本发明设计试剂盒，特别是涉及一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。
背景技术：
2001年，zuk等发现在脂肪组织存在一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞。其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。
脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪间充质干细胞已成为干细胞领域备受关注的热点。2012年1月，韩国fda批准的自体脂肪干细胞药物cuepistem成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月，美国fda批准了cytoritherapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。脂肪间充质干细胞具有广阔的临床应用前景。因此，如何简单、快速、高新、安全获得大量脂肪间充质干细胞成为当务之急。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种操作简便，可以快速、安全获得大量脂肪间充质干细胞的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，盒内包括分别瓶装保存的脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液。
所述脂肪保存液为含青霉素100~200ug/ml、链霉素100~200ug/ml、两性霉素2.5~5μg/ml、阿司匹林1～2μmol/ml、地塞米松0.1～0.3nmol/ml的dmem或dmem/f12、mem、rpmi-1640培养基。
所述脂肪洗涤液为含青霉素100~200ug/ml、链霉素100~200ug/ml、两性霉素2.5~5μg/ml、阿司匹林1～2μmol/ml、地塞米松0.1～0.3nmol/ml的生理盐水或pbs、d-hanks、hbss。
所述脂肪分解液为含胶原酶i0.75~2mg/ml、阿司匹林1～2μmol/ml、地塞米松0.1～0.3nmol/ml的dmem或dmem/f12、mem、rpmi-1640培养基。
所述细胞洗涤液为含阿司匹林1～2μmol/ml、地塞米松0.1～0.3nmol/ml的pbs或d-hanks、hbss。
所述细胞培养液为含阿司匹林1～2μmol/ml、地塞米松0.1～0.3nmol/ml的间充质干细胞无血清生长培养基，该培养基化学成分限定，含l-谷氨酰胺，不含酚红和抗生素。
所述细胞消化液为含trypsin-edta1.25~2.5mg/ml，含阿司匹林1～2μmol/ml、地塞米松0.1～0.3nmol/ml的pbs或d-hanks、hbss溶液。
所述细胞冻存液为含dmso60~200mg/ml，含阿司匹林1～2μmol/ml、地塞米松0.1～0.3nmol/ml的间充质干细胞无血清生长培养基。
本发明提供了一种制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，该试剂盒中，脂肪保存液的作用是保证脂肪标本在采集之后的运输过程中的活性，并消灭和预防细菌、真菌。脂肪洗涤液的作用是洗涤除去脂肪组织的血液细胞，同时消灭和预防细菌、真菌。脂肪分解液的作用是消化脂肪组织，获得单细胞悬液。细胞洗涤液的作用是洗涤获得的干细胞。细胞培养液为无血清，且化学成分限定，减少动物来源的病原体感染风险，培养脂肪间充质干细胞相对于使用胎牛血清而言更安全。细胞消化液的作用是细胞传代时，消化贴壁的间充质干细胞。细胞冻存液的作用是冻存获得的脂肪间充质干细胞。
使用该试剂盒，可在较短时间（3周内）获得大量脂肪间充质干细胞（细胞数量可达109数量级），并且具有使用方便，成本低廉，无血清（减少动物来源的病原体感染风险）更安全的特点，将在干细胞临床试验及其相关研究中发挥重要作用，应用前景极为广泛。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所需试剂耗材及实验仪器等均可通过商业途径购得。
实施例一用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配置
本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂
1)脂肪保存液配置方法：青霉素（品牌amresco，货号0242）200mg、链霉素（品牌amresco，货号0382）200mg、两性霉素（品牌amresco，货号e437）5mg、阿司匹林（sigma，a2093-100g）2mmol、地塞米松（sigma，d4902-25mg）0.1μmol，溶于1000mldmem培养基中0.22um过滤除菌即可。
2)脂肪洗涤液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、阿司匹林2mmol、地塞米松0.1μmol，溶于1000ml生理盐水中0.22um过滤除菌即可。
3)脂肪分解液配置方法：胶原酶i（品牌sigma，货号c0130）1g、阿司匹林2mmol、地塞米松0.1μmol溶于1000mldmem培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
4)细胞洗涤液配置方法：pbs，配方为nacl8.50g，na2hpo4·12h2o3.58g，nah2po4·2h2o0.39g，加双蒸水至1000ml，高压灭菌即可。阿司匹林2mmol、地塞米松0.1μmol溶于1000ml上述pbs中，0.22um滤器过滤除菌即可。
5)细胞培养液配置方法：无血清基础培养基(品牌lonza，货号00190620)450ml及其添加物(品牌lonza，货号00192125)50ml混匀。阿司匹林2mmol、地塞米松0.1μmol溶于1000ml上述方法配制的无血清培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
6)细胞消化液配置方法：trypsin（胰蛋白酶）0.25g，edta-2na19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液100ml中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。
7)细胞冻存液配置方法：10mldmso（品牌sigma，货号d2650）缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液中，轻轻混匀即可。
1、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。
按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。
二、脂肪间充质干细胞的制备
