荧光定量检测百日咳博特氏菌的试剂盒和方法与流程

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及荧光定量检测百日咳博特氏菌的试剂盒和方法。

背景技术：

百日咳是由百日咳博德特氏菌引起的急性呼吸道传染病。其临床特征为阵发性痉挛性咳嗽并伴有深长的“鸡鸣”样吸气性吼声，如未得到及时有效治疗，病程可达数个月。本病传染性很强，患儿年龄越小，病情越重，可因并发肺炎、脑病而死亡。

大多数情况(80-98％)是由小的革兰氏阴性细菌百日咳博德特氏菌(b.pertussis)引起的，然而少数情况(2-20％)是由副百日咳博德特氏菌(b.parapertussis)引起的(mattooetc.2005)。由副百日咳博德特氏菌(b.parapertussis)引起的百日咳的症状一般地比由百日咳博德特氏菌(b.pertussis)引起的要温和，然而，仅仅基于临床症侯学差别诊断是困难的。极少的是类似百日咳的症状，其由支气管败血性博德特氏菌(b.bronchiseptica)或霍氏博德特氏菌(b.holmesii)感染所引起的。

市面上流通的基于荧光定量方法检测百日咳博德特氏菌的试剂盒一般采用is481，ptxs1基因序列作为靶标序列，但is481基因序列同时存在于百日咳博德特氏菌、霍氏博德特氏菌和支气管败血博特氏菌中(karenbetc.2006)，ptxs1基因序列同时存在于百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌中(fengxianggaoetc.2013)，所以这些试剂盒并不能专一检测百日咳博德特氏菌。有人应用is481和is1001基因序列组合来检测百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌，但该组合需要两个反应来完成检测，这样加重了检测成本。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供检测百日咳博特氏菌荧光定量试剂。

本发明提供的试剂，包括检测百日咳博德特氏菌的引物1、检测百日咳博德特氏菌的引物2、检测百日咳博德特氏菌的探针1；

所述引物1的核苷酸序列为序列2；

所述引物2的核苷酸序列为序列3；

所述探针1的核苷酸序列为序列4。

上述试剂中，所述试剂还包括内标荧光探针2，所述内标荧光探针2的核苷酸序列为序列6。

上述试剂中，所述各个探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。

上述试剂中，所述引物1、所述引物2、所述探针1和所述探针2的摩尔比为2:2:1:1。

本发明第二个目的是提供检测百日咳博特氏菌荧光定量pcr试剂。

本发明提供的pcr试剂，包括上述试剂；

所述各引物在所述pcr试剂中的浓度为0.4um；

所述各探针在所述pcr试剂中的浓度为0.2um。

含有上述试剂或上述pcr试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

试剂盒中还可以包括百日咳博德特氏菌的标准品、内标、阳性对照品、阴性对照品组成。

百日咳博德特氏菌标准品为将序列1所示的百日咳博德特氏菌序列与pgem-t载体(promega，产品编号a362a)连接，得到百日咳博德特氏菌质粒，即为标准品。

内标：为将序列5所示的内标序列与pgem-t载体连接，得到内标质粒，即为内标。

阳性对照品为灭活的百日咳博特氏菌的dna提取物；

阴性对照品为正常人的痰液提取液(提取方法同前)。

上述试剂或上述pcr试剂或上述的试剂盒在检测或定量检测百日咳博德特氏菌中的应用也是本发明保护的范围；

或上述试剂或上述pcr试剂或上述的试剂盒在制备检测或定量检测百日咳博德特氏菌产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述试剂或上述pcr试剂或上述的试剂盒在制备检测待测样本是否感染百日咳博德特氏菌产品中的应用也是本发明保护的范围。

若要定量检测，可以通过检测5个浓度梯度定量参考品(标准品)的ct值大小，并用该5个浓度梯度定量参考品(标准品)的ct值大小和5个浓度梯度绘制的标准曲线，将待测样本的ct值带入该标准曲线中，得到待测样本的定量检测结果；

本发明第3个目的是提供一种检测待测样本是否感染百日咳博德特氏菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述pcr试剂对待测样本进行实时荧光定量pcr，

