用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记AS‑ALS及其应用的制作方法

本发明属于农业生物工程领域，涉及用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记as-als及其应用。

背景技术：

水稻是全世界近一半人口的主粮，也是我国主要的粮食作物之一。水稻传统的栽培方式以人工栽种为主，费时费力，随着人力成本的提高，水稻栽培成本也大幅提高，效益低下。近年来，随着我国新型城镇化和现代农业的发展，水稻生产正在向集约化、规模化、机械化发展，机插秧、直播等轻简栽培已成为发展趋势。然而，直播稻田容易滋生杂草及杂草稻，严重影响水稻生长、产量及稻谷品质。人工除草的成本极高，制约了水稻生产朝着高产、高效、低成本方向发展，不利于发展现代农业。因此，开展抗除草剂的水稻育种和应用对于水稻优质、高效生产有着重要的意义。

咪唑啉酮类除草剂是由美国氰胺公司开发成功的一类高效广谱低毒的除草剂，目前已经有6种商品化，包括：咪唑烟酸、咪唑乙烟酸、咪草酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草烟和甲基咪草烟。其中咪唑乙烟酸，又称为咪草烟，是一种常用于大豆田的高效除草剂，能有效防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草(石磊.农药市场信息,2003,7:16.)。咪草烟的作用机理是通过抑制乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase，als)，从而抑制侧链氨基酸的合成(gastons,etal.physiologiaplantarum,2002,114(4):524-532.)。

本发明人所在团队拟现有水稻品种资源材料中筛选抗咪草烟的水稻材料。找到抗咪草烟的水稻材料als基因序列突变位点，开发抗咪草烟的水稻材料als基因分子标记。

该基因可以通过回交转育到栽培品种中，但传统上需要进行喷施除草剂逐代筛选鉴定，其过程经历多代的杂交和回交，育种周期长，而且该基因为显性基因，表型选择难以剔除杂合基因型，更加大了育种周期和难度。因此，利用分子标记辅助选择(marker-assistedselection,mas)技术，进行基因型筛选鉴定，加快杂交后代的早代稳定，对于抗除草剂基因快速转育、加快育种进程具有重要意义。本发明根据该位点的突变，设计了等位基因特异pcr标记，进行基因型选择，加快早代稳定，建立了抗除草剂分子育种技术体系。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的是针对将抗除草剂基因检测过程繁琐的问题，提供一个用于检测样品中携带抗除草剂或感除草剂基因的分子标记as-als；

本发明的另一目的是提供了一种as-als标记用于检测水稻品种中含有抗除草剂或感除草剂基因的检测方法；

本发明的又一目的是提供了一种as-als标记用于检测杂交后代抗除草剂或感除草剂基因的携带情况，利于分子标记辅助选育抗除草剂新品系。

技术方案

本发明提供了一种用于抗咪草烟除草剂基因型检测的功能标记as-als，所述抗咪草烟除草剂基因型为als基因编码区第1880位碱基g转换为a的突变，一种能够通过两个pcr检测，明确als基因第1880位碱基为g(感咪草烟)，还是为a(抗咪草烟)的鉴定方法，从而能够快速筛选样品中是携带抗咪草烟，还是携带感咪草烟的基因型。本发明的准确性高、操作简单、检测效率高、成本低廉，具有很强的实用价值。

具体而言，本发明根据水稻als基因第1880位碱基的功能突变位点，设计的功能标记as-als包含两个引物组合：f1n和f1m；

其中所述的f1n引物组合包含上下游两个引物：as-als-f1与as-alsn-r2-2，所述的f1m引物组合包含上下游两个引物：as-als-f1与as-alsm-r2-1：

所述的as-als-f1序列：5’-gaggcaatcatcgctactgg-3’，

所述的as-alsn-r2-2序列：5’-tgtccttgaatgcgcccctac-3’，

所述的as-alsm-r2-1序列：5’-tgtccttgaatgcgcccctat-3’

含有感咪草烟als-g基因型的样品能被f1n引物组合扩增出547bp条带，含有抗咪草烟als-a基因型的样品能被f1m引物组合扩增出547bp条带，同时含有als-g和als-a基因型的样品能同时被f1n和f1m两种引物组合扩增出547bp条带。

