卤酸脱卤酶超家族蛋白变体以及使用其降低样品中含氟化合物浓度的方法与流程

本申请要求2017年9月1日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2017-0111925的优先权，其所公开的全部内容通过引用并入本申请。
背景技术：
：1.发明领域本公开内容涉及重组微生物，所述重组微生物包含编码卤酸脱卤酶超家族蛋白变体的外源基因，包含该变体的用于除去样品中氟化合物的组合物，以及使用该卤酸脱卤酶超家族蛋白降低样品中含氟化合物浓度的方法。2.相关技术说明加快全球变暖的温室气体排放是严重的环境问题，减少和预防温室气体排放的规定已经越来越严格。在温室气体中，诸如全氟化碳(pfc)、氢氟碳化物(hfc)或六氟化硫(sf6)的氟化气体(f-气体)显示出较低的绝对排放，但是其具有较长的半衰期和非常高的引起全球变暖的潜能，结果对环境导致严重的不良影响。作为f-气体排放主要原因的半导体工业和电子工业排放的f-气体量已经超出了温室气体的指定排放量并且在持续增加。因此，将温室气体分解所需的费用和温室气体排放限额每年都在增加。在f-气体分解中通常使用热解或催化热氧化法。然而，该方法具有分解速率有限、二次污染物排放、成本较高等缺点。为了克服这些缺点，已提出采用微生物生物催化剂对f-气体进行生物分解。因此，希望克服现有化学分解法的缺陷并且还希望以更经济和更加环境友好的方式处理f-气体。卤酸脱卤酶(had)超家族是包括磷酸酶、磷酸酯酶、p型atp酶、β-磷酸葡萄糖变位酶、磷酸甘露糖变位酶和脱卤酶的酶超家族。had参与从氨基酸生物合成到解毒的多种细胞过程。尽管存在这些现有技术，但是仍需要had的变体。发明概述提供了一种重组微生物，所述重组微生物包含编码卤酸脱卤酶超家族蛋白的外源基因。提供了一种用于减少样品中含氟化合物的组合物，所述组合物包含卤酸脱卤酶超家族蛋白的变体。提供了一种用于降低样品中含氟化合物浓度的方法，所述方法包括将卤酸脱卤酶超家族蛋白的变体与含有含氟化合物的样品接触，以降低样品中含氟化合物的浓度。提供了卤酸脱卤酶超家族蛋白的变体和编码该变体的多核苷酸。附图说明从以下结合附图对实施方式的描述中，这些和/或其他方面将变得显而易见并且更易于理解，其中：图1是pet-bc3334载体的载体图谱；图2是玻璃迪姆罗斯回流冷凝器(aglassdimrothrefluxcondenser)的示意图；图3是pet-sf0757载体的载体图谱；以及图4显示了bc3334蛋白同源序列的比对结果。发明详述现在将详细地提及实施方式，其示例在附图中示出，其中相同的附图标记始终表示相同的元件。在这方面，本实施方式可以具有不同的形式，并且不应被解释为限于本申请所示的描述。因此，下面仅通过参考附图对实施方式进行描述来解释这些方面。如在本申请中所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任意和所有组合。如在本申请中所使用的，术语“基因”指表达特定蛋白的核酸片段，并且可以包括调控序列，如编码区序列和包括5’-非编码序列和3’-非编码序列在内的非编码区序列。调控序列可以包括启动子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、polya结合位点、终止子区等。如在本申请中所使用的，术语多核苷酸或多肽的“序列同一性”指在进行序列比对后获得的序列的碱基或氨基酸残基之间的同一性程度以使得在某些可比较区域中为最佳匹配。序列同一性是通过对两条序列进行最佳比对对在某些可以比较区域中的两条序列进行比较获得的值，其中在某些可比较区域中的序列的部分与参照序列相比可以增加或缺失。可以通过例如在整个可比较区域中对两条最佳比对序列进行比较，确定相同氨基酸或核酸出现的位置数以获得匹配位置数，使用可比较区域中的匹配位置数除以位置总数(例如范围的尺寸)并将除得的结果乘以100以获得序列同一性百分率计算序列同一性百分率。可以使用公知的序列比对或比较程序如blastn或blastp(ncbi)、clc主要工作台(clcbio)或者megaligntm(dnastarinc)确定序列同一性百分率。