基于帕唑帕尼结构的HDAC和VEGFR双靶点抑制剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

帕唑帕尼pazopanib是一个多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，对血管内皮生长因子受体vegfr的三个亚型(vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3)以及相关联的受体酪氨酸激酶(pdgfrβ,c-kit,fgf-r1,c-fms)均表现出较好的抑制活性(ic50:10,30,47,84,74,140,146nm)(harris,philipa.etc.,journalofmedicinalchemistry2008,51,4632)。帕唑帕尼于2009年10月被美国食品药品监督管理局fda批准上市用于有既往化疗经历患者的晚期肾细胞癌的治疗(bukowski.etc.,naturereviewsdrugdiscovery,2010,9,17)，在2012年04月又被fda批准上市用于晚期软组织肉瘤的治疗(wilky,breelyna.etc.,currentopinioninoncology,2013,25,373)。然而近年来，帕唑帕尼在临床应用过程中出现了低应答率和耐药性的问题(gotinkkj.etc.,cellularoncology,2015,38,119)，药物联合应用和研发多靶点药物是增强肿瘤对药物敏感性和降低肿瘤耐药性的一个策略。

组蛋白去乙酰化酶hdacs是体内调控组蛋白乙酰化水平的一组酶，组蛋白的乙酰化水平对染色质的结构和基因的转录调节有着重要的影响，hdacs突变和异常表达通常与肿瘤的发生密切相关。hdacs抑制剂已被证实具有抗肿瘤作用，目前已有5个小分子hdac抑制剂被批准上市用于多种血液瘤的治疗(lix.etc.,currentdrugtargets,2014,15,622)。随着hdac和vegf/vegfr信号通路关系的逐渐阐明，帕唑帕尼与hdac抑制剂联合应用引起了研究者的兴趣。研究发现，帕唑帕尼与hdac抑制剂(vpa,saha)的联用在软组织肉瘤中表现出了相加或协同的体内外抗肿瘤作用，并且联合用药能逆转帕唑帕尼耐药肿瘤株的耐药性(tavallais.etc.,cancerbiology&therapy,2014,15,578)。hdac抑制剂ar-42与帕唑帕尼的联用在体内外实验中表现出了对达拉菲尼/曲美替尼耐药的黑色素瘤的杀灭作用，其协同作用与激活多条信号通路有关(boothl.etc.,oncotarget,2017,8,16367)。2015年报道的一项临床i期研究显示帕唑帕尼与hdac抑制剂saha联合用药时，对tp53突变尤其是转移性肉瘤和转移性结直肠癌的肿瘤病人表现出了明显的疗效，其中位无进展生存期和中位总生存期明显延长(fus.etc.,annalsofoncology,2015,26,1012)。2017年最新报道的的一项临床i期研究显示hdac抑制剂abexinost与帕唑帕尼联用具有良好的耐受性，并能有效克服帕唑帕尼耐药(aggarwal,rahul,etc.,journalofclinicaloncology,2017,35,1231)。

临床上，不同作用机制的抗肿瘤药物联合应用已被认为是避免药物耐受的标准方案，但联合用药存在以下的问题：(1)联合用药药代动力学复杂，药物-药物相互作用，不良反应难以预测；(2)不同药物的配伍和剂量设置在临床上存在困难。多靶点药物是指同时作用于多个靶点的单一药物分子，多靶点药物不仅具备联合用药的优点，而且克服了联合用药的一些缺陷。多靶点药物药代动力学简单，避免了药物—药物相互作用，更加安全，提高了病人的依从性，成为当前抗肿瘤药物设计的一个热门方向。目前，基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂在现有技术中未见相关报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂，本发明还提供了上述化合物的制备方法和用途。

本发明的技术方案为：

一、基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂

本发明含有基于帕唑帕尼结构的hdac/vegfr双靶点抑制剂，其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，具有如下通式i、ii或iii所示的结构：

其中：

x是

n是0～9；

y是

根据本发明优选的，

通式i中y和ii中x处于对位或间位；

x是

n是0～7；

y是

进一步优选的，上述化合物是下列之一：

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-羟基苯甲酰胺(6a)、

3-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-羟基苯甲酰胺(6b)、

5-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-羟基-2-甲基苯甲酰胺(6c)、

n-(2-氨基苯基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(6d)、

n-(2-氨基苯基)-3-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(6e)、

(e)-3-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-羟基丙烯酰胺(10a)、

(e)-3-(3-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-羟基丙烯酰胺(10b)、

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(2-(羟胺)-2-氧代乙基)苯甲酰胺(13a)、

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(3-(羟胺)-3-氧代丙基)苯甲酰胺(13b)、

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(4-(羟胺)-4-氧代丁基)苯甲酰胺(13c)、

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(5-(羟胺)-5-氧代戊基)苯甲酰胺(13d)、

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(6-(羟胺)-6-氧代己基)苯甲酰胺(13e)、

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(7-(羟胺)-7-氧代庚基)苯甲酰胺(13f)、

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(8-(羟胺)-8-氧代辛基)苯甲酰胺(13g)、

3-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(6-(羟胺)-6-氧代己基)苯甲酰胺(13h)、

5-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(6-(羟胺)-6-氧代己基)-2-甲基苯甲酰胺(13i)、

n-(2-((2-氨基苯基)氨基)-2-氧代乙基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14a)、

n-(3-((2-氨基苯基)氨基)-3-氧代丙基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14b)、

n-(4-((2-氨基苯基)氨基)-4-氧代丁基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14c)、

n-(5-((2-氨基苯基)氨基)-5-氧代戊基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14d)、

n-(6-((2-氨基苯基)氨基)-6-氧代己基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14e)、

n-(7-((2-氨基苯基)氨基)-7-氧代庚基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14f)、

n-(8-((2-氨基苯基)氨基)-8-氧代辛基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14g)、

