本发明属于基因检测领域，具体涉及一种适用于胚胎植入前染色体异常检测的方法。
背景技术：
近年来，受现代饮食、环境、生活习惯等因素影响，我国不孕不育越来越高发，局部地区发病率高达15％，意味着每10对育龄夫妻中就有1对患不孕不育。特别是在国家取消独生子女政策后，全面放开二孩政策，曾期盼已久、却受政策限制不能生、不敢生的家庭、再婚家庭、失独家庭、被拐家庭、高龄家庭等，再生育的欲望被广泛激发，但随之而来的是不孕不育的困挠，给不孕不育诊疗带来了不少新命题。
辅助生殖技术可有效解决这一问题，其中，试管婴儿就是最被普遍认可的技术之一。我国辅助生殖领域在高速发展阶段，但妊娠率和活产率低的情况仍普遍存在，造成巨大的医疗资源的浪费和经济、健康损失，提高试管婴儿成功率成为各大辅助生殖中心面临的重要问题。据报道，通过试管婴儿技术获得的胚胎通常有40％～60％存在染色体异常，这是导致试管婴儿失败的主要原因之一，通过对植入前的胚胎进行遗传学检测，确保染色体数目以及结构正常以后再进行胚胎植入，可以有效提高植入健康胚胎的概率，改善妊娠结果，因此胚胎植入前遗传学筛查(preimplantationgeneticscreening，pgs)技术开始越来越受到重视。
胚胎植入前遗传学筛查是指胚胎植入着床前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎23对染色体的结构和数目，分析胚胎是否有遗传物质异常的一种早期产前筛查方法。常见的染色体数目异常的情况有18三体综合征、唐氏综合症等；染色体结构异常的会导致胎儿的先天缺陷。胚胎植入前遗传学筛查可以阻断在胚胎着床前，避免患儿出生，从而避免和减少遗传病的发生，减轻家庭和社会经济负担。
目前，胚胎着床前遗传学筛查主要采用荧光原位杂交(fish)和微阵列比较基因组杂交技术[1](arraycgh)，而应用fish进行胚胎筛选，受探针限制，不能同时检测所有染色体状态，最多只能检测23条染色体中的11条染色体的缺失或者重复等染色体异常。同时由于需要多轮洗脱和探针杂交、同一种荧光信号要被不同的探针反复使用，因而假阳性率很高。arraycgh检测的准确度高，但只能检测到芯片覆盖区域，未知区域检测不到，同样不能检测到所有染色体状态。近年来，随着下一代高通量测序(nextgenerationsequencing，ngs)技术的迅速发展，由于其存在分辨率高，通量大等优势，目前已经被广泛应用于植入前染色体异常筛查。例如使用传统的全基因组扩增方法联合传统建库方法，可以检测到染色体的所有状态，但该方法获得的测序数据波动大，导致染色体异常检测的准确度降低，这一问题在染色体上部分区域结果异常如dna拷贝数变异(copynumbervariations，简称cnv)等的检测结果影响尤为严重。增加误诊风险，影响试管婴儿的种植成功率和出生成功率，造成出生缺陷率增高。
非专利文献
[1]munne,s.preimplantationgeneticdiagnosisforaneuploidyandtranslocat-ionsusingarraycomparativegenomichybridization.curr.genomics,2012,13:463-470.
技术实现要素：
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种适用于胚胎植入前染色体异常检测的方法。
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过对全基因组扩增方法和传统文库构建方法进行改进，有效提高了染色体异常检测准确度，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种用于胚胎植入前染色体异常检测的方法，该方法包括：
步骤a：将样本细胞进行细胞裂解，获得裂解产物；
步骤b：将裂解产物进行pcr扩增，获得预扩增产物；
步骤c：将预扩增产物进行pcr扩增，纯化，获得扩增dna片段；
步骤d：利用dsdnafragmentase对扩增的dna片段进行打断，纯化，获得打断的dna片段；
步骤e：将所述打断的dna片段进行末段修复，纯化，得到平末端dna片段；
步骤f：将所述平末端dna片段进行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；
步骤g：将所述3'端加a的dna片段进行加接头，纯化，得到加接头的dna片段；
步骤h：将所述加接头的dna片段进行pcr扩增，纯化，得到扩增产物；
其中，步骤a中所述裂解反应条件为50℃30分钟，99℃4分钟，4℃保存；
步骤c中所述pcr扩增的反应条件为95℃3分钟，(94℃30秒，65℃5分钟)19个循环，4℃保存；
步骤e中所述末端修复使用试剂包括：1μlt4dna聚合酶，1μlt4多聚核苷酸激酶、1μlklenow片段、5μl10×多聚核苷酸激酶缓冲液及1μldntp；
步骤f中所述3'端加a使用试剂包括：0.5μlklenow片段(3'-5'exo-)、2.5μldatp及2.5μl10×缓冲液；
步骤g中所述加接头使用试剂包括：1μlt4dna连接酶，25μlt4dna连接酶缓冲液，1μl接头；
步骤h中所述pcr扩增的扩增引物包括：
ann引物序列(seqidno:1)：
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'
index引物序列(seqidno:2)：
5'-caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc-3'；
其中，n为随机碱基。