利用所述的功能标记as-als检测样品中als基因型的方法，其特征在于，含有感咪草烟als-g基因型的样品能被f1n引物组合扩增出547bp条带，含有抗咪草烟als-a基因型的样品能被f1m引物组合扩增出547bp条带。含有als-g和als-a基因型的样品能同时被f1n和f1m两种引物组合扩增出547bp条带。

利用所述的功能标记as-als检测分别以含有感咪草烟als-g基因型的品种和含有抗咪草烟als-a基因型的品种配组后代als基因型的方法，其特征在于，含有感咪草烟als-g基因型的材料能被f1n引物组合扩增出547bp条带，含有抗咪草烟als-a基因型的材料能被f1m引物组合扩增出547bp条带，同时含有als-g和als-a基因型的材料能同时被f1n和f1m两种引物组合扩增出547bp条带。

有益效果

本发明人所在团队利用从7403份水稻品种资源材料中筛选到一个抗咪草烟的水稻材料“金粳818”。通过对“金粳818”的als基因序列进行测序分析发现，其als基因编码区与其它粳稻品种间存在一个碱基的突变，即”金粳818”als基因编码区第1880位碱基由g突变为a。

该基因可以通过回交转育到栽培品种中，但传统上需要进行喷施除草剂逐代筛选鉴定，其过程经历多代的杂交和回交，育种周期长，而且该基因为显性基因，表型选择难以剔除杂合基因型，更加大了育种周期和难度。因此，利用mas技术，进行基因型筛选鉴定，加快杂交后代的早代稳定，对于抗除草剂基因快速转育、加快育种进程具有重要意义。本发明根据该位点的突变，设计了等位基因特异pcr标记，进行基因型选择，加快早代稳定，建立了抗除草剂分子育种技术体系。

本发明所提供的检测抗除草剂或感除草剂基因的功能标记as-als及其应用，具有如下优点：

通过本发明获得了一个功能标记as-als，该标记不是与als基因连锁的标记，而是根据功能突变位点开发而成，鉴定结果能直接反应植株的抗性，不存在遗传交换的风险；

对功能标记进行了引物组合的筛选和pcr反应条件的优化，扩增产物准确可靠且效果稳定，无假阳性现象；

该功能标记能够快速准确的区分抗除草剂或感除草剂基因(包括籼稻和粳稻)，弥补了喷施农药带来的农药残留、植株抗性分离等副作用，能加快新品种选育进程；

本发明提供了一种能够通过两个pcr检测，明确als基因第1880位碱基为g(感咪草烟)，还是为a(抗咪草烟)的鉴定方法，从而能够快速筛选样品中是携带抗咪草烟，还是携带感咪草烟的基因型。本发明的准确性高、操作简单、检测效率高、成本低廉，具有很强的实用价值。

附图说明:

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1不同引物组合对日本晴和“金粳818”的pcr扩增结果

a为日本晴，b为“金粳818”；m为dl2000标记，由大到小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1-11分别为1、as-alsn-f2-1和as-als-r1-1；2、as-alsn-f2-1和as-als-r1-2；3、as-alsn-f2-2和as-als-r1-1；4、as-alsn-f2-2和as-als-r1-2；5、as-alsm-f2-1和as-als-r1-1；6、as-alsm-f2-1和as-als-r1-2；7、as-alsm-f2-2和as-als-r1-1；8、as-alsm-f2-2和as-als-r1-2；9、as-als-f1和as-alsn-r2-1；10、as-als-f1和as-alsn-r2-2；11、as-als-f1和as-alsm-r2-1。

图2引物组合提高退火温度优化后pcr扩增结果

a为日本晴，b为“金粳818”；m为dl2000标记，由大到小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1-11分别为as-alsn-f2-1与as-als-r1-1组合(第1组)、as-alsn-f2-1与as-als-r1-2组合(第2组)、as-alsn-f2-2与as-als-r1-1组合(第3组)、as-alsn-f2-2与as-als-r1-2组合(第4组)、as-als-f1与as-alsn-r2-2组合(第10组)和as-als-f1与as-alsm-r2-1组合(第11组)。

图3不同材料的as-als功能标记检测结果

a：as-als-f1与as-alsn-r2-2组合；b：as-als-f1与as-alsm-r2-1；m为dl2000标记，由大到小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1-9分别为“金粳818”、日本晴、9311、南粳45、南粳9108、ir36、南京16、淮稻5号和“南粳9108/金粳818”杂交种