现用步骤一的试剂盒制备脂肪间充质干细胞，具体制备方法包括以下步骤（以20ml脂肪为例，所有操纵步骤均在洁净工作台完成）：
1）脂肪运输：采集20ml脂肪，加入等体积的脂肪保存液，2~8℃恒温保存在疫苗箱中，48h内送至实验室。
2）洗涤脂肪：吸弃脂肪保存液，加入等体积脂肪洗涤液，反复振荡几次，静置后脂肪与脂肪洗涤液自然分层，吸弃脂肪洗涤液，同上，再加入等体积脂肪洗涤液振荡洗涤2~3次，至下层脂肪洗涤液澄清即可，吸弃脂肪洗涤液，获得脂肪。
3）消化脂肪：获得的脂肪加入等体积的脂肪分解液（预热到37℃），置于恒温振荡培养箱中，37℃，200rpm，消化30~60min，至脂肪呈靡状即可。
4）分离svf（基质血管部分）：将消化后的靡状脂肪组织，700g离心10min，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液（注意在svf沉淀上方留下少量的溶液以免扰动沉淀细胞），加入细胞洗涤液混匀，100um滤网过滤，吸取1ml悬液计数，为2.1×107个，400g离心8min，弃上清，获得svf。
5）细胞种植：根据svf细胞数，按照1.0×106个／ml的密度加入细胞培养液20ml，接种1个t175培养瓶，置于二氧化碳培养箱，培养条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2%，每隔3d换液一次。
6）细胞传代：7d左右，原代培养细胞达70%～80%融合时，吸弃旧细胞培养液，加细胞洗涤液，静置1min，吸弃细胞洗涤液，加入细胞消化液，消化时间为1.5～2.5min，然后加入细胞培养液2～3ml中止消化，反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ml离心管中，细胞计数，为4.6×107个，400g离心8min，弃上清，获得4.6×107个p0代脂肪间充质干细胞。按照5.0×105/ml加入细胞培养液，接种到5个t175培养瓶，放入二氧化碳培养箱内培养，计为p1代。待3d左右，p1代细胞达80%～90%融合时，同上操作，收获细胞，计数获得1.9×108个p1代脂肪间充质干细胞，同上继续传代（每3~5天可传代一次），以此类推，直至收获p3代，经细胞计数为3.9×109个脂肪间充质干细胞。
7）细胞冻存：将上述获得p3代细胞悬液，400g离心8min，弃上清，缓慢加入细胞冻存液，轻轻混匀，然后在冻存管上标明细胞名称、代数及冻存日期；放入冻存盒，-80℃冰箱过夜，次日转移到液氮长期保持，待使用时复苏即可。
可以看出，用本发明的试剂盒，在较短时间（3周内）内，由仅仅20ml脂肪，获得大量的3.9×109个脂肪间充质干细胞。表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。
实施例二用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配置
本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
1）脂肪保存液配置方法：青霉素100mg、链霉素100mg、两性霉素2.5mg、阿司匹林1mmol、地塞米松0.3μmol，溶于1000mldmem/f12培养基即可。
2）脂肪洗涤液配置方法：青霉素100mg、链霉素100mg、两性霉素2.5mg、阿司匹林1mmol、地塞米松0.3μmol，溶于1000ml生理盐水即可。
3）脂肪分解液配置方法：胶原酶i2g、阿司匹林1mmol、地塞米松0.3μmol溶于1000mldmem/f12培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
4）细胞洗涤液配置方法：pbs，配方为nacl8.50g，na2hpo4·12h2o3.58g，nah2po4·2h2o0.39g，加双蒸水至1000ml，高压灭菌即可。阿司匹林1mmol、地塞米松0.3μmol溶于上述配置好的pbs中，0.22um滤器过滤除菌即可。
5）细胞培养液配置方法：无血清基础培养基(品牌lonza，货号00190620)450ml及其添加物(品牌lonza，货号00192125)50ml混匀即可。阿司匹林1mmol、地塞米松0.3μmol溶于上述配置好的无血清基础培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
6）细胞消化液配置方法：trypsin（胰蛋白酶）125mg，edta-2na9.864mg溶于上述配好的细胞洗涤液中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。
7）细胞冻存液配置方法：10mldmso（品牌sigma，货号d2650）缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液中，轻轻混匀即可。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。
按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。
二、脂肪间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脂肪间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果20ml脂肪，在3周内扩增得到3.8×109个脂肪间充质干细胞。表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。
实施例三用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配置
本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
1）脂肪保存液配置方法：青霉素150mg、链霉素150mg、两性霉素2.5mg、阿司匹林1.5mmol、地塞米松0.2μmol，溶于1000mldmem培养基即可。
2）脂肪洗涤液配置方法：青霉素150mg、链霉素150mg、两性霉素2.5mg、阿司匹林1.5mmol、地塞米松0.2μmol，溶于1000ml生理盐水即可。
3）脂肪分解液配置方法：胶原酶i2g、阿司匹林1.5mmol、地塞米松0.2μmol溶于1000mldmem培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
4）细胞洗涤液配置方法：pbs，配方为nacl8.50g，na2hpo4·12h2o3.58g，nah2po4·2h2o0.39g，加双蒸水至1000ml，高压灭菌即可。阿司匹林1.5mmol、地塞米松0.2μmol溶于上述配置好的pbs中，0.22um滤器过滤除菌即可。
5）细胞培养液配置方法：无血清基础培养基(品牌lonza，货号00190620)450ml及其添加物(品牌lonza，货号00192125)50ml混匀。阿司匹林1.5mmol、地塞米松0.2μmol溶于上述配置好的无血清基础培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