除非说明书中另有说明，否则选择用于执行程序的参数可以是如下所示：e-值＝0.00001和h-值＝0.001。实施方式的一个方面提供了一种重组微生物，所述重组微生物包含编码卤酸脱卤酶(had)超家族蛋白的变体的外源基因。对于重组微生物而言，had可以是包括磷酸酶、磷酸酯酶、p型atp酶、β-磷酸葡萄糖变位酶、磷酸甘露糖变位酶和脱卤酶在内的酶。had可以包括had结构域。had可以是属于ec3.6.3.1的磷脂变位atp酶、属于ec3.1.3.45的3-脱氧-d-甘露-辛酸酯(kdo)8-磷酸磷酸酶、属于ec3.1.3.70的甘露糖基-3-磷酸甘油酸磷酸酶、属于ec3.1.3.18的磷酸乙醇酸磷酸酶或属于ec3.8.1.2的had。atp酶可能是推定参与拟南芥耐低温的脂质翻转酶。3-脱氧-d-甘露-辛酸酯(kdo)8-磷酸磷酸酶可以催化kdo生物合成的最后一步，kdo是革兰氏阴性细菌中脂多糖的组分。甘露糖基-3-磷酸甘油酸磷酸酶可以水解甘露糖基-3-磷酸甘油酸以形成渗透剂甘露糖甘油酯。磷酸乙醇酸磷酸酶可以催化2-磷酸乙醇酸酯的去磷酸化。had蛋白或其变体可以与seqidno：1、5、29、30、31、32或33的氨基酸序列具有85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或者99％或更高的序列同一性。变体可以在选自由位置n122和s184组成的组的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基处包含氨基酸改变，其中编号表示seqidno：1的氨基酸序列编号或与位置n122和s184对应的氨基酸序列编号。变体可以是属于had的酶，例如具有属于ec3.8.1.2的脱卤酶活性的酶。氨基酸改变可以包括n122被v或y取代，s184被h、q或d取代，或其组合。或者，该改变可以是在位置122对v或y的保守取代，或在位置184对h，q或d的保守取代。换而言之，改变可以是用对应于n122的氨基酸替换为对于v或y是保守性替换的氨基酸，或对应于s184的氨基酸被替换为对于h，q或d是保守性替换的氨基酸。位置184处h的保守取代可以是s184k或s184r。位置184处q的保守取代可以是s184t，s184c，s184y或s184n。位置184处的d的保守替换可以是s184e。位置122处的v的保守取代可以是n122g，n122a，n122l，n122i，n122m，n122f，n122w或n122p。位置122处的y的保守取代可以是n122s，n122t，n122c或n122q。与氨基酸序列的编号对应的编号是seqidno：5、29、30、31、32和33的氨基酸序列的n122或s184。蛋白可以与seqidno：1、5、29、30、31、32或33的氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性。可以通过使用另一个氨基酸(例如，19个天然氨基酸)取代与具有seqidno：1的氨基酸bc3334中与n122和s184对应的至少一个残基制备变体。可以通过使用h、q或d取代与seqidno：1的氨基酸序列bc3334中的s184位对应的氨基酸残基制备变体。与seqidno：1的氨基酸序列bc3334中的n122位和s184位对应的氨基酸残基可以分别是与seqidno：5的氨基酸序列sf0757中的n122位对应的氨基酸残基和s184位对应的氨基酸残基。变体可以在seqidno：1的氨基酸序列中具有n122v、n122y或者n122v和n122y两者，或者在一些实施方式中，可以在seqidno：5的氨基酸序列中具有s184h、s184q、s184d或者其组合取代。此类改变不仅可以包括单一变体，如n122v、n122y、s184h、s184q或s184d，或双变体，如n122v和s184h；n122v和s184q；n122v和s184d；n122y和s184h；n122y和s184q或者n122y和s184d。