若待测样本的实时荧光定量pcr结果为如下条件：在测定百日咳博德特氏菌的通道下扩增曲线呈s型或ct值≤39且ct值＞0，则待测样本感染或候选感染百日咳博德特氏菌；

若待测样本的实时荧光定量pcr结果不为所述条件，则待测样本不感染或候选不感染百日咳博德特氏菌。

上述方法中，所述pcr扩增的模板为待测样本的dna，

所述pcr扩增的方法还可以将待测样本的dna和内标混合作为模板。

内标：为将序列5所示的内标序列与pgem-t载体(promega，产品编号a362a)连接，得到内标质粒，即为标准品。

本发明通过对百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、霍氏博德特氏菌和支气管败血博特氏菌进行序列分析得到的一段187bp大小的特异序列，该序列仅存在于百日咳博德特氏菌中。所提出的试剂盒能够灵敏地检测并专一鉴别样品中存在的百日咳博德特氏菌核酸，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

本发明的实验证明，本发明的试剂盒和检测方法基于的taqman荧光定量检测技术，不仅可以快速明确感染的病原体，减少检测费用，提高仪器使用率，而且解决了临床呼吸道真菌感染病原体检测的通量问题，对临床的早期诊断和治疗具有重要的指导意义。

附图说明

图1为本发明特异性实验结果图。

图2为本发明灵敏度试验结果图。

图3为本发明临床样品评估实验结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、百日咳博特氏菌实时荧光定量检测试剂盒及其专用引物

一、百日咳博特氏菌实时荧光定量检测专用引物的设计与合成

通过对百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、霍氏博德特氏菌和支气管败血博特氏菌基因序列进行比对分析筛选出一段187bp百日咳博德特氏菌特异保守序列，该序列为序列1。

设计引物序列如下：

百日咳博德特氏菌上游扩增引物序列为：5'-tttcactatgggctgtcgtg-3'(序列2)；

百日咳博德特氏菌下游扩增引物序列为5'-tgcgctattgccggatt-3'(序列3)；

百日咳博德特氏菌荧光探针序列为：5'-aatccggcaatagcgca-3'(序列4)，其5'端标记fam荧光基团，3’端标记tamra淬灭基团。

本发明设置的内标为一段除了探针结合序列与百日咳博德特氏菌特异序列不同外，其它碱基均相同的核苷酸序列，该内标序列为序列5。

内标荧光探针序列为：5'-acctttggcctggaaacctggg-3'(序列6)，内标探针5'端标记joe荧光基团，3’端标记tamra淬灭基团。

内标可使用序列2和序列3引物。

合成上述引物及探针。

二、百日咳博特氏菌的实时荧光定量pcr检测方法的建立

1、待测样本的基因组dna的获得

取50μl待测样本于灭菌的离心管中，向待测样本中加入50μllysisbuffer(宝生物工程(大连)有限公司，codeno.9164)和10ul内标溶液(内标溶液为内标质粒溶于水中得到的溶液；内标质粒为在pgem-t载体插入序列5所示的核苷酸)，混合均匀。

80℃热变性15分钟后，低速离心，取上清于新的灭菌的离心管中，得到核酸，用于后续实验或-20℃冻存。

2、实时荧光定量pcr检测

5ul待测样本的dna分子加入到15ulpcr反应液中。

15ulpcr反应液：含有百日咳博德特氏菌上游扩增引物、百日咳博德特氏菌下游扩增引物均为0.4um、百日咳博德特氏菌荧光探针和内标荧光探针浓度均为0.20um、耐热dna聚合酶(碧云天生物技术公司，产品编号d7207)为5u/反应，mgcl2终浓度为2.0mm，dntps终浓度为0.2mm、氯化钾终浓度为60mm、0.2％的曲拉通溶液(sigma，产品编号303135，体积百分含量)和10％的甲酰胺溶液(sigma，产品编号f9037，体积百分含量)以及ph7.5、20mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(sigma，产品编号10812846001)。

将上述反应体系在如下反应程序下进行反应:

反应程序

60℃时分别检测fam和joe通道。其中fam通道检测百日咳博德特氏菌，joe检测内标。

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为ct值(即cyclethreshold，指pcr反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；

若待测样本为如下条件：对于测定fam通道ct值≤39(ct值＞0)或扩增曲线呈s型，则待测样本感染或候选感染百日咳博德特氏菌；

若待测样本不为上述条件：对于测定fam通道ct值≤39(ct值＞0)或扩增曲线呈s型，则待测样本不感染或候选不感染百日咳博德特氏菌。

对于测定显示无ct值的样本，同时内标检测为阳性(ct值≤39)，报告为阴性，此时待测样本扩增曲线平直；

对于测定ct值>39的样本，同时内标检测为阳性(ct值≤39)，报告为低于检测下限。

若内标ct值>39或内标显示无ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

若要定量检测，可以通过检测5个浓度梯度定量参考品(标准品)的ct值大小，并用该5个浓度梯度定量参考品(标准品)的ct值大小和5个浓度梯度绘制的标准曲线，将待测样本的ct值带入该标准曲线中，得到待测样本的定量检测结果；