图4as-als标记检测f2群体及表型对应情况

图中仅列出部分f2单株检测的结果。m为dl2000dna标记(由大到小分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，p1为“金粳818”，p2为南粳9108，f1为“南粳9108/金粳818”杂交种，1-21为f2群体单株；r表示单株表现为抗除草剂，s表示单株表现为感除草剂。

图5喷施除草剂后f2代植株表型

1为“金粳818”，2为南粳9108，3为“南粳9108/金粳818”杂交种，4为als-a纯合基因型后代，5为杂合基因型后代，6为als-g纯合基因型后代。

图6as-als标记检测高代品系及表型对应情况

m为dl2000dna标记(由大到小分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，p1为“金粳818”，p2为南粳9108，1-22为bc3f3群体单株；r表示单株表现为抗除草剂，s表示单株表现为感除草剂。

具体实施方式

以下结合附图说明，以具体实施例对本发明的技术方法进行说明：

(下面详细描述本发明的实施方式，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。)

本发明人所在团队通过大量的研究从7403份水稻品种资源材料中筛选到一个抗咪草烟的水稻材料“金粳818”。通过对“金粳818”的als基因序列进行测序分析发现，其als基因编码区第1880位存在一个碱基g转换为a的突变。

该基因可以通过回交转育到栽培品种中，但传统上需要进行喷施除草剂逐代筛选鉴定，其过程经历多代的杂交和回交，育种周期长，而且该基因为显性基因，表型选择难以剔除杂合基因型，更加大了育种周期和难度。因此，利用mas技术，进行基因型筛选鉴定，加快杂交后代的早代稳定，对于抗除草剂基因快速转育、加快育种进程具有重要意义。本发明根据该位点的突变，设计了等位基因特异pcr标记，进行基因型选择，加快早代稳定，建立了抗除草剂分子育种技术体系。

1、分子标记的设计及检测

基于抗除草剂品种“金粳818”与感除草剂品种日本晴在als基因第1880位碱基的差异，开发分子标记，如表1，其中设置11个引物组合：1、as-alsn-f2-1和as-als-r1-1；2、as-alsn-f2-1和as-als-r1-2；3、as-alsn-f2-2和as-als-r1-1；4、as-alsn-f2-2和as-als-r1-2；5、as-alsm-f2-1和as-als-r1-1；6、as-alsm-f2-1和as-als-r1-2；7、as-alsm-f2-2和as-als-r1-1；8、as-alsm-f2-2和as-als-r1-2；9、as-als-f1和as-alsn-r2-1；10、as-als-f1和as-alsn-r2-2；11、as-als-f1和as-alsm-r2-1。部分引物引入了碱基错配。

表1als基因分子标记设计(小写字母加粗标识的碱基表示错配碱基，下划线加粗的碱基表示功能突变位点碱基)

用ctab方法提取日本晴和“金粳818”苗期叶片的基因组dna(murraymg,etal.,nucleicacidsresearch,1980,8(19):4321-4326)，步骤如下：

(1)取0.2g新鲜组织叶片放在2ml离心管中，加入液氮研磨；

(2)加入650μlctab提取液(2％ctab，100mmtrisph8.0，20mmedtaph8.0，1.4mnacl)，混匀，65℃水浴1h；

(3)加入650μl氯仿：异戊醇(24:1)，充分混匀；

(4)12000rpm离心5min；

(5)取上清400μl，加入预冷的无水乙醇800μl，-20℃放置20min；

(6)12000rpm离心5min；

(7)去上清，加入200μl70％乙醇，悬浮清洗两次；

(8)去除乙醇，干燥，用200μl1×te缓冲液溶解；

(9)用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提基因组质量，存于-20℃冰箱备用。

以日本晴(感除草剂品种)和“金粳818”的基因组为模板进行引物筛选，通过上述引物组合进行pcr扩增。pcr反应的体系为dna模板2μl，10×pcrbuffer2μl，mgcl2(5mmol/l)2μl，dntp(2mmol/l)2μl，上游引物2μl，下游引物2μl，taq酶0.2μl，ddh2o7.8μl。扩增条件为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min，结束反应。pcr反应在eppendorfmastercycle热循环仪中进行。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像仪中拍照，如图1所示。结果发现，as-alsn-f2-1与as-als-r1-1组合(第1组)及as-alsn-f2-1与as-als-r1-2组合(第2组)仅能在日本晴品种中扩增，但扩增效率较低。as-alsm-f2-1与as-als-r1-1组合(第5组)、as-alsm-f2-2与as-als-r1-1组合(第7组)、as-alsm-f2-2与as-als-r1-2组合(第8组)仅能在“金粳818”中扩增。而as-als-f1与as-alsn-r2-2组合(第10组)和as-als-f1与as-alsm-r2-1组合(第11组)分别能在日本晴和“金粳818”中高效扩增，而在另一个品种中有微弱扩增。

