一种检测miRNAs‑21的方法、探针组及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测mirnas-21的方法、探针组及试剂盒。

背景技术：

micrornas(mirnas)是一类由18-24个碱基组成的非编码单链小分子rna，在转录后水平对基因表达发挥负调控作用，参与细胞生长、发育、凋亡等重要生物过程。最近的一些医学研究表明，mirna的表达水平，或增大或减少，都在某种程度上与人类重大疾病如癌症等有着密不可分的联系。这使得mirna可以作为肿瘤标记物来早期地监控癌症的发生。

mirna-21的编码基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(vacuolemembraneprotein-1，vmp1)编码区，vmp1基因的第十内含子。vmp1也被称为跨膜蛋白49(transmembraneprotein-49,tmem-49)。mirna-21对多种癌症都有高表达，如：胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等等。因此mirna-21是一个公认的致癌性小rna，对mirna-21进行定量检测可以有效的监控癌症的发生。

目前发展出了许多检测mirna的方法，比如northern印迹技术、微阵列芯片(microarray)、实时反转录聚合酶链式反应、电化学方法、荧光分析、电化学发光、比色分析等等。但上述方法都具有一定的局限性，比如检测灵敏度低、缺乏足够的分析物、特异性不佳、需要耗费大量的时间和人力，而且经常需要昂贵和繁琐的工具和熟练的专业人员，限制了其在临床诊断方面的潜在应用。

荧光检测方法，由于其灵敏度高、操作简单，目前正在获得越来越多的关注。然而，目前荧光传感器具有一些特殊的局限性，包括探头尺寸小，稳定性低，光漂白，与背景荧光光谱相重叠，低丰度和高序列相似性等等。因此开发一种能够快速、高选择性和高灵敏度地检测mirna-21的方法具有重要意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测mirnas-21的方法、探针组及试剂盒。本发明所述检测mirnas-21的方法能够快速、高选择性和高灵敏度地检测待测样品中的mirnas-21含量。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测mirnas-21的方法，将金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管与h1探针、h2探针和待测样品混合，检测金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管端头光波导荧光亮度的变化；

其中所述金纳米棒和聚二乙炔微米管分别经单链dna修饰，且修饰金纳米棒的单链dna与修饰聚二乙炔微米管的单链dna碱基互补；h1探针与h2探针均为发夹探针，在mirnas-21存在下可自组装形成双链结构，然后通过toehold与修饰金纳米棒的单链dna发生链置换反应。

作为优选，所述修饰金纳米棒的单链dna的序列如seqidno：1所示；所述修饰聚二乙炔微米管的单链dna的序列如seqidno：2所示。

作为优选，所述h1探针的序列如seqidno：3所示；所述h2探针的序列如seqidno：4所示。

作为优选，所述金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。

作为优选，所述待测样品为血清。

本发明还提供了一种检测mirnas-21的探针组，包括h1探针与h2探针，h1探针与h2探针均为发夹探针，在mirnas-21存在下可自组装形成双链结构，然后通过toehold与修饰金纳米棒的单链dna发生链置换反应。

作为优选，所述h1探针的序列如seqidno：3所示；所述h2探针的序列如seqidno：4所示。

本发明还提供了一种检测mirnas-21的试剂盒，其特征在于，包括上述探针组。

作为优选，所述的试剂盒还包括金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管，所述金纳米棒和聚二乙炔微米管分别经单链dna修饰，且修饰金纳米棒的单链dna与修饰聚二乙炔微米管的单链dna碱基互补。