2-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基乙酰胺(19a)、

3-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基丙酰胺(19b)、

4-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基丁酰胺(19c)、

5-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基戊酰胺(19d)、

6-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基己酰胺(19e)、

7-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基庚酰胺(19f)、

8-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基辛酰胺(19g)、

n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n³-羟基丙二酰胺(23a)、

n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁴-羟基丁二酰胺(23b)、

n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁵-羟基戊二酰胺(23c)、

n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁶-羟基己二酰胺(23d)、

n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁷-羟基庚二酰胺(23e)、

n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁸-羟基辛二酰胺(23f)、

n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁹-羟基壬二酰胺(23g)、

2-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基乙酰胺(28a)

3-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基丙酰胺(28b)

4-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基丁酰胺(28c)

5-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基戊酰胺(28d)

6-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基已酰胺(28e)

7-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基庚酰胺(28f)或

8-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基辛酰胺(28g)。

二、基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂的制备方法

本发明含有基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂的制备方法，为下列方法之一：

(一)以2,3-二甲基-6-氨基-2h-吲唑为起始原料，在碳酸氢钠碱性条件下与2,4-二氯嘧啶发生亲核取代反应得到中间体2，中间体2在碳酸铯催化下，与碘甲烷反应得到中间体3，中间体3在浓盐酸催化下与不同取代的苯胺发生亲核取代反应得到关键中间体4，中间体4经甲酯保护得到中间体5，中间体5经酯的氨解反应得到终产物6a-6c；此外中间体4a-4b与邻苯二胺经酰胺缩合得到终产物6d-6e。

反应式如下：

其中4a,5a,6a,6d的苯环是对位取代，4b,5b,6b,6e的苯环是间位取代。

上述反应式中的试剂和条件：(a)2、4-二氯嘧啶，碳酸氢钠，无水乙醇，回流，4h；(b)碳酸铯，碘甲烷，n,n-二甲基甲酰胺,室温,2h；(c)异丙醇，浓盐酸，回流,4h；(d)o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸,三乙胺，邻苯二胺，n,n-二甲基甲酰胺，0℃-室温，过夜；(e)无水甲醇，二氯亚砜，回流，过夜；(f)盐酸羟胺，氢氧化钾，无水甲醇，室温，2h。

所述的不同取代的苯胺为：对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸或5-氨基-2-甲基苯甲酸。

根据本发明优选的，具体制备步骤如下：

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-羟基苯甲酰胺(6a)的制备方法，步骤如下：

(1)n-(2-氯嘧啶-4-基)-2,3-二甲基-6-氨基-2h-吲唑(2)的制备

将2,3-二甲基-6-氨基-2h-吲唑5.00g、2,4-二氯嘧啶13.9g,以及碳酸氢钠10.4g,溶于100ml无水乙醇中，加热到79℃，回流4h后,冷却降至室温，过滤，滤饼用乙酸乙酯充分洗涤，收集滤液，减压浓缩，除去溶剂，用乙酸乙酯充分打浆后过滤得到灰白色固体，用甲醇重结晶后得7.64g产物2，为白色固体。

(2)n-(2-氯嘧啶-4-基)-n,2,3-三甲基-2h-吲唑-6-胺(3)的制备

将上一步产物21.00g和碳酸铯2.40g加入到50mln,n-二甲基甲酰胺中，室温反应20min,然后缓慢加入碘甲烷0.78g，加毕，室温反应2h,将反应液倾入冰水中，立即析出大量淡黄色固体，过滤，烘干后，用乙酸乙酯重结晶得到1.06g产物3，为淡黄色晶体。

(3)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4a)的制备

将中间体30.50g和对氨基苯甲酸0.36g分散于30ml异丙醇中，加入2滴浓盐酸，加热至85℃，回流反应4h,冷却至室温，过滤，用异丙醇和乙酸乙酯洗涤滤饼，干燥得到0.53g产物4a，为白色固体。

(4)甲基4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸酯(5a)的制备

将4a0.50g加入到50ml无水甲醇中，然后在0℃下逐滴加入二氯亚砜0.60g，加毕，保温30min后，撤去冰浴后加热至回流，反应5h后，将溶剂减压蒸出，粗产物用异丙醇重结晶得到0.50g产物5a，为白色固体。

(5)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-羟基苯甲酰胺(6a)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物5a0.20g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌1h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到80.6mg产物6a，为白色固体。

n-(2-氨基苯基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(6d)的制备方法，步骤如下：

(1)n-(2-氨基苯基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(6d)的制备

将中间体4a0.50g加入到50ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.49g以及三乙胺0.26g,活化30min后，然后加入邻苯二胺0.17g，室温下反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，残渣用硅胶柱层析纯化得到0.40g产物6d,为灰白色固体。

(二)以中间体4为起始原料，与n,o-二甲基盐酸羟胺发生酰胺缩合得到中间体7，中间体7经四氢锂铝还原为醛中间体8，中间体8与磷酰基乙酸三乙酯发生霍纳尔－沃兹沃思－埃蒙斯反应得到中间体9，中间体9经酯的氨解得到终产物10。

反应式如下：

其中4a,7a,8a,9a,10a的苯环为对位取代，4b,7b,8b,9b,10b的苯环为间位取代。

上述反应式中的试剂和条件：(a)n,o-二甲基盐酸羟胺，o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸,三乙胺，n,n-二甲基甲酰胺，室温，过夜；(b)四氢锂铝，四氢呋喃，-20℃,4h；(c)磷酰基乙酸三乙酯，氢化钠，四氢呋喃，0℃-室温,过夜；(d)盐酸羟胺，氢氧化钾，无水甲醇，室温，2h。

根据本发明优选的，具体制备步骤如下：

(e)-3-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-羟基丙烯酰胺(10a)的制备：

(1)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺(7a)的制备

将中间体4a1.00g，加入到无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.98g以及三乙胺0.52g,活化30min后，然后加入n,o-二甲基盐酸羟胺0.30g和三乙胺0.31g,室温下反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝35:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.78g产物7a,为白色固体。

(2)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲醛(8a)的制备

将化合物7a1.00g溶于50ml无水四氢呋喃中，并在低温反应仪中冷却到-40℃。向其分批缓慢加入四氢锂铝0.26g，维持此温度反应2h,反应结束后，缓慢小心地用冰水淬灭反应至不再有气泡产生。反应液用水稀释，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝40:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.61g产物8a，为白色固体。