也可以仪器软件根据各样本ct值大小，通过5个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定量检测结果。

三、百日咳博特氏菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒立

百日咳博特氏菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒包括：百日咳博德特氏菌上游扩增引物、百日咳博德特氏菌下游扩增引物、百日咳博德特氏菌荧光探针、内标荧光探针；

或，百日咳博特氏菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒包括含有百日咳博德特氏菌上游扩增引物、百日咳博德特氏菌下游扩增引物、百日咳博德特氏菌荧光探针、内标荧光探针的pcr试剂；

其中试剂盒中也可以不含有内标荧光探针；

试剂盒中还可以包括百日咳博德特氏菌的标准品、内标、阳性对照品、阴性对照品组成。

百日咳博德特氏菌标准品为将序列1所示的百日咳博德特氏菌序列与pgem-t载体(promega，产品编号a362a)连接，得到百日咳博德特氏菌质粒，即为标准品。

内标：为将序列5所示的内标序列与pgem-t载体连接，得到内标质粒，即为内标。

阳性对照品为灭活的百日咳博特氏菌的dna提取物；

阴性对照品为正常人的痰液提取液(提取方法同前)。

实施例2、百日咳博特氏菌实时荧光定量检测试剂盒的应用

一、灵敏度检测

将浓度为10⁵copies/ul百日咳博德特氏菌标准品分别按10⁵、10⁴、10³、10²、10copies/ul梯度稀释，之后以之分别作为待测样本dna，按照实施例1中的二的荧光定量方法检测。

结果如图2所示，可以看出，该试剂盒最低可以检测出约10copies/ul拷贝，具有很高的灵敏度。

二、特异性测试

对常见其他肺部致病菌百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、霍氏博德特氏菌、支气管败血博特氏菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体(兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及某些生物学特性研究，范志宇靶序列富集多重pcr在儿童肺炎细菌性病原诊断中的应用研究，邓继岿)等提取dna作为待测样本核酸，按照实施例1中的二的荧光定量方法检测。

结果如图1所示，特异性测试实验中只有百日咳博德特氏菌有扩增曲线，其它常见肺部致病病菌均无扩增曲线。

三、百日咳博特氏菌实时荧光定量检测

1、核酸提取

收集北京儿童医院的已鉴定28例感染百日咳博德特氏菌临床病例的痰液，按照实施例1的二的方法提取dna。

2、实时荧光定量检测

按照实施例1的二的方法检测上述dna。

对于测定fam通道ct值≤39(ct值＞0)的样本，报告为百日咳博德特氏菌dna阳性，此时待测样本的扩增曲线呈s型；

对于测定显示无ct值的样本，同时内标检测为阳性(ct值≤39)，报告为阴性，此时待测样本扩增曲线平直；

对于测定ct值>39的样本，同时内标检测为阳性(ct值≤39)，报告为低于检测下限。

若内标ct值>39或内标显示无ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

结果如图3所示，对28例百日咳博德特氏菌临床病例进行检测，其中27例为百日咳博德特氏菌阳性。

对比例：

一、设计对照引物及对照探针：

根据百日咳博德特氏菌基因其他靶区域设计的引物：

上游引物序列：5'-cggtcacgtcaagcacaa-3'

下游引物序列：5'-ggaggatacgccggact-3'

百日咳博德特氏菌荧光探针序列为：5'-atagaaacagtggctcgatggcgc-3'，其5'端标记fam荧光基团，3’端标记tamra淬灭基团。

二、灵敏度检测

按照实施例2的一的方法进行检测，不同的是替换为本对比例中的引物对和探针，结果，对照引物及对照探针检测灵敏度为100copies/ul，低于本发明的实施例。

三、百日咳博德特氏菌多重实时荧光定量检测

按照实施例2的三的方法进行检测，不同的是替换为本对比例中的引物对和探针，结果，28例百日咳博德特氏菌临床病例仅20例百日咳博德特氏菌阳性，表明对比例的阳性检出率远远低于本发明的实施例。

序列表

<110>北京福安华生物科技有限公司

<120>荧光定量检测百日咳博特氏菌的试剂盒和方法

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<170>patentinversion3.5

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<211>159

<212>dna

<213>人工序列

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gtccggcgtatcctccgcaggggctctggggaaaacacgcacaaaatttcgctgaacgaa180

gatgagg187

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