作为优选，所述金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。

作为优选，所述修饰金纳米棒的单链dna的序列如seqidno：1所示；所述修饰聚二乙炔微米管的单链dna的序列如seqidno：2所示。

本发明还提供了所述探针组、所述试剂盒在制备癌症诊断产品中的应用。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种检测mirnas-21的方法、探针组及试剂盒。本发明所述检测mirnas-21的方法，将金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管与h1探针、h2探针和待测样品混合，检测金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管端头光波导荧光亮度的变化；其中所述金纳米棒和聚二乙炔微米管分别经单链dna修饰，且修饰金纳米棒的单链dna与修饰聚二乙炔微米管的单链dna碱基互补；h1探针与h2探针均为发夹探针，在mirnas-21存在下可自组装形成双链结构，然后通过toehold与修饰金纳米棒的单链dna发生链置换反应。本发明所述检测mirnas-21的方法中修饰金纳米棒的单链dna与修饰聚二乙炔微米管的单链dna通过杂交配对形成金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管，同时使聚二乙炔微米管端头光波导荧光淬灭，将金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管与h1探针、h2探针和待测样品混合后，待测样品中的目标分子mirna-21可催化发夹探针自组装，形成双链结构，通过toehold与修饰金纳米棒的单链dna进行单链取代，金纳米棒与聚二乙炔微米管脱离，从而使聚二乙炔微米管端头光波导荧光从淬灭转而恢复，根据荧光变化强度可检测待测样品中的mirnas-21的含量。实验表明本发明所述检测方法，对mirna-21显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示聚二乙炔微米管端头光波导荧光恢复的具体反应原理示意图；

图2示实施例1单链dna修饰微米管的反应过程的示意图(a)及修饰的微米管红外光谱(b)和拉曼光谱图(c)；其中图(b)中i代表聚二乙炔微米管的红外光谱图，ii代表聚二乙炔微米管和烯丙基缩水甘油醚反应后得到双键修饰的聚二乙炔微米管的红外光谱图，1130cm^-1代表c-o-c键的伸缩振动，923cm^-1代表c＝ch键的伸缩振动；图(c)中i代表双键修饰的聚二乙炔微米管的拉曼光谱图，ii代表单链dna修饰的聚二乙炔微米管拉曼光谱图，多出来的峰为dna的特征峰；

图3示实施例3单链dna修饰的金纳米棒与单链dna修饰的聚二乙炔微米管杂交的反应过程的示意图(a)及得到的金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管的xps光谱图(b)和的光波导荧光变化(c)；其中图(b)中i代表单链dna修饰的聚二乙炔微米管的xps光谱图，ii代表单链dna修饰的金纳米棒与单链dna修饰的聚二乙炔微米管杂交后的xps光谱图，杂交后微米管表面有金元素，表明杂交成功；图(c)单链dna修饰的金纳米棒与单链dna修饰的聚二乙炔微米管杂交后，微米管端头荧光光谱变化图，随着单链dna修饰的金纳米棒浓度不断提高，微米管端头荧光强度不断降低；

图4示实施例4金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管在疏水片上反应的浓缩富集效应示意图(a)，金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管检测mirna-21的示意图(b)及不同浓度mirna-21反应后的金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管光波导荧光变化(c)；其中图(a)中在疏水片上进行反应，根据浓缩富集效应，反应物集中于微米管表面发生反应；图(b)中在金纳米棒-微米管体系中，由532nm光激发后，微米管端头荧光微弱，当加入检测的mirna-21后，微米管端头荧光亮度增强；图(c)在金纳米棒-微米管体系中，加入不同浓度的mirna-21溶液，浓度由10fm到50pm，微米管端头荧光逐渐恢复，并且从10fm到100fm的浓度范围内，微米管端头荧光变化和mirna-21的浓度成比例关系；

图5示实施例5金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管检测不同浓度的mirna-21光波导荧光变化图(a)及检测极限图(b)；在金纳米棒-微米管体系中，加入不同浓度的mirna-21溶液，浓度由10fm到50pm，微米管端头荧光逐渐恢复，并且从10fm到100fm的浓度范围内，微米管端头荧光变化和mirna-21的浓度成比例关系；

图6示实施例6金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管检测不同浓度mirna-21、单碱基错配mirna-21、三碱基错配mirna-21、mirna-144、mirna-199a的光波导荧光变化图；

图7示实施例7金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管检测健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清、胃癌病人的血清的光波导荧光变化变化图。

具体实施方式

本发明公开了一种检测mirnas-21的方法、探针组及试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所述检测mirnas-21的方法中修饰金纳米棒的单链dna与修饰聚二乙炔微米管的单链dna通过杂交配对形成金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管，同时使聚二乙炔微米管端头光波导荧光淬灭；将金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管与h1探针、h2探针和待测样品混合后，待测样品中的目标分子mirna-21可催化发夹探针自组装，形成双链结构，通过toehold与修饰金纳米棒的单链dna进行单链取代，金纳米棒与聚二乙炔微米管脱离，从而使聚二乙炔微米管端头光波导荧光从淬灭转而恢复。根据荧光变化强度可检测待测样品中的mirnas-21的含量。