(3)乙基(e)-3-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酸酯(9a)的制备

向50ml无水四氢呋喃中加入磷酰基乙酸三乙酯0.32g，冷却至-5-0℃，缓慢加入nah0.16g,加毕，搅拌20min,然后滴加8a0.52g的四氢呋喃溶液，室温反应过夜，反应完毕后，加入50ml10％氯化铵溶液，搅拌30min后静置分层，有机相干燥后，过滤，浓缩得到粗品。残渣用二氯甲烷:甲醇＝40:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.48g产物9a，为白色固体。

(4)(e)-3-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-羟基丙烯酰胺(10a)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物9a0.50g，溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.29g产物10a,为白色固体。

(三)以中间体4为起始原料，中间体4与不同链长的氨基链烷甲酯经酰胺缩合反应得到中间体11,中间体11经酯的氨解反应得到终产物13；中间体11在氢氧化钠碱性条件下水解为中间体12，中间体12与邻苯二胺经酰胺缩合反应得到终产物14。

反应式如下：

其中4a,11a-11g,12a-12g,13a-13g,14a-14g的苯环为对位取代，4b,11h,13h的苯环为间位取代，n为1～7。

上述反应式中的试剂和条件：(a)不同链长的氨基链烷甲酯，o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸,三乙胺，n,n-二甲基甲酰胺,室温，过夜；(b)盐酸羟胺，氢氧化钾，无水甲醇，室温，2h；(c)3mnaoh,甲醇，室温，2h；(d)邻苯二胺，o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸,三乙胺，n,n-二甲基甲酰胺，室温，过夜。

所述的不同链长的氨基链烷甲酯是：甘氨酸甲酯、3-氨基丙酸甲酯、4-氨基丁酸甲酯、5-氨基戊酸甲酯、6-氨基己酸甲酯、7-氨基庚酸甲酯或8-氨基辛酸甲酯。

根据本发明优选的，具体制备步骤如下：

4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(2-(羟胺)-2-氧代乙基)苯甲酰胺(13a)的制备方法，步骤如下：

(1)甲基(4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸酯(11a)的制备

将中间体4a1.00g，加入到无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.98g以及三乙胺0.52g，活化30min后，然后加入甘氨酸甲酯盐酸盐0.39g，室温下反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，残渣用洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1体积比进行柱层析纯化得到0.87g产物11a，为白色固体。

(2)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(2-(羟胺)-2-氧代乙基)苯甲酰胺(13a)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物11a0.50g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.31g产物13a，为白色固体。

n-(2-((2-氨基苯基)氨基)-2-氧代乙基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14a)的制备，步骤如下：

(1)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸(12a)的制备

将11a1.00g加入到30ml甲醇中，然后加入5ml3mnaoh溶液，室温下搅拌4h，反应结束后，减压蒸去大部分甲醇，残余物用1mhcl溶液调节ph至5-6。过滤，滤饼用冰水洗涤，干燥后得到0.81g产物12a,为白色固体，直接投下一步。

(2)n-(2-((2-氨基苯基)氨基)-2-氧代乙基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14a)的制备

将中间体12a1g，加入到100ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.86g以及三乙胺0.45g,活化30min后，然后加入邻苯二胺0.29g，室温下反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝30:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.47g产物14a，淡黄色固体。

(四)以对硝基苯酚为起始原料，与不同链长的溴烷酸甲酯发生亲核取代反应得到中间体16，中间体16经pd/c还原得到中间体17，中间体17与化合物3发生亲核反应得到中间体18，中间体18经酯的氨解反应得到终产物19。

反应式如下：

其中n为1～7。

上述反应中的试剂和条件：(a)不同链长溴烷酸甲酯，碳酸钾，丙酮，回流，过夜；(b)pd/c,甲醇，氢气，室温，过夜；(c)异丙醇，浓盐酸，回流，过夜；(d)盐酸羟胺，氢氧化钾，无水甲醇，室温，2h。

所述的不同链长的溴烷酸甲酯是：2-溴乙酸甲酯、3-溴丙酸甲酯、4-溴丁酸甲酯、5-溴戊酸甲酯、6-溴己酸甲酯、7-溴庚酸甲酯或8-溴辛酸甲酯。

根据本发明优选的，具体制备步骤如下：

7-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基庚酰胺(19f)的制备，步骤如下：

(1)甲基7-(4-硝基苯氧基)庚酸酯(16f)的制备

将对硝基苯酚1.00g，7-溴庚酸甲酯1.93g和碳酸钾2.98g加入到50ml丙酮中，升温至回流，反应过夜，反应结束后，减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯重结晶得到1.62g产物16f，为黄色固体。

(2)甲基7-(4-氨基苯氧基)庚酸酯(17f)的制备

将中间体16f1.00g加入到50ml甲醇中，加入10％pd/c0.1g，常压搅拌下通入氢气，于室温反应过夜，过滤，滤渣用甲醇洗涤，合并滤液和洗液，减压蒸除溶剂，得到0.79g产物17f，为浅棕色固体。

(3)甲基7-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-庚酸酯(18f)的制备

将中间体30.5g，中间体17f0.52g和0.5ml浓盐酸在室温下加入到50ml异丙醇中，升温至回流，反应过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝40:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.61g产物18f，为白色固体。

(4)7-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基庚酰胺(19f)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物18f0.30g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.20g产物19f，为白色固体。

(五)以中间体3为起始原料，与对硝基苯胺发生亲核取代反应得到中间体20，中间体20经pd/c还原为中间体21，中间体21与不同链长的烷二酸单甲酯发生酰胺缩合得到中间体22，中间体22发生酯的氨解反应得到终产物23。

反应式如下：

其中n为1～7。

上述反应的试剂和条件：(a)对硝基苯胺，异丙醇，浓盐酸，回流，过夜；(b)pd/c,甲醇，氢气，室温，过夜；(c)不同链长的烷二酸单甲酯，o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸，三乙胺，n’n-二甲基甲酰胺，室温，过夜；(d)盐酸羟胺，氢氧化钾，无水甲醇，室温，2h。