氨基酸改变可以包括取代、插入或缺失。取代可以包括使用翻译后修饰的氨基酸的取代。取代可以包括使用20个天然氨基酸中除相应氨基酸以外的19个氨基酸中的一个的取代。本申请中使用的氨基酸及其缩写如表1中所示。[表1]如在本申请中所使用的术语“保守性”或“保守性取代”分别指本领域的普通技术人员认为针对第一个突变是保守的氨基酸突变。如在本申请中所使用的术语“保守的”意指就氨基酸特征而言是相似的氨基酸。例如，当使用脂肪族氨基酸残基(例如，leu)取代特定位置上的非脂肪族氨基酸残基(例如，ser)时，将在相同位置上使用不同脂肪族氨基酸(例如，ile或val)的取代称为保守性突变。此外，氨基酸特征包括残基大小、疏水性、极性、电荷、pk值和本领域公知的其他氨基酸特征。因此，保守性突变可以包括取代，如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等。因而，由于结构的原因，使得所得到的氨基酸集合可能是保守的。例如，根据下表2所示的一般公认的氨基酸特征分组可以得到保守性取代。[表2]集合氨基酸非极性gavlimfwp极性stcynq酸性de碱性krh如在本申请中所使用的术语“对应的”指当使用具有下述参数的本领域认可的蛋白比对程序(如blast配对比对)或本领域熟知的lipman-pearson蛋白比对程序将目标蛋白的氨基酸序列(例如，seqidno：1)与参照蛋白进行比对时，与参照蛋白所提及的位置(例如，seqidno：1的位置n122或s184)比对的目标蛋白的氨基酸位置。例如，在具有seqidno：1所示的氨基酸序列的bc3332中位置n122的氨基酸残基和目标蛋白sf0757位置s184的氨基酸残基可以分别是与具有seqidno：5所示的氨基酸序列的sf0757的位置n122对应的氨基酸残基和位置s184对应的氨基酸残基。目标蛋白可以是had，其属于例如ec3.8.1.2。存储参照序列的数据库(db)可以是ncbi的参照序列(refseq)非冗余蛋白数据库。用于序列比对的参数如下所示：e值0.00001和h值0.001。根据如上所述的比对条件获得的并且具有与seqidno：1所示的氨基酸序列的位置n122和s184对应的氨基酸残基的蛋白(在下文中称为“bc3334的同源物”)的实例如下表3中所示。同源物可以与seqidno：1所示的氨基酸序列具有85％或更高的序列同一性。序列比对结果和序列编号如图4中所示。在图4中，具有下划线的部分表示位置n122和s184，n-末端残基是1和c-末端残基是236。[表3]重组微生物可以是细菌或真菌，以及细菌可以是革兰氏阳性的或革兰氏阴性的。革兰氏阴性细菌可以属于肠杆菌科。革兰氏阴性细菌可以属于埃希氏菌属、沙门氏菌属、黄色杆菌属或假单胞菌属。属于埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌。属于黄色杆菌属的微生物可以是x.autotrophicus。革兰氏阳性细菌可以属于棒状杆菌属或芽孢杆菌属。重组微生物可以包含具有seqidno：2、6、20、22、24、26或28的核苷酸序列的至少一个多核苷酸。实施方式的另一个方面提供了一种用于除去样品中含氟化合物的组合物，所述组合物包含卤酸脱卤酶(had)超家族的变体。除非在说明书中另有说明，否则had蛋白的变体与上文所述的是相同的。含氟化合物可以由式1或式2表示：<式1>c(r1)(r2)(r3)(r4)<式2>(r5)(r6)(r7)c-[c(r11)(r12)]n-c(r8)(r9)(ri0)。在式1或式2中，n可以是从0至10的整数，r1、r2、r3和r4的每一个可以独立地是氟(f)、氯(cl)、溴(br)、碘(i)或氢(h)，选自r1、r2、r3、r4的至少一个是f，r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11和r12的每一个可以独立地是f、cl、br、i或h，以及选自r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11和r12的至少一个可以是f。