聚二乙炔微米管端头光波导荧光恢复的具体反应原理如图1所示。mirna-21通过红色toehold端把h1探针发夹结构打开，并和h1探针杂交形成h1-mir-21。h2探针通过蓝色toehold端把h1-mir-21中的mirna-21替换下来，h1和h2杂交形成h1-h2。在这一过程中，mirna-21可看做催化剂，使反应循环发生，同时mirna-21不消耗，从而提高微米管传感器检测target的灵敏度，降低反应极限。

本发明所述聚二乙炔微米管采用聚二乙炔化合物材料，能将检测与显示集为一体，是一种非常理想的传感器材料。本发明通过组装方法制备一维聚二乙炔微米管，构筑高灵敏度、高选择性的新型生物传感器用于复杂生物环境中的mirna的检测。

本发明用于制备聚二乙炔微米管的氨基双炔单体的方法如下：二乙炔分子与1.2倍当量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)及1.2倍当量的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解于30ml精制的二氯甲烷中，25℃条件下磁子搅拌反应6小时，得到的产物经过旋蒸、萃取，再加入1.1倍当量的乙二胺液体溶于二氯甲烷溶剂中，30℃下磁子搅拌反应1小时，最后经过萃取、旋蒸，得到氨基双炔单体。

本发明所述聚二乙炔微米管的制备方法具体为：取0.0056g氨基双炔与0.00075g十八胺取代的三聚氰胺溶于2ml的无水乙醇溶液中，将溶液倒入到75℃的300ml超纯水中，超声60min后置于黑暗处自然冷却至室温，再放入4℃的冰箱中过夜，即可得到复合囊泡。在称量瓶分别加入10ml囊泡溶液与10μl的硝酸铅溶液，在室温下敞开放置于通风处，两至三周后出现白色丝状物质的析出，即得到聚二乙炔微米管。

在一些实施方案中，本发明所述单链dna修饰的聚二乙炔微米管的制备方法具体为：聚二乙炔微米管从称量瓶中取出，置于254nm的紫外灯管下，照射10分钟，使双炔聚合变成蓝相。蓝相的双炔置于80℃加热10分钟，使其变为红相。取20μl烯丙基缩水甘油醚稀释至10ml，加入微米管，30℃下反应过夜，得到双键修饰的微米管。将单根微米管与200μl的巯基修饰的单链dna及2959光引发剂(n(2959):n(dna)＝1:100)混合均匀，在365nm光照下反应6小时，得到单链dna修饰的微米管。

进一步的，在一些实施方案中，本发明所述单链dna修饰的金纳米棒的制备方法具体为：通过种子生长法制备出金纳米棒，与巯基修饰的单链dna进行孵育，得到单链dna修饰的金纳米棒。

在一些实施方案中，所述修饰金纳米棒的单链dna的序列如seqidno：1所示；所述修饰聚二乙炔微米管的单链dna的序列如seqidno：2所示。

在一些实施方案中，所述h1探针的序列如seqidno：3所示；所述h2探针的序列如seqidno：4所示。

在一些实施方案中，所述金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。疏水片具有浓缩富集效应，可使h1探针、h2探针和待测样品混合的液滴聚集在金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管表面，提高反应灵敏度，降低反应极限。

按照本发明，本领域技术人员可以理解本发明所述待测样品包括但不限于血清。

本发明还提供了一种检测mirnas-21的探针组，包括h1探针与h2探针，h1探针与h2探针均为发夹探针，在mirnas-21存在下可自组装形成双链结构，然后通过toehold与修饰金纳米棒的单链dna发生链置换反应。

在一些实施方案中，所述h1探针的序列如seqidno：3所示；所述h2探针的序列如seqidno：4所示。

本发明还提供了一种检测mirnas-21的试剂盒，包括上述探针组。

在一些实施方案中，所述的试剂盒还包括金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管，所述金纳米棒和聚二乙炔微米管分别经单链dna修饰，且修饰金纳米棒的单链dna与修饰聚二乙炔微米管的单链dna碱基互补。