所述的不同链长的烷二酸单甲酯是：丙二酸单甲酯、丁二酸单甲酯、戊二酸单甲酯、己二酸单甲酯、庚二酸单甲酯、辛二酸单甲酯或壬二酸单甲酯。

根据本发明优选的，具体制备步骤如下：

n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁸-羟基辛二酰胺(23f)的制备，步骤如下：

(1)n⁴-(2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)-n⁴-甲基-n²-(4-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(20)的制备

将中间体31.00g,对硝基苯胺0.58g以及0.5ml浓盐酸加入到70ml异丙醇中，升温至回流，反应过夜，反应结束后，冷却至室温，过滤，滤饼用少量异丙醇洗涤，干燥滤饼，得1.08g产物20,为淡黄色固体。

(2)n²-(4-氨基苯基)-n⁴-(2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)-n⁴-甲基嘧啶-2,4-二胺(21)的制备

将中间体201.00g悬浮于70ml甲醇中，加入0.1g10％pd/c，常压搅拌下通入氢气，室温反应过夜，反应结束后，减压蒸除溶剂，残渣用乙酸乙酯重结晶得到0.78g产物21，为浅棕色固体。

(3)甲基8-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酯(22f)的制备

将辛二酸单甲酯0.33g加入到50ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.68g和三乙胺0.36g，加毕，冰浴下活化30min，活化完毕后，加入中间体210.76g，撤去冰浴，室温反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝30:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.37g产物22，为白色固体。

(4)n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁸-羟基辛二酰胺(23f)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物22f0.20g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.14g产物23f，为白色固体。

(六)以对氟硝基苯为起始原料，与不同链长的氨基烷酸甲酯发生亲核取代反应得到中间体25，中间体25经pd/c还原得到中间体26，中间体26与中间体3发生亲核取代反应得到中间体27，中间体27经酯的氨解反应得到中间体28。

反应式如下：

其中n为1～7。

反应的试剂和条件：(a)不同链长的氨基烷酸甲酯，碳酸钾，n,n-二甲基甲酰胺，50℃,过夜；(b)pd/c,氢气，甲醇，过夜；(c)浓盐酸，异丙醇，回流，过夜；(d)盐酸羟胺，氢氧化钾，无水甲醇，室温，2h。

所述的不同链长的氨基烷酸甲酯是：甘氨酸甲酯、3-氨基丙酸甲酯、4-氨基丁酸甲酯、5-氨基戊酸甲酯、6-氨基己酸甲酯、7-氨基庚酸甲酯或8-氨基辛酸甲酯。

根据本发明优选的，具体制备步骤如下：

6-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基已酰胺(28e)的制备，步骤如下：

(1)甲基6-((4-硝基苯基)氨基)已酯(25e)的制备

将对氟硝基苯1.00g，6-氨基己酸甲酯盐酸盐1.54g和碳酸钾2.94g加入到50mln,n-二甲基甲酰胺中，升温到50℃，过夜，反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，析出黄色固体，过滤，烘干，残渣用石油醚：乙酸乙酯＝4:1体积比的洗脱剂进行柱层析得到1.32g产物25e，为淡黄色固体。

(2)甲基6-((4-氨基苯基)氨基)已酯(26e)的制备

将中间体25e1.00g，悬浮于70ml甲醇中，加入10％pd/c0.1g，常压搅拌下通入氢气，室温反应过夜，反应结束后，减压蒸除溶剂，残渣用乙酸乙酯重结晶得到0.71g产物26e，为棕色固体。

(3)甲基6-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-己酯(27e)的制备

将中间体30.50g，中间体26e0.49g和0.5ml浓盐酸在室温下加入到50ml异丙醇中，升温至回流，反应过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝40:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.55g产物27e，为淡黄色固体。

(4)6-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基已酰胺(28e)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物27e0.20g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.13g产物28e，为淡红色固体。

目标化合物的结构式如下所示：

所述化合物的具体制备步骤在实施例中将加以详细说明。

本领域技术人员可以对上述步骤进行优化以提高收率，他们可根据本领域的基本知识制订合成路线，如选择反应物、溶剂和温度，可通过使用各种保护基团以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见t.greene,protectinggroupsinorganicsynthesis。

发明详述

本文中所用的术语和定义含义如下：

achn细胞为人肾细胞腺癌细胞，ags细胞为人胃腺癌细胞，hel细胞为人红白细胞白血病细胞，hela细胞为人宫颈癌细胞，ht-1080细胞为人纤维肉瘤细胞，ht-29细胞为人结肠癌细胞，k562细胞为人慢性粒细胞白血病细胞，kg1细胞为人急性髓系白血病细胞，mda-mb-231为人乳腺癌细胞，molt-4为人急性淋巴母细胞白血病细胞，pc-3细胞为人前列腺癌细胞以及huvec细胞人脐静脉内皮细胞。

三、基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂的应用

本发明还提供基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂化合物在制备预防或治疗与肿瘤相关疾病药物中的应用。

所述的肿瘤相关疾病包括各类血液瘤和各类实体瘤。

所述的各类血液瘤包括：各类白血病、骨髓增生瘤。各种类型的白血病如严重的急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、急性巨核细胞白血病等。骨髓增生瘤包括慢性髓性白血病、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化、慢性嗜中性白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、系统性肥大细胞增生症及其他未分类的骨髓增生瘤。

所述的实体瘤包括：各种形式的鼻咽癌、肾细胞癌、软组织肉瘤、甲状腺乳头状癌、胸腺瘤、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤等。

一种预防或治疗与肿瘤相关疾病药物组合物，包含本发明所述的基于帕唑帕尼结构的hdac和vegfr双靶点抑制剂或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