对于组合物而言，含氟化合物可以是例如chf3、ch2f2、ch3f或cf4。如在本申请中所使用的术语“除去”指降低样品中含氟化合物的浓度，以及降低包括完全除去。对于组合物而言，had蛋白的变体可以属于ec3.8.1.2。had蛋白的变体与上文所述的是相同的。对于组合物而言，在重组微生物中可以包含had蛋白变体，所述had蛋白变体包含编码had蛋白变体的外源基因。组合物可以包含重组微生物，其裂解物或者裂解物的水溶性物质部分。除非在说明书中另有说明，重组微生物与上文所述的是相同的。对于组合物而言，除去含氟化合物可以包括通过将含氟化合物的c-f键裂解，将含氟化合物转化为其他物质或者在细胞中累积含氟化合物实现降低含氟化合物的浓度。含氟化合物的转化可以包括向含氟化合物中引入亲水性基团(如羟基)，或者向含氟化合物中引入碳-碳双键或碳-碳三键。对于组合物而言，样品可以是液体样品或气体样品。样品可以是工业污水或废气。实施方式的另一个方面提供了一种降低样品中含氟化合物的浓度的方法，所述方法包括将卤酸脱卤酶(had)超家族蛋白的变体与含有以式1或式2表示的含氟化合物的样品接触，以降低样品中含氟化合物的浓度。除非在说明书中另有说明，had蛋白变体与上文所述的是相同的。对于方法而言，接触可以在气密容器中进行。接触可以是气体样品与含有had蛋白变体的液体的气-液接触。此外，接触可以是液体样品与含有had蛋白变体的液体的液-液接触。液-液接触可以包括混合。对于方法而言，在重组微生物中可以包含had蛋白变体，所述had蛋白变体包含编码had蛋白变体的外源基因。在这方面，接触可以包括首先将样品与细胞接触，然后再与细胞中的变体接触。变体可以包含重组微生物，其裂解物或者裂解物的水溶性物质部分。在重组微生物中包含的外源基因与上文所述的是相同的。对于方法而言，接触可以在重组微生物能够在气密容器中存活的条件下进行。使重组微生物存活的此类条件可以包括使重组微生物可以增殖的条件或使重组微生物可以处于静息状态的条件。在这方面，接触可以包括在存在含氟化合物的条件下培养微生物。培养可以在有氧或无氧条件下进行。对于方法而言，样品可以是液体样品或气体样品。样品可以是工业污水或废气。实施方式的另一个方面提供了一种卤酸脱卤酶(had)超家族蛋白的变体，其中所述变体包括在选自由位置n122和s184组成的组的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基处包含氨基酸改变，以及编号表示seqidno：1的氨基酸序列编号或与位置n122和s184对应的氨基酸序列编号。变体与上文所述的是相同的。实施方式的另一个方面提供了一种编码卤酸脱卤酶(had)超家族蛋白的变体的多核苷酸，其中所述变体在选自由位置n122和s184组成的组的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基处包含氨基酸改变，以及编号表示seqidno：1的氨基酸序列编号或与位置n122和s184对应的氨基酸序列编号。变体与上文所述的是相同的。编码变体的多肽可以包含在载体中。作为载体使用时，可以使用能够用于将多核苷酸引入微生物的任何载剂。载体可以是质粒载体或病毒载体。根据另一个实施方式的一个方面，可以将重组微生物用于除去样品中的含氟化合物。根据另一个实施方式的一个方面，可以将包含had蛋白变体的组合物用于除去样品中的含氟化合物。根据另一个实施方式的一个方面，降低样品中含氟化合物浓度的方法可以有效地降低样品中含氟化合物的浓度。根据另一个实施方式的一个方面，可以将变体和编码其的多核苷酸用于除去样品中的含氟化合物或用于生产变体。在下文中，将参照实施例对本发明进行更详细地描述。然而，提供这些实施例仅用于说明目的，并且本发明并非旨在被这些实施例所限制。实施例1：表达bc3334基因的重组大肠杆菌以及使用该重组大肠杆菌除去样品中的含氟化合物在这里，制备表达had基因(如来自b.cereus的bc3334)以及had基因变体基因的重组大肠杆菌，以及通过使用重组大肠杆菌确证其除去样品中的cf4的作用。