2.根据项1所述的方法，其中，所述步骤a中所述的样本为囊胚滋养外层细胞、减数分裂期极体细胞、卵裂期单个卵裂球中任意一种。
3.根据项1所述的方法，其中，所述步骤d的打断的条件为37℃30分钟。
4.根据项1所述的方法，其中，所述步骤e的末端修复的条件为20℃30分钟。
5.根据项1所述的方法，其中，所述步骤f的3'端加a的反应条件为37℃30分钟。
6.根据项1所述的方法，其中，所述步骤h的pcr扩增条件为94℃预变性2分钟、(94℃变性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)11个循环、72℃延伸10分钟、4℃保存。
7.一种用于胚胎植入前染色体异常检测的试剂盒，其用于实施项1～6中任一项所述的方法，其包括：
用于所述打断的试剂；
用于所述末端修复的试剂；
用于所述3'端加a的试剂；
用于所述加接头的试剂；
用于所述pcr扩增的试剂；
用于所述纯化的试剂。
发明效果
根据本发明，通过优化全基因组扩增方法，获得了均一性的扩增产物，再通过优化的文库构建方法进行构建，提高了染色体核型和cnv结果准确度，有效提高了染色体异常检测的准确度。
发明的具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
首先，本发明提供一种用于胚胎植入前染色体异常检测的方法，其包括：
步骤a：将样本细胞进行细胞裂解，获得裂解产物；
步骤b：将裂解产物进行预扩增，获得预扩增产物；
步骤c：将预扩增产物进行pcr扩增，纯化，获得扩增dna片段；
步骤d：利用dsdnafragmentase对扩增的dna片段进行打断，纯化，获得打断的dna片段；
步骤e：将所述打断的dna片段进行末段修复，纯化，得到平末端dna片段；
步骤f：将所述平末端dna片段进行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；
步骤g：将所述3'端加a的dna片段进行加接头，纯化，得到加接头的dna片段；
步骤h：将所述加接头的dna片段进行pcr扩增，纯化，得到扩增产物；
其中，步骤a中所述裂解反应条件为50℃25～60分钟，99℃4分钟，4℃保存；优选地，裂解反应条件为50℃30～40分钟，99℃4分钟，4℃保存；更优选地裂解反应条件为50℃30分钟，99℃4分钟，4℃保存。
步骤c中所述pcr扩增的反应条件为95℃3分钟，(94℃30秒，65℃5分钟)15～25个循环，4℃保存；优选地，循环数为15～20；更优选地，循环数为19个。
步骤e中所述末端修复使用试剂包括：1μlt4dna聚合酶，1μlt4多聚核苷酸激酶、1μlklenow片段、5μl10×多聚核苷酸激酶缓冲液及1μldntp；
步骤f中所述3'端加a使用试剂包括：0.5μlklenow片段(3'-5'exo-)、2.5μldatp及2.5μl10×缓冲液；
步骤g中所述加接头使用试剂包括：1μlt4dna连接酶，25μlt4dna连接酶缓冲液，1μl接头；
步骤h中所述pcr扩增的扩增引物包括：
ann引物序列(seqidno:1)：
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'
index引物序列(seqidno:2)：
5'-caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc-3'；
其中，n为随机碱基，nnnnnnn为标签序列。在这里，标签序列可作为不同样本文库的标记，不同样本使用的标签序列不同，测序后将测序数据按照标签序列将样本数据进行区分。
优选地，所述步骤a中所述的样本为囊胚滋养外层细胞、减数分裂期极体细胞、卵裂期单个卵裂球中任意一种。更优选地，所述样本为囊胚滋养外层3～5个细胞。
优选地，所述步骤d的打断的条件为37℃30分钟。
优选地，所述步骤e的末端修复条件为20℃30分钟。
优选地，所述步骤f的3'端加a的反应条件为37℃30分钟。
优选地，步骤h的pcr扩增条件为94℃预变性2分钟、(94℃变性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)11个循环、72℃延伸10分钟、4℃保存。
优选地，本发明的方法中，步骤c与步骤d之间、步骤d与步骤e之间、步骤e和步骤f之间、步骤g和步骤h之间、步骤h之后还包括产物纯化步骤。本发明技术领域人员可以采用传统建库中用于纯化的方法、试剂或装置来进行。
在另一方面，本发明提供一种用于胚胎植入前染色体异常检测的试剂盒(本发明的试剂盒)，其可用于实施本发明的方法。该试剂盒包括：
用于所述打断的试剂，例如dsdnafragmentase及相应的酶切反应缓冲液等；
用于所述末端修复的试剂，例如t4dna聚合酶、t4多聚核苷酸激酶、dntp、klenow片段、10×多聚核苷酸激酶缓冲液等；
用于所述3'端加a的试剂，例如缺失外切酶活性的klenow片段及相应的反应缓冲液等；
用于所述加接头的试剂，例如接头、t4dna连接酶及相应的连接反应缓冲液；
用于所述pcr扩增的试剂，例如kapahifihotstartreadmix、ann公共引物、index引物等；
用于所述纯化的试剂，例如核酸纯化试剂(annoroad公司)、ampurexp纯化磁珠(agencourt公司)等。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。
实施例1
1全基因组扩增
选择一个发育5～6天的处于囊胚期的胚胎，取3份滋养外层细胞，每份取细胞3～5个，分别命名为样本1、样本2和样本3。样本1～3分别用无菌ddh2o补足至9μl体系。