附图说明

图1化合物6d和13f在hela细胞处理4h后的westernblot实验结果；

图2化合物6d和13f抑制huvecs管腔形成实验结果；

图3化合物6d和13f抑制大鼠胸主动脉环成血管实验结果；

图4裸鼠肿瘤照片；

图5不同剂量化合物6d和13f肿瘤生长抑制率。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

实施例1：化合物6a-6c的合成，以6a为例。

(1)n-(2-氯嘧啶-4-基)-2,3-二甲基-6-氨基-2h-吲唑(2)的制备

将2,3-二甲基-6-氨基-2h-吲唑5.00g、2,4-二氯嘧啶13.9g以及碳酸氢钠10.4g溶于100ml无水乙醇中，加热到79℃，回流4h后,冷却降至室温，过滤，滤饼用乙酸乙酯充分洗涤，收集滤液，减压浓缩，除去溶剂，用乙酸乙酯充分打浆后过滤得到灰白色固体，用甲醇重结晶后得7.64g产物2，为白色固体,产率：90.0％；mp:215-216℃.¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ9.99(s,1h),8.15(d,j＝5.9hz,1h),7.94(s,1h),7.63(dd,j＝0.8,8.9hz,1h),6.98(dd,j＝1.8,8.9hz,1h),6.77(d,j＝5.9hz,1h),4.01(s,3h),2.58(s,3h)。

(2)n-(2-氯嘧啶-4-基)-n,2,3-三甲基-2h-吲唑-6-胺(3)的制备

将上一步产物21.00g和碳酸铯2.40g加入到50mln,n-二甲基甲酰胺中，室温反应20min,然后缓慢加入碘甲烷0.78g，加毕，室温反应2h,将反应液倾入冰水中，立即析出大量淡黄色固体，过滤，烘干后，用乙酸乙酯重结晶得到1.06g产物3，为淡黄色晶体,产率：80.0％；mp:173-174℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.95(d,j＝6.1hz,1h),7.80(dd,j＝0.8,8.7hz,1h),7.51(dd,j＝0.8,1.8hz,1h),6.88(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),6.24(d,j＝6.1hz,1h),4.06(s,3h),3.42(s,3h),2.63(s,3h)。

(3)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4a)的制备

将中间体30.50g和对氨基苯甲酸0.36g分散于30ml异丙醇中，加入2滴浓盐酸，加热至85℃，回流反应4h,冷却至室温，过滤，用异丙醇和乙酸乙酯洗涤滤饼，干燥得到0.53g产物4a，为白色固体，产率：80％；mp:>250℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.16(s,1h),9.80(s,1h),7.91(d,j＝6.3hz,1h),7.79(d,j＝8.7hz,3h),7.74(d,j＝8.6hz,2h),7.49(d,j＝1.7hz,1h),6.91(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),5.94(d,j＝6.2hz,1h),4.08(s,3h),3.51(s,3h),2.64(s,3h).esi-msm/z:387.5[m-h]^-。

(4)甲基4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸酯(5a)的制备

将4a0.50g加入到50ml无水甲醇中，然后在0℃下逐滴加入0.60g二氯亚砜，加毕，保温30min后，撤去冰浴后加热至回流，反应5h后，将溶剂减压蒸出，粗产物用异丙醇重结晶得到0.50g产物5a，为白色固体，产率：96％；mp:198-200℃。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.63(s,1h),7.92(d,j＝6.0hz,1h),7.83(d,j＝8.6hz,2h),7.78(d,j＝8.6hz,1h),7.72(d,j＝8.6hz,2h),7.46(dd,j＝0.8,1.7hz,1h),6.89(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),5.91(d,j＝6.0hz,1h),4.07(s,3h),3.80(s,3h),3.49(s,3h),2.64(s,3h).esi-msm/z:403.5[m+h]⁺。

(5)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-羟基苯甲酰胺(6a)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物5a0.20g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到80.6mg产物6a，为白色固体，产率：40％；mp:210-212℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.99(s,1h),9.49(s,1h),8.85(s,1h),7.89(d,j＝6.1hz,1h),7.84–7.70(m,3h),7.59(d,j＝8.3hz,2h),7.46(s,1h),6.90(d,j＝8.7hz,1h),5.86(d,j＝6.2hz,1h),4.07(s,3h),3.49(s,3h),2.64(s,3h).hrms(ap-esi)m/zcalcdforc21h21n7o2[m+h]⁺404.1757,found404.1739。实施例2:化合物6d-6e的合成，以6d为例

(1)n-(2-氨基苯基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(6d)的制备

将中间体4a0.50g加入到50ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.49g以及三乙胺0.26g,活化30min后，然后加入邻苯二胺0.17g，室温下反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝30:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.40g产物6d,为灰白色固体,产率：65％；mp:138-140℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.54(s,1h),9.49(s,1h),7.91(d,j＝6.0hz,1h),7.87(d,j＝9.0hz,2h),7.83(d,j＝8.8hz,2h),7.80-7.76(m,1h),7.47(d,j＝2.3hz,1h),7.17(dd,j＝1.5,7.9hz,1h),6.96(td,j＝1.6,7.6hz,1h),6.91(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),6.79(dd,j＝1.5,8.0hz,1h),6.60(td,j＝1.5,7.5hz,1h),5.87(d,j＝6.0hz,1h),4.89(s,2h),4.06(s,3h),3.51(s,3h),2.63(s,3h).hrms(ap-esi)m/zcalcdforc21h21n7o2[m+h]⁺479.2230,found479.2257。

实施例3:化合物10a-10b的合成，以10a为例

(1)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺(7a)的制备

将中间体4a1.00g加入到无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.98g以及三乙胺0.52g,活化30min后，然后加入n,o-二甲基盐酸羟胺0.30g和三乙胺0.31g，室温下反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝35:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.78g产物7a,为白色固体,产率为70％；mp:216-218℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.46(s,1h),7.90(d,j＝6.0hz,1h),7.82-7.74(m,3h),7.48(d,j＝8.6hz,2h),7.46(d,j＝1.4hz,1h),6.89(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),5.87(d,j＝6.0hz,1h),4.06(s,3h),3.55(s,3h),3.48(s,3h),3.23(s,3h),2.63(s,3h)。