1.扩增来自b.cereus的had基因(bc3334)并将该基因引入大肠杆菌扩增来自b.cereus的(atcc14579)bc3334基因的已知序列。为了扩增bc3334基因，使用该菌株的基因组dna作为模板以及具有核苷酸序列seqidno：3和4的引物对进行pcr。使用infusion克隆试剂盒(clontechlaboratories，inc.)将扩增的bc3334基因与已使用限制性内切酶ncoi和hindiii消化的petduet-1(novagen，目录号71146-3)连接，从而制备pet-bc3334载体。图1是pet-bc3334的载体图谱。bc3334蛋白具有seqidno：1所示的氨基酸序列，以及其基因具有seqidno：2所示的核苷酸序列。接下来，通过热休克法将制备得到的pet-bc3334载体引入大肠杆菌bl21，然后在含100μg/ml氨苄西林的lb平板上培养。选择显示出氨苄西林抗性的菌株。然后，将最终选择的菌株命名为重组大肠杆菌bl21/pet-bc3334wt。2.表达bc3334变体的重组大肠杆菌在本章节中，制备变体以改善bc3334蛋白在除去样品中含氟化合物时的活性。使用另外19个天然氨基酸取代seqidno：1所示氨基酸序列122位的天冬酰胺(在下文中称为“n122”)和/或184位的丝氨酸(在下文中称为“s184”)。在这里，可以将每个取代表示为“n122x”(其中x表示除天冬酰胺以外的19个天然氨基酸的每一个)或“s184x”(其中x表示除丝氨酸以外的19个天然氨基酸的每一个)。确证了通过引入编码所制备的其变体的基因制备的大肠杆菌除去样品中的cf4的作用。通过使用quikchangeii定点诱变试剂盒(agilenttechnology，usa)实现seqidno：1的n122x和/或s184x变体的制备。通过使用pfuulta高保真(hf)dna聚合酶以最高保真度对两条质粒链进行诱变引物定向复制使用该试剂盒进行定点诱变。该基本操作使用具有目标插入片段的超螺旋双链dna(dsdna)载体和均含有所需突变的两个合成寡核苷酸引物。在温度循环过程中利用pfuultrahfdna聚合酶延伸分别与载体的相对链互补的寡核苷酸引物，并且不进行引物置换。寡核苷酸引物延伸产生含有交错切口的突变质粒。在温度循环之后，使用dpni处理产物。dpni核酸内切酶(目标序列：5′-gm6atc-3′)对甲基化和半甲基化的dna具有特异性，将其用于消化亲本dna模板，以选择含有突变的合成dna。然后，再将引入了所需突变的带有切口的载体dna转化进入xl1-blue超感受态细胞。在用于诱导n122x和s184x突变的引物对中，seqidno：9和10所示的引物对以及seqidno：11和12所示的引物对分别用于n122y和n122v。具有n122y变异的bc3334蛋白和具有n122v变异的bc3334蛋白分别具有seqidno：19和21所示的氨基酸序列，其分别是由seqidno：20所示的核苷酸序列和由seqidno：22所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。具体而言，通过使用在第(1)节中制备的pet-bc3334wt载体作为模板和针对每个变体的引物对作为引物，以及pfuultahfdna聚合酶进行pcr以获得含有交错切口的变体载体。使用dpni处理这些载体产物以选择含有变体的合成dna。然后，再将引入了所需变体的带有切口的载体dna转化进入xl1-blue超感受态细胞，从而克隆pet-bc3334mt载体。最后，以与第(1)节中相同的方法将克隆得到的pet-bc3334wt载体引入大肠杆菌bl21菌株，并且将最终选择的菌株命名为重组大肠杆菌bl21/pet-bc3334mt。3.含有引入其中的bc3334变体的重组大肠杆菌除去样品中cf4的作用在本章节中，确证了在第(2)节中制备的并且包含引入其中的突变体bc3334基因的大肠杆菌bl21/pet-bc3334mt除去样品中cf4的作用。