在一些实施方案中，所述修饰金纳米棒的单链dna的序列如seqidno：1所示；所述修饰聚二乙炔微米管的单链dna的序列如seqidno：2所示。

在某一实施方案中，本发明分别向不同的单根聚二乙炔微米管上滴加mirna-21、单碱基错配mirna-21、三碱基错配mirna-21、mirna-144、mirna-199a，然后加入h1探针、h2探针，结果显示只有加入mirna-21时聚二乙炔微米管端头光波导荧光变化强烈，表明聚二乙炔微米管检测mirna-21具有良好的选择性。

在某一实施方案中，本发明向单根微米管上滴加h1探针、h2探针及健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清或胃癌病人的血清，结果显示，患有癌症的病人血清，其mirna-21信号表达明显高于健康人血清。

因此本发明还提供了所述探针组、所述试剂盒在制备癌症诊断产品中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优点和效果之一：对mirna-21的检测显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确，检测手段简单。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：单链dna修饰的微米管的制备

取20μl烯丙基缩水甘油醚稀释至10ml，加入聚二乙炔微米管，30℃下反应过夜，得到双键修饰的聚二乙炔微米管。将单根聚二乙炔微米管与200μl的5’端巯基修饰的单链dna(ssdna1序列如seqidno：1所示)、2959光引发剂(n(2959):n(ssdna1)＝1:100)混合均匀，在365nm光照下反应6小时，得到单链dna修饰的聚二乙炔微米管。其中单链dna修饰的聚二乙炔微米管的微米管红外光谱见图2b，单链dna修饰的聚二乙炔微米管拉曼光谱见图2c。

实施例2：单链dna修饰金纳米棒

通过种子生长法制备出金纳米棒，纯化后与5’端巯基修饰的单链dna(ssdna2序列如seqidno：2所示)进行孵育(金纳米棒与dna的摩尔比为1:25600)，得到单链dna修饰的金纳米棒。具体操作为：首先向7.5ml的0.1m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中加入250μl的0.01m的氯金酸，并搅拌均匀。然后加入600μl的0.01m的硼氢化钠溶液(硼氢化钠提前在-20℃下放置10分钟)，之后在机械搅拌下(转速400rpm)搅拌2分钟。2分钟后会形成浅棕色的溶液，即为金种子溶液。金种子溶液需在室温下放置1小时后使用。生长溶液的制备:机械搅拌条件下(搅拌速度为250rpm)，将9.5ml的0.1m的十六烷基三甲基溴化铵，400μl的0.01m的氯金酸混合，搅拌均匀，加入60μl0.01m的硝酸银，然后将64μl的0.1m的抗坏血酸加入上述溶液中，观察到此时溶液的颜色由亮黄色变为无色透明，说明弱还原剂抗坏血酸将au³⁺还原成au⁺。最后把20μl的金种子加入上述溶液中，搅拌1分钟后停止搅拌，静置一夜即可得到金纳米棒。整个实验过程要求避光，温度为25℃。。将制得的金纳米棒在13000rcf下离心30分钟，移除上清液，沉淀溶解在10mmpbs中(ph＝8.0，包含0.3％(w/v)十二烷基硫酸钠)。将此过程重复三次，最后得到10ml纯化的金纳米棒，悬浮在上述缓冲溶液中。然后加入10ml聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液(10％w/v)，在40℃下搅拌18小时。反应完成之后离心，移除上清液，重新分散在含有0.3％十二烷基硫酸钠的pbs中，。这个过程重复三次。之后测试紫外吸收光谱，根据朗伯比尔定律a＝kbc，算出金纳米棒的浓度。得到金纳米棒的具体浓度后，加入巯基修饰的dna。所加入的dna提前用三(2-羧乙基)膦处理2小时，使得被氧化了的巯基被还原。然后按照dna与金纳米棒摩尔比为25600：1加入dna，超声5秒后，室温下放置16小时。反应完成后加盐熟化以减弱金纳米棒与dna之间的静电相互作用，使更多的dna与金纳米棒反应。盐溶液为10mmpb(ph＝8.0)、300mm氯化钠、4mm氯化镁、0.3％十二烷基硫酸钠的混合溶液。每隔半小时加一次，使得最终盐浓度为150mm氯化钠，2mm氯化镁。。室温下放置16小时后，在9300rcf离心3次，每次30分钟。这个过程重复3次。最终将制备好的单链dna修饰金纳米棒悬浮于缓冲液中，置于4℃冰箱保存。

