预防和治疗糖尿病的多肽、其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种预防和治疗糖尿病的多肽类化合物、其制备方法和应用。
背景技术：
：糖尿病(diabetes)是一种糖、蛋白质和脂肪代谢障碍性疾病，在全球发病率都很高，已成为继心血管和肿瘤并列的三大“健康杀手”。我国患病率已达10％，患病总人数已超过了1亿，居世界之首。由糖尿病引发的并发症如心脑血管疾病、肾功能衰竭、两眼失明和糖尿病足严重威胁人的生命和生活质量。迄今，还没有真正可治疗糖尿病的药物面世。1980年，世界卫生组织(worldhealthorganization，who)将糖尿病分为：胰岛素依赖性糖尿病(insuin-dependentdiabetesmelitus，iddm，又称1型，t1d)，非胰岛素依赖性糖尿病(noninsuin-dependentdiabetesmelitus，niddm，又称2型,t2d)及其他类型糖尿病，如妊娠期糖尿病，但孕期后有些会自行消失，也有不能消失的病例，孕期糖尿病对胎儿的影响还在研究中。1型糖尿病是一种自身性免疫疾病，患者主要是青少年人群，常起病于幼年，故又称为少年发病型，由内源性胰岛素不能产生或分泌不足引起，需要外源注射胰岛素治疗。2型患者多起病于35岁以后，现已有提前倾向，称成年发病型。患者的高血糖症主要由于机体产生和分泌胰岛素不足、胰岛素信号通路障碍、胰岛素刺激细胞摄取葡萄糖能力下降即胰岛素抵抗等原因所至。目前全球糖尿病患者约4.3亿，预测到2025年全世界的患者将达5.5亿，其中90％以上为2型糖尿病，其潜在的最大增长人群在亚洲，约占总增长的60％以上，由于生活水平提高和生存方式改善，发病率在我国呈“爆发式”增长。不仅如此，2型糖尿病的易感人群也逐渐由老年人扩大至青壮年甚至小孩。由于糖尿病病因复杂，发病机制还不完全清楚，给治疗带来了极大的困难，仅管治疗糖尿病的中西药种类很多，但能起到真正预防和治疗作用的药物尚未面世。目前，对1型糖尿病的治疗主要是注射外源胰岛素，但存在如下弊端：需要注射用药；对个体剂量和用药时间不易精准掌握和控制，常造成低血糖症；长期使用产生胰岛素抗体导致药物失效等副作用。2型糖尿病的治疗中，由于机体对胰岛素抵抗，常有注射胰岛素而不起作用的可能，而口服化学类降糖药物如磺尿类、双胍类、a—糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类等，它们都具多种不同程度的副作用，如皮肤过敏、胃肠道不适反应、肝肾功能损伤和低血糖风险等。近些年面世的glp-1类多肽药物及其保护剂和激动剂，也是注射用药，都有不同程度的副作用，如恶心呕吐和胃肠不适等。技术实现要素：针对现有产品和技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一类预防和治疗糖尿病的多肽、其制备方法和应用，该多肽为从鹰嘴豆中提取出的4种37个氨基酸多肽化合物，其目的在于提供一种无毒副作用、不但能降低高血糖，还有一定治疗作用、符合标准的治疗糖尿病原料药和预防糖尿病的功能食品的基础原料，由此解决现有技术治疗糖尿病的药物具有不同程度的毒副作用的技术问题。为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种多肽，所述多肽分子内含有6个半胱氨酸，分别位于位点3、位点7、位点15、位点20、位点22和位点32，其中位点3与位点20、位点7与位点22和位点15与位点32形成3对二硫桥键，这3对二硫桥键形成半胱氨酸结的结构域。优选地，所述的多肽，具有以下序列1至4中任一项所示的氨基酸序列：序列1：ascngvcspfemppcgssacrcipvglvvgncrhpsg；序列2：iscngvcspfdippcgtplcrcipaglfvgncrhpyg；序列3：vscngvcspfdippcgtplcrcipyglfvgkcrhpyg；序列4：vscngvcspfemppcgssacrcipyglvvgkcrhpsg。优选地，所述多肽提取自鹰嘴豆。按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的多肽的制备方法，包括如下步骤：(1)将鹰嘴豆浸泡萌发，捣碎后用0.1～0.2mol/l的乙酸在10～20℃提取10～12小时，渣浆分离，取分离液；(2)将步骤(1)获得的分离液用陶瓷膜过滤，滤液再用有机膜过滤，保留分子量为5000道尔顿及以下的积分后，冷冻干燥；(3)采用反相液相色谱将步骤(2)冷冻干燥后的产品分离出如权利要求1～3任意一项所述的多肽。按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的多肽在制备用于预防和/或治疗糖尿病的药物和/或功能食品中的应用。