具体而言，将大肠杆菌bl21/pet-bc3334mt菌株在30℃温度和230rpm的转速下在lb培养基中培养，并且在约0.5的od600下，向培养基中加入iptg0.2mm，随后在20℃温度下以230rpm的速度振荡培养过夜。然后，收集细胞并将其悬浮在lb培养基中，以使其具有od600为3.0的细胞浓度。将10ml细胞溶液加入60ml血清瓶中，并将血清瓶密封。lb培养基为每1l蒸馏水中加入10g胰蛋白胨、5g酶提取物和10gnacl。接下来，使用注射器通过血清瓶盖上的橡皮塞将气相的cf4注射进入血清瓶，以使得血清瓶的顶空上具有1,000ppm的cf4。然后，在30℃温度和230rpm的转速下将血清瓶培养4天。实验重复进行三次。培养后，使用1.0ml注射器从血清瓶的顶空上收集0.5mlcf4气体，其中不含有培养基，然后将该气体注射进入气相色谱(gc)柱(agilent7890，paloalto，ca，usa)。通过cp-porabondq柱(长度25m，内径0.32mm，膜厚度5μm，agilent)分离注射的cf4气体，以及通过质谱(ms)(agilent5973，paloalto，ca，usa)分析cf4气体的浓度变化。在这里，使用氦气作为载气，并以1.5ml/min的速度通入柱中。gc条件为，入口温度为250℃，以及初始温度保持在40℃持续2分钟，并以20℃/min的速度升高至290℃。ms条件为，电离能为70ev，界面温度为280℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃。结果如表4中所示，含有变体的菌株与野生型相比显示出除去样品中cf4气体的活性。[表4]菌株cf4的分解率(％，与对照组比较)野生型4.11bl21/pet-bc3334mt(n122y)9.29bl21/pet-bc3334mt(n122v)5.99在表4中，对照组为大肠杆菌bl21，在其中引入了空petduet载体代替pet-bc3334mt载体，以及野生型为含有野生型bc3334基因的大肠杆菌。如表4中所示，含有野生型bc3334基因的大肠杆菌与对照组相比cf4减少了4.11％，而含有bc3334基因变体(即n122y和n122v基因)的大肠杆菌与对照组相比cf4分别减少了9.29％和5.99％。4.通过循环过程分解含氟化合物如图2中所示，将50mllb培养基和1,000ppmcf4气体加入已灭菌和垂直放置的玻璃迪姆罗斯螺旋回流冷凝器(反应器长度：350mm，外径：35mm和内部容积：200ml)中，然后使用lb培养基进行循环。图2是玻璃迪姆罗斯回流冷凝器的示意图。将lb培养基从冷凝器上部入口加入，使其流过冷凝器内壁，并且从冷凝器下部出口排出。将排出的lb培养基沿着循环管线再重新加入入口。尽管图2中未显示，将冷凝器的内螺纹管与30℃恒温区连接以保温。在这里，将lb培养基的循环速率保持在4ml/min。在经过指定时间段后(即，0、48、96和144小时)，通过气相色谱质谱(gc-ms)确证冷凝器中cf4气体的量。然后，证实cf4气体的量没有发生变化。随后，通过使用注射器将第(1)至(3)节中的重组微生物和对照组分别接种进入冷凝器中的lb培养基，以使其初始浓度为以od600计为5.0。重组微生物为引入了野生型bc3334基因的大肠杆菌和引入了bc3334变体基因的大肠杆菌。然后，对引入了野生型bc3334基因的大肠杆菌和引入了bc3334变体基因的大肠杆菌对cf4的分解能力进行比较。使用引入了空载体的大肠杆菌作为阴性对照组，其不会改变cf4的水平。在这里，lb培养基的循环速率为约4ml/min，并且冷凝器的内温保持在30℃。在接种细菌并经过144小时后，通过gc-ms确证冷凝器中cf4气体的量。然后，根据公式1计算cf4的分解率，结果如表5中所示。