硝酸甘油水解产生NO.，ALDH2基因的Glu504Lys多态则会影响硝酸甘油的疗效。有文献表明这种突变与部分国人含服硝酸甘油治疗心绞痛无效相关。因此,临床医师在使用硝酸甘油时,需考虑患者的这一遗传因素。通过对ALDH2基因的检测，将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据。ALDH2基因检测的临床意义包括：(1)揭示个体酒精代谢能力的不同。ALDH2基因与酒精在人体内的分解代谢有关。ALDH2基因突变将使酒精在体内的代谢过程受阻，导致大量乙醛滞留在体内。除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌；(2)检测ALDH2酶对药物代谢速率的快、慢，合理调整药物剂量，提高疗效、降低毒副反应发生概率；(3)指导临床正确使用硝酸甘油，减少用药无效情况。如果病人基因中携带有ALDH2(Glu504Lys)突变，乙醛脱氢酶2的硝酸脂酶活性会降低10倍以上，使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效。在过去的20年，为适应临床需要，以DNA探针和聚合酶链反应(PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方法已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床工作。从最初的焦磷酸测序到后期的基因芯片等技术都可以检测基因多态性位点分型，但焦磷酸具有扩增时间较长、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术虽然可同时检测多个位点，但成本也非常高，操作复杂，所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。实时荧光定量PCR技术(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction，简称RealTimePCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。只有探针特异结合的片段发生PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。针对TaqMan探针荧光猝灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针–MGB探针(miNO.rgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate)，3’段采用了非荧光性的猝灭基团–猝灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。该技术不仅实现了对核酸特异性扩增的实时监测，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供TaqMan-MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的引物。本发明还要解决的技术问题是，提供上述引物在TaqMan-MGB探针法检测ALDH2基因多态性中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种TaqMan-MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的试剂盒，它包括如下核酸序列：(1)扩增ALDH2基因rs671多态性位点的引物对，其核苷酸序列SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示；(2)用于检测ALDH2基因rs671多态性位点的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.：3和SEQIDNO.：4所示，其中，SEQIDNO.：3标记FAM信号，SEQIDNO.：4标记VIC信号；上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。一种TaqMan-MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括：权利要求1所述的引物和探针。作为优选，该试剂盒包括：2×PCR反应混合液、阳性标准品。其中，所述的2×PCR反应混合液包括：Tris-HCL10mM，引物SEQIDNO：1～210μM，探针SEQIDNO.：3和SEQIDNO.：410μM，MgCl22mM，KCL50mM，dNTPs0.2mM，TaqDNA聚合酶2U/μL。所述阳性标准品为GG基因型标准品质粒和AA基因型标准品质粒，所述GG基因型标准品质粒的插入序列如SEQIDNO.：5所示，所述AA基因型标准品质粒的插入序列如SEQIDNO.：6所示.TaqMan-MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的方法，包括如下步骤：(1)提取人外周血基因组DNA；(2)分别以提取的人外周血基因组DNA和权利要求2中的阳性标准品为模板，利用SEQIDNO.：1～6所示的引物和探针，进行实时荧光定量PCR反应；(3)根据检测到的荧光信号值对rs671位点进行基因型判定。步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应的扩增体系如下：总体积20μL，2×PCR反应混合液10μL，SEQIDNO.：10.2μM，SEQIDNO.：20.2μM，SEQIDNO.：30.2μM，SEQIDNO.：40.2μM，模板DNA50ng。步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应的扩增程序为：95℃，2min；95℃，10s，60℃，45s，收集荧光，40个循环。有益效果：(1)使用一种稳定性强，特异性高的短TaqMan-MGB探针，短探针的荧光报告基团和猝灭基团的距离更近，猝灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高；同时也简化了探针的设计和成本；(2)本发明使用的探针对于等位基因的区分更理想，对单碱基的多态性分型更精准；(3)本发明所述的核酸序列具有操作简便、灵敏度高、特异性强及成本低廉等优点，可用于硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据。附图说明图1为10例标本的检测结果图示。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：DNA提取取200μL外周血，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自杭州新捷生物科技有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。实施例2：检测ALDH2基因的rs671多态性的扩增引物和TaqMan-MGB探针，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：扩增ALDH2基因的引物对：F(SEQIDNO.：1)：5′-CCCTTTGGTGGCTACAAGATG-3′，R(SEQIDNO.：2)：5′-GCAGGTCCCACACTCACAGTT-3′；荧光定量分型ALDH2基因的TaqMan-MGB探针：FAM(SEQIDNO.：3)：5′-AGGCATACACTGAAGT-3′，VIC(SEQIDNO.：4)：5′-AGGCATACACTAAAGTG-3′。实施例3：检测方法仪器：Roche480荧光定量PCR检测仪，ThermoLegendMicro21高速离心机，太仓华利达实验室设备公司WH-866型涡旋振荡器。(1)以实施例(1)得到的基因组DNA为模板，利用特异性扩增引物和敏感稳定的TaqMan-MGB探针进行ALDH2基因的检测，具体包括如下步骤：(a)PCR反应液配制：从2xPCR反应混合液和实施例2中的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配制PCR反应液Xμl：X＝10μlPCR反应液+0.4μlF引物+0.4μlR引物+0.6μlFAM探针+0.3μlVIC探针(b)加入模板DNA50ng，加水水补足至总体积20μL，同时设立阳性标准品和阴性对照。(c)PCR扩增：Roche480荧光定量PCR仪进行ALDH2基因检测，反应条件如下：95℃预变性2min；95℃10s，60℃45s，40个循环，荧光采集点在60℃，检测模式设置为双通道探针法，反应体积设置为20。保存文件，运行。实施例4：结果分析Roche480荧光PCR检测仪点击分析，选取末端点基因型分型模式，进入分析窗口，在横纵坐标上分别选定一种荧光信号；将标准品标记为已知的对应基因型，并根据设定的标准品基因型自动计算样本的结果。或选取定量模式，根据FAM和VIC的信号值对比，手动判读样本的结果。每次实验阴性对照无荧光信号，结果合格。实施例5：结果统计10例标本的基因型结果统计如下：编号结果编号结果1001G/A1006G/G1002G/A1007G/A1003G/G1008G/G1004G/G1009G/G1005A/A1010G/G以上所述，是本发明较佳的实施例，并非本发明任何形式上或实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的技术人员，在不脱离本发明的范围前提下，还可以对之做一些修改和改进，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>重庆迪安医学检验中心有限公司<120>一种TaqMan-MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的引物及其应用<130>SG20161223001<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>扩增ALDH2基因的上游引物<400>1ccctttggtggctacaagatg21<210>2<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>扩增ALDH2基因的下游引物<400>2gcaggtcccacactcacagtt21<210>3<211>16<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>荧光定量分型ALDH2基因的探针<400>3aggcatacactgaagt16<210>4<211>17<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>荧光定量分型ALDH2基因的探针<400>4aggcatacactaaagtg17<210>5<211>98<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>GG基因型标准品质粒插入序列<400>5ccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcag60gcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgc98<210>6<211>98<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>AA基因型标准品质粒插入的序列<400>6ccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcag60gcatacactaaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgc98当前第1页1 2 3