(2)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲醛(8a)的制备

将化合物7a1.00g溶于50ml无水四氢呋喃中，并在低温反应仪中冷却到-40℃。向其分批缓慢加入四氢锂铝0.26g，维持此温度反应2h,反应结束后，缓慢小心地用冰水淬灭反应至不再有气泡产生。反应液用水稀释，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝40:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.61g产物8a，为白色固体,产率：70％；mp:242-244℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.77(d,j＝4.6hz,2h),7.96-7.93(m,3h),7.78(d,j＝8.7hz,1h),7.69(d,j＝8.4hz,2h),7.47(d,j＝1.6hz,1h),6.90(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),5.92(d,j＝6.0hz,1h),4.07(s,3h),3.50(s,3h),2.64(s,3h)。

(3)乙基(e)-3-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酸酯(9a)的制备

向50ml无水四氢呋喃中加入磷酰基乙酸三乙酯0.32g，冷却至-5-0℃，缓慢加入nah0.16g，加毕，搅拌20min,然后滴加8a0.52g的四氢呋喃溶液，室温反应过夜，反应完毕后，加入50ml10％氯化铵溶液，搅拌30min后静置分层，有机相干燥后，过滤，浓缩得到粗品。残渣用二氯甲烷:甲醇＝40:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.48g产物9a，为白色固体,产率：48％；mp:195-197℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.50(s,1h),7.89(d,j＝6.0hz,1h),7.83(d,j＝8.7hz,2h),7.78(dd,j＝0.8,8.7hz,1h),7.58–7.51(m,3h),7.46(dd,j＝0.8,1.8hz,1h),6.90(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),6.42(d,j＝16.0hz,1h),5.84(d,j＝6.0hz,1h),4.17(q,j＝7.1hz,2h),4.07(s,3h),3.49(s,3h),2.64(s,3h),1.25(t,j＝7.1hz,3h)。(4)(e)-3-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n-羟基丙烯酰胺(10a)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物9a0.50g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.29g产物10a,为白色固体,产率：60％；mp:194-196℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.65(s,1h),9.42(s,1h),8.96(s,1h),7.88(d,j＝5.9hz,1h),7.81(d,j＝8.3hz,2h),7.77(d,j＝8.8hz,1h),7.46(s,1h),7.43-7.32(m,3h),6.95-6.83(m,1h),6.28(d,j＝15.7hz,1h),5.83(d,j＝6.1hz,1h),4.07(s,3h),3.49(s,3h),2.64(s,3h).hrms(ap-esi)m/zcalcdforc23h23n7o2[m+h]⁺430.1991,found430.1988。

实施例4：化合物13a-13i的合成，以13a为例

(1)甲基(4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸酯(11a)的制备

将中间体4a1.00g加入到100ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.98g以及三乙胺0.52g,活化30min后，然后加入甘氨酸甲酯盐酸盐0.39g，室温下反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝30:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.87g产物11a，为白色固体,产率为74％；mp:170-172℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.51(s,1h),8.72(t,j＝5.9hz,1h),7.90(d,j＝6.0hz,1h),7.84(d,j＝8.6hz,2h),7.77(d,j＝8.7hz,1h),7.71(d,j＝8.5hz,2h),7.46(d,j＝1.7hz,1h),6.90(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),5.85(d,j＝6.1hz,1h),4.07(s,3h),3.98(d,j＝5.8hz,2h),3.65(s,3h),3.50(s,3h),2.64(s,3h)。

(2)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(2-(羟胺)-2-氧代乙基)苯甲酰胺(13a)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物11a(0.50g,1.09mmol)溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到产物13a，为白色固体(0.31g,产率为61％)，mp:216-218℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.53(s,1h),9.46(s,1h),8.77(s,1h),8.45(s,1h),7.89(d,j＝5.9hz,1h),7.82(d,j＝8.5hz,2h),7.77(d,j＝8.7hz,1h),7.72(d,j＝8.4hz,2h),7.46(d,j＝1.8hz,1h),6.90(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),5.85(d,j＝6.0hz,1h),4.07(s,3h),3.76(d,j＝5.8hz,2h),3.49(s,3h),2.64(s,3h).hrms(ap-esi)m/zcalcdforc23h24n8o3[m-h]^-459.1971,found459.1921。

实施例5：化合物14a-14g的合成，以14a为例

(1)4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸(12a)的制备

将11a(1.00g,2.18mmol)加入到30ml甲醇中，然后加入5ml3mnaoh溶液，室温下搅拌4h，反应结束后，减压蒸去大部分甲醇，残余物用1mhcl溶液调节ph至5-6。过滤，滤饼用冰水洗涤，干燥后得到产物12a,为白色固体(0.81g,产率：84％)，mp:>250℃,直接投下一步.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.57(s,1h),10.69(s,1h),8.79(s,1h),8.01–7.61(m,6h),7.59(d,j＝1.7hz,1h),6.95(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),6.03(s,1h),4.09(s,3h),3.92(d,j＝5.8hz,2h),3.57(s,3h),2.66(s,3h)。

(2)n-(2-((2-氨基苯基)氨基)-2-氧代乙基)-4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(14a)的制备

将中间体12a(1g,2.24mmol)加入到无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(0.86g,2.69mmol)以及三乙胺(0.45g,4.48mmol),活化30min后，然后加入邻苯二胺(0.29g,2.69mmol),室温下反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝30:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到产物14a，淡黄色固体(0.47g,产率为39％)，mp:178-180℃.¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.51(s,1h),9.23(s,1h),8.62(t,j＝5.8hz,1h),7.90(d,j＝6.1hz,1h),7.83(d,j＝8.7hz,2h),7.79-7.71(m,3h),7.49-7.43(m,1h),7.12(d,j＝7.5hz,1h),6.93-6.89(m,2h),6.71(dd,j＝1.4,7.9hz,1h),6.54(t,j＝7.5hz,1h),5.86(d,j＝6.2hz,1h),4.92(s,2h),4.07(s,3h),4.05-4.00(m,2h),3.50(s,3h),2.64(s,3h).hrms(ap-esi)m/zcalcdforc29h29n9o2[m+h]⁺536.2444,found536.2498。

实施例6：化合物19a-19g的合成，以19f为例

(1)甲基7-(4-硝基苯氧基)庚酸酯(16f)的制备

将对硝基苯酚1.00g、7-溴庚酸甲酯1.93g和碳酸钾2.98g加入到50ml丙酮中，升温至回流，反应过夜，反应结束后，减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯重结晶得到1.62g产物16f，为黄色固体,产率:80％；esi-msm/z:282.3[m+h]⁺。