<公式1>cf4的分解率＝[(cf4的初始量-反应后cf4的量)/cf4的初始量]×100[表5]菌株cf4的分解率(％)bl21/pet-bc3334wt33.1bl21/pet-bc3334mt(n122y)44.5如表5中所示，当使用微生物对其进行气相循环过程时，将bc3334变体培养144小时后显示出的降解率是野生型菌株降解率的1.34倍。实施例2：利用表达sf0757基因及其变体基因的重组大肠杆菌除去样品中的cf41.选择黑胸败血菌sf3菌株并使用该菌株分解含氟化合物在本实施例中，选择了能够降低工业废水中cf4浓度的微生物。将从三星电子工厂(韩国器兴)排出的废水中的淤泥接种在含有不含碳培养基的琼脂平板上(添加了0.7g/lk2hpo4、0.7g/lmgso4·7h2o、0.5g/l(nh4)2so4、0.5g/lnano3、0.005g/lnacl、0.002g/lfeso4·7h2o、0.002g/lznso4·7h2o、0.001g/lmnso4和15g/l琼脂)，并且将琼脂平板置于gaspaktm罐(bdmedicaltechnology)中。将罐中充满99.9v/v％cf4，将罐密封并在30℃的温度和无氧条件下静置培养。使用高通量筛选(hts)系统(thermoscientific/liconic/perkinelmer)培养培养后形成的单菌落。将每个培养的单菌落接种在含有100μl/孔lb培养基的96孔微孔板上，然后将菌落在有氧条件下在约30℃温度下静态培养96小时。同时，每12小时测定一次在600nm处的吸光度以观察菌落的生长能力。选择显示出极佳生长能力的前2％的菌株，并且将各菌株接种至含有10mllb培养基的玻璃血清瓶中(容积为75ml)以使其od600为0.5。将玻璃血清瓶密封，然后使用注射器向其中注入cf4气体，以使得cf4气体为1,000ppm。在30℃温度下将玻璃血清瓶在振荡培养箱中培养4天，同时以230rpm的速度对其进行振荡，然后分析其顶空中cf4的量。对于分析而言，使用注射器收集玻璃血清瓶中0.5ml的顶空气体，然后在与第(3)节中所述的相同条件下对cf4的量进行分析。在对照组中，在如上文所述的相同条件下将1,000ppm不含细胞的cf4孵育和检测。结果证实，与无细胞的对照组相比，在所分离的微生物中cf4的浓度降低了10.27％。微生物具有0.02586g/kg-细胞/h的分解活性。为了鉴定所选择的菌株，对其基因组序列进行分析。通过新一代测序(ngs)获得由组装3个重叠群得到的基因组的最终尺寸为5.3mb，并且基因注释的结果表明共计存在5,490个基因。作为对每个重叠群进行的系统进化树分析的结果，证实了该微生物属于黑胸败血菌。将所分离的微生物新命名为黑胸败血菌sf3(bacillusbombysepticussf3)，并且于2017年2月24日将其保藏在根据布达佩斯条约的国际保藏机构韩国模式培养物保藏中心(kctc)，其保藏号为kctc13220bp。2.制备包含来自b.bombysepticussf3菌株的基因及其变体的重组微生物如第(1)节中所述，通过基因组序列分析对b.bombysepticussf3菌株进行鉴定，选择经预测编码脱卤酶的基因，如sf0757(seqidno：6)。将b.bombysepticussf3在30℃温度和230rpm的转速下在lb培养基中培养过夜，并使用总dna提取试剂盒(invitrogenbiotechnology)分离其基因组dna。使用基因组dna作为模板和具有seqidno：7和8所示核苷酸序列的引物对进行pcr，以扩增f0757基因。通过使用infusion克隆试剂盒(clontechlaboratories，inc.)，将如此扩增的基因分别与用限制性内切酶(如ncoi和xhoi)消化的pet28a载体(novagen，目录号69864-3)连接，以制备pet-sf0757载体。图3是pet-sf0757载体的载体图谱。在这里，sf0757基因具有seqidno：6所示的核苷酸序列，并且其编码seqidno：5所示的氨基酸序列。接下来，通过热休克法将制备得到的pet-sf0757载体引入大肠杆菌bl21，然后在含50μg/ml卡那霉素的lb平板琼脂上培养。