按照本发明的另一个方面，提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病的组合物，其活性成分为如所述序列1、序列2、序列3和序列4的4种多肽中的至少一种。优选地，所述组合物为药学上可接受的剂型。优选地，所述组合物还包括辅剂，所述辅剂包括乳酸、柠檬酸、膳食纤维素和水解大豆蛋白中的一种或多种。优选地，所述组合物按重量份计，包括3～10份的所述的活性成分，3～8份的乳酸以及2～8份的柠檬酸。优选地，所述组合物按重量份计，包括3～10份的所述的活性成分，20～55份的水解大豆蛋白，3～8份的乳酸，2～8份的柠檬酸和20～57份的膳食纤维素。总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。(1)本发明提供的从鹰嘴豆中提取出的4种37个氨基酸多肽，可用于制备治疗糖尿病的原料药或预防糖尿病或脂代谢紊乱的功能食品，其从鹰嘴豆中提取制备的成本比生产同量胰岛素和其它多肽糖尿病药物低；提取工艺简单、经济和规模化大生产。(2)本发明从鹰嘴豆提取的4种37个氨基酸多肽与已公开的大豆胰安肽相比，由于第31位位点突变，使得其更易与胰岛素受体结合，更能发挥出肠促胰岛素glp-1激动剂的生物学功能；也可能更易进入细胞核而促进葡萄糖转运蛋白的基因表达，从而发挥出更好的降糖效果和恢复胰岛功能的效果；(3)本发明提供的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽作为原料制造治疗糖尿病的药物或预防糖尿病的功能食品时，不但可以对2型糖尿病起到对症治疗的降糖效果，对1型糖尿病也有很好的降糖效果，而且对两种糖尿病还有真正意义的治疗作用，该肽组能使损害的胰岛组织得到修复，在细胞数量上(mass)接近或达到正常水平；使其合成和分泌胰岛素的功能接近或达到正常水平；能提高胰岛素受体的敏感性，降低胰岛素抵抗，改善机体糖耐量。所以，有实质性治疗作用。(4)本发明提供的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽作为原料制造的治疗糖尿病的药物或预防糖尿病的功能食品，这4种37个氨基酸多肽易溶解于水等极性溶剂，对热稳定，耐消化道蛋白酶水解，可发展成口服剂型，用药比胰岛素和其它糖尿病肽类药物方便；(5)本发明提供的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽，因为要依赖高血糖浓度而发挥降高血糖功能，在血糖低于生理水平时不发挥降糖，有肠促胰岛素(incretin)的特点,故使用时，无低血糖风险产生；(6)本发明提供的4种37个氨基酸多肽来源于食用性植物鹰嘴豆，制成预防或治疗糖尿病药物时无毒副作用，且无任何其他化学类降糖药物(磺酰脲类、双胍类药物)的毒副作用，医患双方易接收和采纳；(7)鹰嘴豆在我国的主产区是新疆、青海和甘肃这些贫困地区。如用这种资源开发成药，无疑是粮食的深加工和精加工，将大幅度提高农产品附加值，有利于地区脱贫；同时，鹰嘴豆国际价格低于大豆，用鹰嘴豆作为原料制造治疗糖尿病的药物或预防糖尿病的功能食品，成本低，附加值大；(8)本发明所采用的生产工艺安全，使用的辅料无毒无害，也不产生有毒有害的副产品，所剩残渣，可做家禽家畜饲料。以完全环保技术，生产完全环保产品。附图说明图1是本发明实施例1鹰嘴豆多肽提取分离的hplc图谱。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本发明提出鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽制备及其在治疗预防糖尿病药物或功能食品中的应用，其目的是提供一种无毒副作用、不但能降低高血糖，还有一定治疗作用、符合标准的治疗糖尿病原料药和预防糖尿病的功能食品的基础原料。本发明提出的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽，用于治疗和预防糖尿病，包括以下4种多肽之中任意一种或一种以上的混合物，其氨基酸序列和分子量表达为：序列1：ascngvcspfemppcgssacrcipvglvvgncrhpsg；37肽；分子量为3743.40；序列2：iscngvcspfdippcgtplcrcipaglfvgncrhpyg；37肽，分子量为3880.70；序列3：vscngvcspfdippcgtplcrcipyglfvgkcrhpyg；37肽；分子量为3944.70；序列4：vscngvcspfemppcgssacrcipyglvvgkcrhpsg；37肽；分子量为3786.50。