(2)甲基7-(4-氨基苯氧基)庚酸酯(17f)的制备

将中间体16f1.00g加入到50ml甲醇中，加入10％pd/c0.1g，常压搅拌下通入氢气，于室温反应过夜，过滤，滤渣用甲醇洗涤，合并滤液和洗液，减压蒸除溶剂，得到0.79g产物17f，为浅棕色固体,产率：88％；esi-msm/z:251.4[m+h]⁺，直接投入下一步。

(3)甲基7-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-庚酸酯(18f)的制备

将中间体30.5g，中间体17f0.52g和0.5ml浓盐酸在室温下加入到50ml异丙醇中，升温至回流，反应过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝40:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化，得到0.61g产物18f，为白色固体,产率：70％；esi-msm/z:503.6[m+h]⁺。

(4)7-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯氧基)-n-羟基庚酰胺(19f)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物18f0.30g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.20g产物19f，为白色固体，产率：65％；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.33(s,1h),8.93(s,1h),8.65(d,j＝1.8hz,1h),7.80(d,j＝6.0hz,1h),7.75(dd,j＝0.8,8.7hz,1h),7.60(d,j＝8.9hz,2h),7.42(dd,j＝0.8,1.8hz,1h),6.87(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),6.75(d,j＝8.9hz,2h),5.73(d,j＝5.9hz,1h),4.06(s,3h),3.88(t,j＝6.5hz,2h),3.45(s,3h),2.63(s,3h),2.02-1.90(m,2h),1.67(p,j＝6.8hz,2h),1.51(p,j＝7.4hz,2h),1.39(p,j＝7.2hz,2h),1.34-1.21(m,2h).esi-msm/z:504.7[m+h]⁺。

实施例7：化合物23a-23g的合成，以化合物23f为例

(1)n⁴-(2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)-n⁴-甲基-n²-(4-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(20)的制备

将中间体31.00g、对硝基苯胺0.58g以及0.5ml浓盐酸加入到70ml异丙醇中，升温至回流，反应过夜，反应结束后，冷却至室温，过滤，滤饼用少量异丙醇洗涤，干燥滤饼，得1.08g产物20,为淡黄色固体，产率：80％；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.01(s,1h),8.08(s,2h),7.99(d,j＝7.0hz,1h),7.87(d,j＝8.8hz,1h),7.83(s,2h),7.59(d,j＝1.8hz,1h),6.95(dd,j＝1.8,8.7hz,1h),6.17(s,1h),4.10(s,3h),3.58(s,3h),2.67(s,3h)。

(2)n²-(4-氨基苯基)-n⁴-(2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)-n⁴-甲基嘧啶-2,4-二胺(21)的制备

将中间体201.00g悬浮于70ml甲醇中，加入10％pd/c0.1g，常压搅拌下通入氢气，室温反应过夜，反应结束后，减压蒸除溶剂，残渣用乙酸乙酯重结晶得到0.78g产物21，为浅棕色固体，产率：84％；esi-msm/z:360.4[m+h]⁺。

(3)甲基8-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酯(22f)的制备

将辛二酸单甲酯0.33g加入到50ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下加入o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸0.68g和0.36g三乙胺，加毕，冰浴下活化30min，活化完毕后，加入中间体210.76g，撤去冰浴，室温反应过夜，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，水洗除掉n,n-二甲基甲酰胺,乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，残渣用二氯甲烷：甲醇＝30:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到0.37g产物22f，为白色固体,产率：40％；esi-msm/z:530.5[m+h]⁺。

(4)n¹-(4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)-n⁸-羟基辛二酰胺(23f)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物22f0.20g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.14g产物23f，为白色固体，产率：70％；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.34(s,1h),9.68(s,1h),9.04(s,1h),8.65(s,1h),7.82(d,j＝5.9hz,1h),7.75(d,j＝8.8hz,1h),7.64–7.56(m,2h),7.43(d,j＝1.7hz,1h),7.37(d,j＝8.9hz,2h),6.88(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),5.76(d,j＝6.0hz,1h),4.06(s,3h),3.46(s,3h),2.63(s,3h),2.25(t,j＝7.4hz,2h),1.94(t,j＝7.4hz,2h),1.64-1.40(m,4h),1.34-1.21(m,4h).esi-msm/z:531.6[m+h]⁺。

实施例8：化合物28a-28g的合成，以化合物28e为例

(1)甲基6-((4-硝基苯基)氨基)已酯(25e)的制备

将对氟硝基苯1.00g、6-氨基己酸甲酯盐酸盐1.54g和碳酸钾2.94g加入到50mln,n-二甲基甲酰胺中，升温到50℃，过夜，反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，析出黄色固体，过滤，烘干，残渣用石油醚：乙酸乙酯＝4:1体积比的洗脱剂进行柱层析得到1.32g产物25e，为淡黄色固体,产率:70％；esi-msm/z:267.3[m+h]⁺。

(2)甲基6-((4-氨基苯基)氨基)已酯(26e)的制备

将中间体25e1.00g悬浮于70ml甲醇中，加入10％pd/c0.1g，常压搅拌下通入氢气，室温反应过夜，反应结束后，减压蒸除溶剂，残渣用乙酸乙酯重结晶得到0.71g产物26e，为棕色固体，产率：80％；esi-msm/z:237.4[m+h]⁺。

(3)甲基6-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-己酯(27e)的制备

将中间体30.5g，中间体26e0.49g和0.5ml浓盐酸在室温下加入到50ml异丙醇中，升温至回流，反应过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，残渣用二氯甲烷:甲醇＝40:1体积比的洗脱剂进行柱层析纯化得到产物27e，为0.55g淡黄色固体,产率：65％；esi-msm/z:488.6[m+h]⁺。