6）细胞消化液配置方法：trypsin（胰蛋白酶）0.25g，edta-2na19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。
7）细胞冻存液配置方法：15mldmso（品牌sigma，货号d2650）缓慢加入到85ml上述配好的细胞培养液中，轻轻混匀即可。
3、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。
按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。
二、脂肪间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脂肪间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果20ml脂肪，在3周内扩增得到4.1×109个脂肪间充质干细胞。表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。
实施例四用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配置
本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
1)脂肪保存液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、阿司匹林1mmol、地塞米松0.1μmol，溶于1000mldmem培养基即可。
2)脂肪洗涤液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、阿司匹林1mmol、地塞米松0.1μmol，溶于1000ml生理盐水即可。
3)脂肪分解液配置方法：胶原酶i1.5g、阿司匹林1mmol、地塞米松0.1μmol溶于1000mldmem培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
4)细胞洗涤液配置方法：hbss，配方nacl8.0g、kcl0.4g、葡萄糖1g、kh2po460mg、na2hpo447.5mg、nahco30.35g，加双蒸水至1000ml，调节ph至中性7.2-7.4之间，高压灭菌即可。阿司匹林1mmol、地塞米松0.1μmol溶于1000mlhbss中，0.22um滤器过滤除菌即可。
5)细胞培养液配置方法：无血清基础培养基(品牌lonza，货号00190620)450ml及其添加物(品牌lonza，货号00192125)50ml混匀即可。阿司匹林1mmol、地塞米松0.1μmol溶于1000ml上述配置好的无血清基础培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
6)细胞消化液配置方法：trypsin（胰蛋白酶）0.25g，edta-2na19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。
7)细胞冻存液配置方法：10mldmso（品牌sigma，货号d2650）缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液中，轻轻混匀即可。
4、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。
按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。
二、脂肪间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脂肪间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果20ml脂肪，在3周内扩增得到4.2×109个脂肪间充质干细胞。表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。
实施例五用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配置
本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂
1）脂肪保存液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、阿司匹林2mmol、地塞米松0.3μmol，溶于1000mldmem培养基中即可。
2）脂肪洗涤液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、阿司匹林2mmol、地塞米松0.3μmol，溶于1000ml生理盐水中即可。
3）脂肪分解液配置方法：胶原酶i1.5g、阿司匹林2mmol、地塞米松0.3μmol溶于1000mldmem培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
4）细胞洗涤液配置方法：d-hanks，配方kcl0.40g，kh2po40.06g，nacl8.00g，nahco30.35g，na2hpo4·12h2o0.12g，加三蒸水至1000ml，调整ph至7.2-7.4之间，高压灭菌即可。阿司匹林2mmol、地塞米松0.3μmol溶于1000mld-hanks中，0.22um滤器过滤除菌即可。
5）细胞培养液配置方法：无血清基础培养基(品牌lonza，货号00190620)450ml及其添加物(品牌lonza，货号00192125)50ml混匀即可。阿司匹林2mmol、地塞米松0.3μmol溶于上述配置好的无血清基础培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。
4）细胞消化液配置方法：trypsin（胰蛋白酶）0.25g，edta-2na19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。
5）细胞冻存液配置方法：10mldmso（品牌sigma，货号d2650）缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液中，轻轻混匀即可。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。
按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。
二、脂肪间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脂肪间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果20ml脂肪，在3周内扩增得到4.4×109个脂肪间充质干细胞。表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。