其中，a-丙氨酸、c-半胱氨酸、d_天冬氨酸、e-谷氨酸、f-苯丙氨酸、g-甘氨酸、h-组氨酸、i-异亮氨酸、k-赖氨酸、l-亮氨酸、m-甲硫氨酸、n-天冬酰胺、p-脯氨酸、r-精氨酸、s-丝氨酸、t-苏氨酸、v-缬氨酸、y-酪氨酸。这4种肽的一级结构：这组肽均为37个氨基酸组成的多肽(37肽)，相互间氨基酸的位点一致性达到70％。其中第31位的氨基酸，和已报道的大豆种子的4个肽比较，发生位点突变：y＝n,k＝n,n＝k及n＝k。其它36个位点氨基酸和大豆肽完全一致，说明种间也是高度保守的。分子内半胱氨酸排位及其二硫键的形成也高度保守，多肽分子内含有6个半胱氨酸，分别位于位点3、位点7、位点15、位点20、位点22和位点32，其中位点3与位点20(3-20)、位点7与位点22(7-22)和位点15与位点32(15-30)形成3对二硫桥键，这3对二硫桥键形成半胱氨酸结的结构域(cysteinknotmotif)，这种特殊结构，可使这些肽能抵抗消化道蛋白酶水解。制备出的这些肽，外观为乳白色或者淡黄色粉末，易溶解于水等极性溶剂，对热稳定，耐消化道蛋白酶水解，可供口服途径使用。而且，它们和胰岛素受体结合，使下游信号链如促使酪氨酸磷酸化，而降低胰岛素抵抗，也能发挥出肠促胰岛素glp-1激动剂的生物学功能；也可能更易进入细胞核而促进葡萄糖转运蛋白的基因表达，从而发挥出更好的降糖效果和恢复胰岛功能的效果。本发明的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽制备及其在治疗糖尿病药物或功能食品中的应用，属于治疗、预防糖尿病的原料药和功能食品，其目的是提供一种无毒副作用而品效性能好、符合标准的治疗糖尿病原料药或预防糖尿病的功能食品。本发明的鹰嘴豆4种37个氨基酸的多肽用于治疗糖尿病及功能食品用于预防糖尿病，包括4种之中任意一种或一种以上的混合物。每一种肽均为37个氨基酸组成，分子内6个半胱氨酸及其形成的3对二硫桥键高度保守，这三对二硫键形成半胱氨酸结的结构域。鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽产品外观为乳白色或者淡黄色粉末，可溶解于水等极性溶剂，对热稳定，耐人体消化道蛋白酶水解。所述产品中一种或任意一种以上的混合物，作为原料制造治疗糖尿病的药物或预防糖尿病功能食品。本发明制备成本比胰岛素和其他肽类药品低；不但对症治表、还对因治本，因人而异地能不同程度恢复病态胰腺的质量和功能；改善糖耐量，降低或消除机体的胰岛素抵抗，可发展成口服剂型用药，比胰岛素和其它肽类药物用药方便；因这4种37个氨基酸多肽要依赖高血糖浓度而发挥降高血糖功能，有肠促胰岛素(incretin)的特点,故使用时，无低血糖风险产生。它们来源于食用植物鹰嘴豆，无毒副作用。从鹰嘴豆中提取分离出上述4个多肽的制备方法，包括如下步骤：(1)将鹰嘴豆浸泡萌发，捣碎后用0.1～0.2m的乙酸在10～20℃提取10～12小时，渣浆分离，取分离液；(2)将步骤(1)获得的分离液用陶瓷膜过滤，滤液再用有机膜过滤，保留分子量为5000道尔顿以下的积分后，冷冻干燥；(3)采用反相液相色谱(hplc)将步骤(2)冷冻干燥后的产品分离出上述多肽或者其混合物。本发明提供的鹰嘴豆4种氨基酸多肽的制备方法适合工业化生产，操作条件易控制，产品数量和质量稳定。将上述从鹰嘴豆中提取分离出的4个多肽序列中的序列1对健康、1型、2型糖尿病鼠进行生理和药理实验，显示可以有效地降低1型、2型糖尿病鼠高血糖，并可消除糖尿病症状，具有明显的作用。对使用一年后[2.5微克/克体重/天]的小鼠未观测到任何致畸，致癌致病现象和其它副作用。使用鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽混合物进行同样剂量试验也得到了一致的结果。本发明提供的鹰嘴豆4种氨基酸多肽37肽可用于制备预防和/或治疗糖尿病的药物和/或功能食品，以这4种多肽中至少一种为活性成分，制成药学上可接受的剂型。根据糖尿病患者慎用和节制食用葡萄糖的病理特征，将鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽中一种或任意一种以上的混合物，和乳酸、柠檬酸、水解大豆蛋白、膳食纤维素等辅剂中的一种或多种科学配伍，组成预防和治疗糖尿病的组合物，可制成固体和液体剂型的药物、功能食品或饮用品。制成预防和治疗糖尿病的液体混合药剂，可以包括3～10份的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽、3～8份乳酸以及2～8份的柠檬酸。制成预防和治疗糖尿病的功能食品成分配伍，可以包括其中乳酸的作用是促进糖的酵解和有氧氧化，柠檬酸加入至该组合物中的作用是有利于三羧酸循环进行，水解大豆蛋白可以提高营养素，膳食纤维素有助于益生菌的作用，使糖被充分吸收利用和进入代谢链，而不堆积。以下为实施例：实施例1按照如下方法提取本发明鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽：取1千克鹰嘴豆种子，浸泡12小时后萌发，捣碎后用0.1m乙酸溶液2l搅拌，10～20℃提取10小时，渣浆分离取清液。清液用陶瓷膜过滤，滤液再用有机膜过滤，保留分子量为5000道尔顿(da)及小于5000道尔顿的积分后，冷冻干燥。最后通过制备型的反相液相色谱(hplc)分离获得约10克产品。收集hplc中各分离峰的分离液(见图1)分别进行药效学试验，结果发现时间区间30.264至35.360分钟出现的几个峰具有降糖效果，然后分别将这几种物质进行蛋白测序，测序结果为：多肽1：ascngvcspfemppcgssacrcipvglvvgncrhpsg；多肽2：iscngvcspfdippcgtplcrcipaglfvgncrhpyg；多肽3：vscngvcspfdippcgtplcrcipyglfvgkcrhpyg；多肽4：vscngvcspfemppcgssacrcipyglvvgkcrhpsg。其中多肽1对应图1中31.738min对应位置的峰，多肽2对应图1中32.227min对应位置的峰，多肽2对应图1中33.746min对应位置的峰，多肽2对应图1中34.320min对应位置的峰。如上，4个多肽即为鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽，均为37肽，结构高度保守，具有近似的物理化学性质，但利用其疏水性的不同，可以在反相液相色谱(hplc)得到分离出肽序列1、序列2、序列3和序列4,如连续收集则为鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽混合物产品。将上述从鹰嘴豆中提取分离出的4个多肽序列中的序列1对健康、1型、2型糖尿病鼠进行生理和药理实验，药理、药效试验对象、试验条件以及试验结果如表1、表2和表3，其中：建立1型、2型糖尿病小鼠动物模型的方法：100mg/kg一次性大剂量注射链脲佐菌素(stz)，并以高糖高脂饲料喂养，建立1型、2型糖尿病小鼠动物模型。表1:1型鼠(nod鼠)用药情况(来自于北京中国医学科学院试验动物中心)剂量：2.5微克/克体重(血糖浓度单位：mmol/l)鼠号码12345678910开始血糖浓度14.517.99.812.311.815.713.612.58.714.6三周后血糖浓度6.57.36.78.16,27.27.66.87.78.2表2:2型鼠(kk鼠)用药情况(来自于北京中国医学科学院试验动物中心)剂量：2.5微克/克体重(血糖浓度单位：mmol/l)鼠号码12345678910开始血糖浓度18.621.517.516.89.918.719.623.521.115.7三周后血糖浓度7.86.96.77.26.37.98.26.79.17.9表3:野生型健康昆明小白鼠用药情况剂量：2.5微克/克体重(血糖浓度单位：mmol/l)鼠号码12345678910开始血糖浓度7.17.26.56.86.56.77.47.17.87.7三周后血糖浓度7.26.57.16.46.56.86.97.27.57.2本发明以来源丰富的食用植物资源鹰嘴豆为原料，大规模提取制备出鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽。这4种肽能微弱降低野生型健康昆明小鼠血糖、显著降低1型糖尿病nod鼠和2型糖尿病kk鼠餐后高血糖。通过细胞生物学实验发现鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽能使均一beta细胞群生长旺盛，延长寿命。通过体外生物化学实验证明鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽能抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解，这是由于鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽分子内的的半胱氨酸结(cysteineknotmotif)结构域和或许两个碱性氨基酸存在于内核的缘故。通过动物食用后长达一年的观察，动物均无药物不良反应，未见任何药物副作用。在现阶段实验结果显示鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽是符合标准的治疗糖尿病的新型原料药。实施例2本实施例提供了一种采用实施例1制备的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽与柠檬酸、乳酸按照一定的配比配制的用于治疗糖尿病的组合物，为液体剂型，称之为混合药剂。按重量百分比，该混合药剂中鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽占5％，柠檬酸占5％，乳酸占6％，1型糖尿病小鼠和2型糖尿病小鼠各40只，分别以生理盐水和正常胰岛素作对照。检测该混合药剂对1型糖尿病小鼠和2型糖尿病小鼠的给药效果，实验结果见表4和表5。表中数字表示血糖浓度，给药的方式为：胰岛素皮下注射，混合药剂和生理盐水灌胃。生理盐水是100μl/只鼠，胰岛素为2单位/只鼠。混合药剂中鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽、柠檬酸、乳酸的用量分别为2.5μg/g体重、2.5μg/g体重、3.0μg/g体重。表4对2型糖尿病小鼠给药效果表5对1型糖尿病小鼠给药效果表4、表5是用鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽加柠檬酸、乳酸的混合药剂(简称混合药剂)对1型糖尿病小鼠、2型糖尿病小鼠给药效果的统计结果。上表中数字说明混合药剂对1型糖尿病、2型糖尿病小鼠都有明显的降糖作用。实施例3按重量百分比：鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽5％，乳酸3％，柠檬酸2％，溶于生理盐水，制成液态剂型供饮用。结果发现该液态剂型组合物对1型糖尿病、2型糖尿病小鼠都有明显的降糖作用。实施例4本实施例提供了一种采用实施例1制备的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽与水解大豆蛋白、柠檬酸、乳酸和膳食纤维素按照一定的配比配制的用于治疗糖尿病的组合物，为固体剂型，具体按照重量百分比：鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽3％、乳酸6％、柠檬酸7％、水解大豆蛋白粉27％、膳食纤维素57％混合压片。结果发现该固态剂型组合物对1型糖尿病、2型糖尿病小鼠都有明显的降糖作用。实施例5本实施例提供了一种采用实施例1制备的鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽与水解大豆蛋白、柠檬酸、乳酸和膳食纤维素按照一定的配比配制的用于治疗糖尿病的组合物，具体按照重量百分比：鹰嘴豆4种37个氨基酸多肽10％、乳酸4％、柠檬酸4％、水解大豆蛋白粉40％、膳食纤维素42％的混合冲剂。结果发现该混合冲剂组合物对1型糖尿病、2型糖尿病小鼠都有明显的降糖作用。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<120>预防和治疗糖尿病的多肽、其制备方法和应用<141>2017-08-07<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>37<212>prt<213>chickpea<400>1alasercysasnglyvalcysserpropheglumetproprocysgly151015serseralacysargcysileprovalglyleuvalvalglyasncys202530arghisprosergly35<210>2<211>37<212>prt<213>chickpea<400>2ilesercysasnglyvalcysserpropheaspileproprocysgly151015thrproleucysargcysileproalaglyleuphevalglyasncys202530arghisprotyrgly35<210>3<211>37<212>prt<213>chickpea<400>3valsercysasnglyvalcysserpropheaspileproprocysgly151015thrproleucysargcysileprotyrglyleuphevalglylyscys202530arghisprotyrgly35<210>4<211>37<212>prt<213>chickpea<400>4valsercysasnglyvalcysserpropheglumetproprocysgly151015serseralacysargcysileprotyrglyleuvalvalglylyscys202530arghisprosergly35当前第1页12