(4)6-((4-((4-((2,3-二甲基-2h-吲唑-6-基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-n-羟基已酰胺(28e)的制备

koh28.0g和盐酸羟胺23.53g分别溶于70ml和120ml无水甲醇中，得到溶液a和溶液b。冰浴下，将溶液a逐滴加入到溶液b中，搅拌2h后，滤除沉淀，得到的滤液即为羟胺钾的甲醇溶液。化合物27e0.20g溶于30ml羟胺钾溶液中，室温搅拌2h后，减压浓缩除去大部分溶剂，剩余残渣用1mhcl调节ph至5-6，析出白色固体，过滤，干燥滤饼，得到0.13g产物28e，为淡红色固体，产率：66％。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.36(s,1h),8.78(s,1h),8.68(s,1h),7.76-7.73(m,2h),7.43(d,j＝1.6hz,1h),7.37(d,j＝8.4hz,2h),6.87(dd,j＝1.8,8.8hz,1h),6.45(d,j＝8.4hz,2h),5.68(d,j＝6.0hz,1h),4.06(s,3h),3.49(s,1h),3.44(s,3h),2.93(t,j＝7.0hz,2h),1.96(t,j＝7.3hz,2h),1.61-1.10(m,6h).esi-msm/z:489.3[m+h]⁺。

实施例9：化合物的体外hdac抑制活性测试实验

我们首先使用了方便易得的hela核提取物(主要含hdac1和hdac2)作为hdac酶源，对目标化合物的体外hdacs抑制活性进行了测定。

表1化合物的体外hdac抑制活性

实验结论：大部分化合物对hdacs均有一定的抑制作用，异羟肟酸化合物中13e和13f的活性最好，明显优于阳性对照药saha。邻苯二胺类化合物中6d和14e的活性最好，其活性与阳性对照药ms275相当。

实施例10：代表性化合物的体外hdac亚型选择性实验

表2代表性化合物的体外hdac亚型选择性

^a未测定

实验结论：异羟肟酸类代表性化合物10a和13f同阳性对照药saha类似，均为广谱的hdac抑制剂，但化合物13f对hdac6的抑制活性优于saha。邻苯二胺类代表性化合物6d和14g与阳性对照药ms275类似，均为classi选择性hdac抑制剂。

实施例11：化合物的体外vegfr-2抑制活性测定实验

首先测定了所有目标化合物在0.2μm浓度下对vegfr-2的百分抑制率，进而进一步测定了4个代表性化合物(10a,13f,6d,14g)的体外抗vegfr-2的ic50值。

表3化合物的体外vegfr-2抑制活性

^a未测定

实验结论：大部分化合物在200nm均表现出了较强的vegfr-2抑制活性(抑制率>90％)，代表性化合物10a,13f,6d以及14g均表现出了阳性对照药pazapanib相当的体外vegfr-2抑制活性。

实施例12：代表性化合物的免疫印迹实验

为了进一步研究化合物在细胞内对hdac的抑制作用，我们进行了westernblot实验，测定了代表性化合物6d和13f对acetylatedh4(classihdacsubstrate)和acetylatedtubulin(hdac6substrate)表达水平的影响。其中saha,tuba和ms275是阳性对照药，β-actin是内标。实验结果参见图1。

实验结论：化合物6d在1μm能显著提高乙酰化组蛋白h4(ac-hh4)的水平，其活性与ms275相当，但化合物6d不能升高乙酰化tubulin(ac-tubulin)的水平，表明化合物6d是一个classihdac选择性抑制剂。化合物13f在100nm能显著提高乙酰化tubulin(ac-tubulin)的水平，其活性优于tuba和saha；13f同时也能提高乙酰化组蛋白h4(ac-hh4)的水平，表明化合物13f为广谱hdac抑制剂。

实施例13：代表性化合物的体外抗肿瘤细胞增殖活性实验

我们采用了比较常用的mtt方法测定了受试化合物的体外抗肿瘤细胞增殖活性。

表4代表性化合物的体外抗肿瘤细胞增殖活性

^a未测定

实验结论：大部分的化合物对多种血液瘤和实体瘤细胞系均表现出了一定的抗增殖效果，其中异羟肟酸类化合物中化合物10a和13f活性最优，表现出了与阳性对照药saha相当的抗肿瘤细胞增殖活性。邻苯二胺类化合物中化合物6d活性最优，表现出了与阳性对照药ms275相当的抗肿瘤细胞增殖活性。

实施例14代表性化合物抑制人脐静脉内皮细胞成血管腔实验

我们选择了代表性化合物6d和13f，测定了化合物在1μm浓度下对huvecs管腔形成的影响，并选择pazopanib作为阳性对照药。实验结果参见图2。

实验结论：代表性化合物6d和13f在1μm浓度下表现出了与阳性对照药pazopanib相当的体外抗huvecs成血管腔活性。

实施例15代表性化合物的大鼠胸主动脉成血管抑制活性实验

我们进一步进行了大鼠胸主动脉成血管实验进一步评估化合物的体外抗血管生成活性，测定了代表性化合物6d和13f在5μm浓度下对大鼠胸主动脉成血管的影响，阳性对照药为pazopanib。实验结果参见图3。

实验结论：化合物6d、13f以及pazopanib在5μm浓度下均几乎能完全抑制动脉环微血管的形成。

实施例16代表性化合物的体内抗肿瘤活性实验

基于化合物6d和13f在ht-29细胞系中优良的体外抗肿瘤细胞增殖活性，我们建立了裸鼠皮下ht-29荷瘤模型，使用saha和pazopanib作为阳性对照。化合物6d和13f以50mg/kg/day和100mg/kg/day两个剂量口服给药，saha以100mg/kg/day以及pazopanib以50mg/kg/day口服给药。给药21天后处死动物结束实验，计算受试化合物和阳性对照药的肿瘤生长抑制率(tgi)，从瘤子的体积和重量两个方面评估化合物的抑瘤活性。实验结果参见、图4、图5。

实验结论：化合物6d和13f均显示了体内抗癌活性，其中6d活性较好。在100mg/kg/day剂量时，6d活性要优于上市hdac抑制剂类药物saha，在50mg/kg/day剂量时，6d活性与上市vegfr抑制剂类药物帕唑帕尼相当，具有非常高的后续研究开发价值。