2、分子标记引物的选择与优化

基于上述扩增结果，选择6对分子标记[as-alsn-f2-1与as-als-r1-1组合(第1组)、as-alsn-f2-1与as-als-r1-2组合(第2组)、as-alsn-f2-2与as-als-r1-1组合(第3组)、as-alsn-f2-2与as-als-r1-2组合(第4组)、as-als-f1与as-alsn-r2-2组合(第10组)和as-als-f1与as-alsm-r2-1组合(第11组)]进一步优化条件。pcr反应的体系与之前相同，pcr程序中将退火温度提高到60℃。pcr产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中分离，于凝胶成像系统中拍照。结果如图2所示，as-alsn-f2-1与as-als-r1-1组合(第1组)、as-alsn-f2-1与as-als-r1-2组合(第2组)、as-alsn-f2-2与as-als-r1-1组合(第3组)、as-alsn-f2-2与as-als-r1-2组合(第4组)均不能有效扩增出目的条带。而as-als-f1与as-alsn-r2-2组合(第10组)能在日本晴品种中获得特异有效扩增，as-als-f1与as-alsm-r2-1组合(第11组)能在“金粳818”中获得单一有效扩增。且这两个引物组合获得的条带明亮、清晰，检测结果可靠。将as-als-f1与as-alsn-r2-2组合命名为f1n，将as-als-f1与as-alsm-r2-1组合命名为f1m，将这两组引物作为检测als-g/a的分子标记，命名为as-als。

3、不同水稻材料的as-als功能标记检测(以下品种均为公知公用品种)

利用上述开发的as-als功能标记检测“金粳818”、日本晴、9311、南粳45、南粳9108、ir36、南京16号、淮稻5号以及“南粳9108/金粳818”杂交种。其中“金粳818”为粳稻品种，抗咪草烟；日本晴、南粳45、南粳9108、淮稻5号为粳稻，感咪草烟；9311、ir36、南京16号为籼稻，感咪草烟；“南粳9108/金粳818”杂交种抗咪草烟。结果如图3所示，“金粳818”只能被f1m扩增，为抗咪草烟类型；日本晴、9311、南粳45、南粳9108、ir36、南京16、淮稻5号只能被f1n扩增，为感咪草烟类型；“南粳9108/金粳818”杂交种能同时被f1n和f1m扩增。表明as-als功能标记对籼稻和粳稻均具有多态性，能同时用于粳稻和籼稻资源的筛选及抗除草剂遗传改良。

4、as-als标记检测f2群体及表型

进一步利用as-als标记检测“金粳818”、南粳9108、“南粳9108/金粳818”杂交种及它们的93个f2单株，我们发现，所有携带als-a型基因的f2群体单株都表现为抗除草剂，而所有不携带als-a型(即只携带als-g型)基因的f2群体单株均表现为感除草剂(图4和图5)。基因型检测结果与表型鉴定结果完全对应。as-als标记与抗/感除草剂表型完全共分离，同时还能检测到抗性杂合基因型，表明我们开发的as-als标记可用于抗咪草烟育种的精准选育，在f2代筛选抗性的纯合基因型，可以进行早代选择。

5、as-als标记在回交育种中的应用

为了明确as-als标记在抗除草剂品系选育中的应用，我们以“金粳818”为供体亲本，以9311为轮回亲本进行连续回交3代，每一代均对杂交种检测保留als-g/a基因型的单株，与轮回亲本杂交；对bc3f2单株保留纯合单株，再自交一代，结合农艺性状选择，获得除草剂抗性稳定且的bc3f3株系。图6为利用as-als标记对农艺性状优良的株系随机检测的结果，表明这些株系都携带纯合als-a等位基因，这些株系抗性稳定，不再分离。因此，利用as-als标记辅助选择als-a基因可以快速获得除草剂抗性稳定的水稻材料。

sequencelisting

<110>江苏省农业科学院

<120>用于抗除草剂咪草烟基因型检测的功能标记as-als及其应用

<130>说明书

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