对样本1进行如下操作。
1.1细胞裂解
配置裂解液mix，如下表1，
表1
取裂解液mix1μl加入位于pcr管的9μl体系中，注意将裂解液mix加到管壁上，勿使枪头靠近管底液体。此时管内体积为10μl，离心后上pcr仪。pcr裂解程序(热盖105℃)，程序如下表2，获得裂解产物。
表2
1.2预扩增
准备解链增试剂(如表3)，总体积3μl，加入到的10μl细胞裂解产物中。
表3
pcr解链(热盖105℃)，95℃2分钟，进行解链完毕后注意保持4℃，然后加入1μllibrarypreparationenzyme，进行pcr扩增。pcr预扩增程序(热盖105℃)，如下表4。获得预扩增产物。
表4
1.3pcr扩增
扩增mix准备(如下表5)，震混离心后，取61μl扩增mix加入到14μl预扩增体系中，此时的总体积为75μl。
表5
pcr扩增程序(热盖105℃)，如下表6进行，获得扩增产物。
表6
1.3.1纯化
(1)取75μl(1×)纯化磁珠悬浮液(annoroad公司)加入扩增产物中，充分混匀，静置8分钟。
(2)静置时间到，短暂离心上磁力架，待吸附2分钟后移除澄清液体。
(3)加入200μl70％乙醇，静置30秒后移除，重复一次。
(4)待晾干，加入40μlddh2o后，将样本从磁力架上去下，与纯化磁珠悬浮液混匀后静置5分钟。
(5)静置时间到，短暂离心上磁力架，待吸附2分钟后收集液体到新的1.5ml离心管。
(6)获得纯化后pcr扩增产物。
2酶切打断
将扩增的dna片段进行酶切打断，打断起始量为10ng，反应体系如下表7，
表7
反应条件为37℃，5分钟；反应结束后，加入5μl，0.5medta终止反应；再加入2.5μl10％sds混匀后，取49.5μl纯化磁珠悬浮液，70％乙醇洗两次，41.5μlddh2o洗脱dna，获得打断的dna片段。
3末端修复
对步骤2获得的酶切产物进行末端修复，反应体系如下表2，
表8
反应条件为20℃，30分钟，取90μl纯化磁珠悬浮液，70％乙醇洗两次，20μlddh2o洗脱dna，获得平末端dna片段。
43'端加a反应
取步骤3中获得的平末端dna片段按表9进行3'端加a反应，反应体系如下：
表9
反应条件为37℃，30分钟，获得3'端加a的dna片段。
5加接头反应
取步骤4中获得的3'端加a的dna片段进行加接头反应，反应体系如下表10，
表10
反应条件为20℃，15分钟，取93.6μl纯化磁珠悬浮液，70％乙醇洗两次，18μlddh2o洗脱dna，得到加接头dna片段。
6pcr反应
取步骤5中获得的加接头dna片段，使用表11中的反应体系进行pcr，反应体系如下表，使用index1引物，公共引物进行pcr。
index1引物序列(seqidno:3)：
5'-caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtgactggagttc-3'
ann引物序列(seqidno:1)：
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'
表11
反应条件为：
取50μl纯化磁珠悬浮液，70％乙醇洗两次，20μlddh2o洗脱dna，获得pcr扩增产物(文库)，完成文库构建。
7文库浓度测定
使用安捷伦2100和qpcr方法检测文库的峰图和浓度。
8上机测序
使用测序仪550ar对构建的文库进行测序，将下机数据进行生物信息学分析。
对比例
使用样本2使用dop-pcr进行全基因组扩增，得到扩增产物之后，利用传统文库构建方法进行建库，获得样本2的文库。将样本2的文库进行测序，测序策略与实施例中步骤8一致。
将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因组参考图谱上，通过与参考基因组的对比分析，查找各染色体上存在的数目和结构异常；经分析，本发明的方法检测到样本1在5号染色体短臂上存在12.5m的缺失(表12)，存在一处cnv。对比例中样本2存在三处cnv，即在5号染色体短臂上存在两处缺失，在5号染色体长臂上存在一处缺失。并使用样本3进行arraycgh验证发现样本3在5号染色体短臂上存在一处缺失(表12)，结果与样本1检测结果一致，说明该方法(本发明方法)能够准确的检测出样本cnv。
表12
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，能够适用于胚胎植入前染色体异常检测的方法及试剂盒。
序列表
<110>安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120>一种用于胚胎植入前染色体异常检测的方法及试剂盒
<130>1703recn
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>ann引物
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac45
<210>2
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>index引物
caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc45
<210>3
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>index1引物
caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtgactggagttc45