应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异miRNAs表达谱的方法与流程

本发明涉及一种分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异mirnas表达谱的方法，具体涉及一种应用二代测序技术分析两种干细胞中差异mirnas表达谱的方法。

背景技术：

牙齿借助牙根与牙槽骨紧密结合，牙根的稳固在牙列的稳定中非常重要。临床中常见的例如牙周炎、牙隐裂、牙外伤等疾病都会导致牙根的缺失、折断、发育异常等，最终都会造成牙的缺失。牙缺失后，生物学牙根的研究具有重要的意义。

目前，生物学牙根的研究在体外主要是通过组织工程学的方法来构建。其中通过不同的牙源性干细胞组合在支架材料中构建牙齿是目前常用的方法之一。生物学牙根在临床上也有实际的应用，目前最常用的方法是牙髓血运重建术。牙髓血运重建术用来治疗根尖未发育完成的年轻恒牙牙髓坏死和根尖周炎，它不仅可以继续延续牙根的发育，而且增加了根部牙本质的厚度，避免了根尖诱导成形术和根尖屏障术后由于根管壁薄弱所造成的折裂风险。这些都表明，根尖部保留有健康的干细胞对于牙髓再生、牙体组织再生和牙根的继续发育发挥了重要的作用。

人牙源性间充质干细胞，包括牙髓干细胞、根尖牙乳头干细胞和牙囊干细胞等。其中，牙髓干细胞(denalpulpstemcells,dpscs)和根尖牙乳头干细胞(stemcellfromtheapicalpapilla,scap)与牙髓、牙根形成密切相关。

多年来，牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞一直都是众多学者研究的热点。在组织工程中，牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞都是理想的细胞来源，根尖牙乳头干细胞来源于生长发育期的根尖孔未闭合的年轻恒牙，可能是更早期、更优越的牙源性干细胞资源，用于牙髓、牙本质的再生和生物学牙根的再生中具有优势，是组织构建的首选，更是成为近年来牙髓血运重建治疗研究领域中的焦点之一。

牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞的干性能力，是牙髓组织工程中最重要的，其干性维持及分化能力涉及多个蛋白编码基因及多条信号通路。如果单纯地控制一个分子乃至一条通路，将无法高效地维持干细胞干性和调控分化进程。其中，关于牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞的生物学作用，来源以及分离方法等方面的研究，都取得了不小的进展，这将为重新认识干细胞生物学特性提供新的参考依据。

随着近年来mirnas数量的爆炸式增长，据悉在2004年中，mirnas的数量总就有719个，到了2010年9月，mirbase数据库内的mirnas序列信息更是已经超过一万五千条。故此，本发明应用二代测序技术分析干细胞的mirnas表达谱，对于检测牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞中差异mirnas表达谱的变化，具有深远的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异mirnas表达谱的方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

一种应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异mirnas表达谱的方法，其特征在于：包括如下操作步骤：

(1)培养牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞：选取新鲜拔除的第三磨牙，在无菌条件下取出牙髓、根尖牙乳头组织，将组织剪碎，并采用i型胶原酶及dispase酶于37℃下消化30min，之后离心重悬，用细胞筛过滤重悬液，获得单细胞悬液；

(2)牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞的分选：对步骤(1)中获得的单细胞悬液，利用胰酶消化收集其中对数生长期的细胞，并依据抗体说明书采用鼠抗人stro-1-pe标记细胞，经免疫磁珠分选收集stro-1阳性细胞，所收集到的stro-1阳性细胞即为所需的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞；

(3)二代测序技术检测细胞mirnas表达谱：分别取步骤(2)经分选后的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞，加入trizol混合后抽提总rna；使用truseqsmallrnasampleprepkit，按照厂家的标准流程，主要步骤如下：测定rna的浓度、琼脂糖凝胶电泳检查rna的完整性、以及测定rna的rin值，完成rna样本质检后，使用接头对切胶回收的20-40nt的mirnas的3’与5’端进行连接，逆转录合成cdna第一链，随后进行pcr扩增，pcr扩增产物经page电泳质检、切胶纯化、浓度测定以及质检后，将浓度统一调整为2nm，mirnas文库构建即告完成；待测mirnas文库在cbot上完成簇类生长，然后将流通池转移到基因测序系统上，按照标准流程进行二代测序及数据分析。

所述接头序列如下：

rna5’adapter(ra5),part#15013205，5’guucagaguucuacaguccgacgauc；rna3’adapter(ra3),part#15013207，5’tggaattctcgggtgccaagg)。

步骤(3)所述pcr扩增的引物序列如下：rnartprimer(rtp),part#15013981，5’gccttggcacccgagaattcca；rnapcrprimer(rp1),part#15013198，5’

aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccga)。

本发明具有如下优点：

通过利用高通量的二代测序技术分析干细胞的mirnas表达谱，对于检测牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞中的差异mirnas表达谱，了解干细胞特性，具有深远的意义。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1是本发明实施例二中的差异表达mirnas谱火山图。

图2是本发明实施例一中牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞干性鉴定结果图；其中a：牙髓干细胞(dpscs)茜素红染色、b：根尖牙乳头干细胞(scap)茜素红染色、c：牙髓干细胞(dpscs)油红o染色、d：根尖牙乳头干细胞(scap)油红o染色。

具体实施方式

本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于说明本发明的实施方法。

实施例一

应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异mirnas表达谱的方法，步骤如下：

(1)培养牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞：选取临床17-20岁健康的第三磨牙，在无菌条件下取出牙髓或者根尖牙乳头组织，将组织剪碎，并采用i型胶原酶及dispase酶于37℃下消化30min，之后离心重悬，用细胞筛过滤重悬液，获得单细胞悬液；

(2)牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞的分选：对步骤(1)中获得的单细胞悬液，利用胰酶消化收集其中对数生长期的细胞，并依据抗体说明书采用stro-1-pe标记细胞，经免疫磁珠分选收集stro-1阳性细胞，所收集到的stro-1阳性细胞即为所需的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞；

(3)成骨细胞定向诱导分化和成骨细胞的鉴定：将步骤(2)经分选后的干细胞分别接种于6孔板或者24孔板中，24h后改用诱导液培养，诱导液中的矿化液包括：10％的胎牛血清、10-6mol/l地塞米松、50mg/lα-抗坏血酸以及10mmol/lβ-甘油磷酸钠的α-mem；取诱导后的细胞，进行茜素红染色成骨特性检测；

(4)成脂细胞定向诱导分化和成脂细胞的鉴定：将步骤(2)经分选后的干细胞分别接种于6孔板或者24孔板中，24h后改用诱导液培养，诱导液中的矿化液包括：10％的胎牛血清、1μmol/l地塞米松、10μmol/l胰岛素、200μmol/l吲哚美辛、0.5mmol/libmx、1％双抗的α-mem；取诱导后的细胞，进行油红o染色；

(5)二代测序技术检测细胞mirnas表达谱：经步骤(3)茜素红染色显示橙红色矿化结节，步骤(4)油红o染色显示油脂滴形成，证明步骤(2)经分选后的干细胞确为二代测序实验所需要的干细胞；分别取步骤(2)经分选后的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞，加入trizol混合后抽提总rna。使用truseqsmallrnasampleprepkit，按照厂家的标准流程，主要步骤如下：使用nanodrop测定rna的浓度、琼脂糖凝胶电泳检查rna的完整性、以及agilent2100bioanalyzer测定rna的rin值。完成rna样本质检后，使用特异性接头(接头序列如下：rna5’adapter(ra5),part#15013205，5’guucagaguucuacaguccgacgauc；rna3’adapter(ra3),part#15013207，5’tggaattctcgggtgccaagg)对切胶回收的20-40nt的mirnas的3’与5’端进行连接，逆转录合成cdna第一链。随后用一对引物(pcr引物序列如下：rnartprimer(rtp),part#15013981，5’gccttggcacccgagaattcca；rnapcrprimer(rp1),part#15013198，5’

aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccga)将合成的一链产物进行15个循环的pcr扩增，其中一个引物带有特异性的barcode序列，用以区分样本的来源。pcr扩增产物经page电泳质检、切胶纯化、qubit浓度测定以及2100质检后，将浓度统一调整为2nm，mirnas文库构建即告完成。待测mirnas文库在cbot上完成簇类生长，然后将流通池转移到hiseq2000型测序系统上，按照标准流程进行二代测序及数据分析。实验重复2次。

实验结果

在显微镜下观察干细胞，牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞呈长梭形的类似成纤维细胞，传代培养后大约4h开始贴壁。在进入指数生长期之后，细胞的增殖速度很快，4到6d就可以进入平台期，细胞的生长速度平稳，并且持续呈单层贴壁生长。在干细胞成骨诱导和成脂诱导21d之后进行化学染色，茜素红染色显示橙红色矿化结节，油红o染色显示油脂滴形成。如图2中所示。这证明分选后的细胞确为后续二代测序实验中所需要的干细胞。

应用高通量的二代测序技术检测两种干细胞mirnas表达谱后，应用rpackagedeseq2(version1.6.1)软件，在每组数据中选取变化倍数值＞1.5，p＜0.05的mirnas。与dpscs相比，scap中显著下调的mirnas有7个，分别是hsa-mir-224-5p、hsa-mir-1247-5p、hsa-mir-3065-3p、hsa-mir-452-5p、hsa-mir-767-5p、hsa-mir-4284、hsa-mir-146a-5p，无显著上调的mirnas。其差异表达图如图1中所示。

然后，经t检验统计分析，对于细胞中表达差异有统计学意义的7个mirnas，应用diana-microt、miranda、mirbase、pictar和targetscans等软件联合进行生物信息学分析，搜索靶基因，共有32157个。基于geneontology数据库，对靶基因进行go分类和keggpathway的功能分析，进行显著性基因功能筛选。结果显示，差异表达mirnas可能参与了细胞的迁移、分化和凋亡。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

sequencelisting

<110>福建医科大学附属口腔医院

<120>应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异mirnas表达谱的

方法

<160>4

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