实施例3：金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管

将单链dna修饰的金纳米棒与单链dna修饰的聚二乙炔微米管杂交，得到金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管。具体操作为：用针管挑出单根的聚二乙炔微米管于小试管中，浸没于200μl单链dna修饰的金纳米棒溶液中，置于90℃水浴环境中5分钟。之后将小试管移出水浴锅缓慢降温至室温，降温时间约为1h-2h。反应完成后，用针管从金纳米棒溶液中挑出聚二乙炔微米管，用超纯水轻轻地冲洗微米管数次，除去未吸附的金纳米棒。

对得到金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管进行光波导荧光变化的检测，结果见图3c。xps光谱检测结果见图3b。结果显示杂交后微米管表面有金元素，表明杂交成功，获得金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管。

实施例4：检测mirna

将实施例3得到的金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管置于疏水片上，滴加10μl包含h1(300nm，序列如seqidno：3所示)探针、h2(1000nm，序列如seqidno：4所示)探针、mirna-21(序列如seqidno：5所示)的溶液，室温下放置2h，超纯水清洗后进行光波导荧光变化的检测，结果见图4。结果显示在疏水片上进行反应，根据浓缩富集效应，反应物集中于微米管表面发生反应。在金纳米棒-微米管体系，由532nm光激发后，微米管端头荧光微弱，当加入检测的mirna-21后，微米管端头荧光亮度增强。随着加入的mirna-21浓度的逐渐增强，微米管端头荧光逐渐恢复。实施例5：灵敏度检测

将实施例3得到的金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管至于疏水片上，滴加10μl包含h1(300nm)探针、h2(1000nm)探针、mirna-21的溶液。其中mirna-21的浓度由10fm增加到50pm，观察金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管端头光波导荧光亮度的变化结果见图5a。以mirna-21浓度为横坐标，以金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管光波导荧光亮度变化为纵坐标，计算检测极限，结果见图5b。

结果显示，在金纳米棒-微米管体系中，加入不同浓度的mirna-21溶液，浓度由10fm到50pm，微米管端头荧光逐渐恢复，并且从10fm到100fm的浓度范围内，微米管端头荧光变化和mirna-21的浓度成比例关系。

实施例6：专一性检测

分别向不同的实施例3得到的金纳米棒修饰的单根聚二乙炔微米管上滴加10μlmirna-21、单碱基错配mirna-21(序列如seqidno：6所示)、三碱基错配mirna-21(序列如seqidno：7所示)、mirna-144(序列如seqidno：8所示)、mirna-199a(序列如seqidno：9所示)，然后分别加入h1(300nm)探针、h2(1000nm)探针，室温下放置2h，超纯水清洗后进行光波导荧光变化的检测，观察金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管对mirna-21的专一性，结果见图6。

结果显示，在四个浓度下，金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管分别与单碱基错配的mirna-21，三碱基错配的mirna-21，mirna-144，mirna-199a反应后，金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管的荧光无法恢复。当加入mirna-21时，发现金纳米棒修饰的聚二乙炔微米管的荧光恢复。表明本发明所述检测方法对于mirna-21有较好的检测专一性。

实施例7：血清检测

分别向不同的实施例3得到的金纳米棒修饰的单根聚二乙炔微米管上滴加含有健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清、胃癌病人的血清，然后分别加入h1(300nm)探针、h2(1000nm)探针，室温下放置2h，超纯水清洗后进行光波导荧光变化的检测，结果见图7。

结果显示，患有三种癌症的病人血清，其信号表达明显高于健康人血清。

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<110>中国科学技术大学

<120>一种检测mirnas-21的方法、探针组及试剂盒

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