然后，选择显示出卡那霉素抗性的菌株，并且将最终选择的菌株命名为重组大肠杆菌bl21/pet-sf0757。3.制备表达sf0757变体的重组大肠杆菌在本章节中，制备变体以改善bc3334基因在除去样品中含氟化合物时的活性。使用另外19个天然氨基酸取代seqidno：1所示氨基酸序列122位的天冬酰胺(在下文中称为“n122”)和/或184位的丝氨酸(在下文中称为“s184”)。在这里，可以将每个取代表示为“n122x”(其中x表示除天冬酰胺以外的19个天然氨基酸的每一个)或“s184x”(其中x表示除丝氨酸以外的19个天然氨基酸的每一个)。确证了通过引入编码所制备的其变体的基因制备的大肠杆菌除去样品中的cf4的作用。在用于诱导n122x和s184x突变的引物对中，seqidno：13和14所示的引物对、seqidno：15和16所示的引物对以及seqidno：17和18所示的引物对分别用于s184h、s184q和s184d。具有s184h、s184q和s184d变异的sf0757蛋白分别具有seqidno：23、25和27所示的氨基酸序列，其分别是由seqidno：24、26和28所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。变体以及包含变体基因的重组大肠杆菌的制备与实施例1的第(3)节中所述的是相同的。最后，采用与第(1)节中相同的方法将克隆得到的pet-sf0757mt载体引入大肠杆菌bl21菌株，并且将最终选择的菌株命名为重组大肠杆菌bl21/pet-sf0757mt。4.包含引入其的sf0757变体的重组大肠杆菌对除去样品中cf4的作用在本章节中，考察了在第(3)节中制备的其中引入sf0757变体的大肠杆菌bl21/pet-sf0757mt对除去样品中cf4的影响。具体而言，将大肠杆菌bl21/pet-sf0757mt菌株在30℃温度和230rpm的转速下在lb培养基中培养，并且在约0.5的od600下，向培养基中加入iptg0.2mm，随后在20℃温度下以230rpm的速度振荡培养过夜。然后，收集细胞并将其悬浮在lb培养基中，以使其具有od600为3.0的细胞浓度。将10ml细胞溶液加入60ml血清瓶中，并将血清瓶密封。lb培养基为每1l蒸馏水中加入10g胰蛋白胨、5g酶提取物和10gnacl。接下来，使用注射器通过血清瓶盖上的橡皮塞将气相的cf4注射进入血清瓶，以使得血清瓶的顶空上具有1,000ppm的cf4。然后，在30℃温度和230rpm的转速下将血清瓶培养4天。实验重复进行三次。培养后，从血清瓶的顶空上收集cf4气体，其中不含有培养基，然后在与如实施例1的第(3)节中所述的相同条件下进行分析。结果如表6中所示，含有上述变体的菌株与野生型菌株相比显示出除去样品中cf4气体的活性。[表6]菌株cf4的分解情况(％，与对照组比较)野生型3.95bl21/pet-sf0757(s184h)8.76bl21/pet-sf0757(s184q)7.35bl21/pet-sf0757(s184d)5.61在表6中，对照组为大肠杆菌bl21，在其中引入了空pet28a载体代替pet-sf0757载体，以及野生型为含有sf0757的大肠杆菌。如表6中所示，含有野生型sf0757基因的大肠杆菌与对照组相比cf4水平减少了3.95％，而含有sf0757变体(即包含s184h、s184q和s184d基因的大肠杆菌)的大肠杆菌与对照组相比cf4水平分别减少了8.76％、7.35％和5.61％。5.使用循环过程分解含氟化合物除了使用在第(3)节中制备的重组大肠杆菌bl21/pet-sf0757以外，采用与实施例1的第(4)节中相同的方法检测样品中含氟化合物的分解率。[表7]菌株cf4的分解率(％)bl21/pet-sf0757wt25.7bl21/pet-sf0757mt(s184h)29.9如表7中所示，当使用微生物对其进行气相循环过程时，将sf0757变体培养144小时后显示出的降解率是野生型菌株降解率的1.16倍。应当理解，应将本申请所述的实施方式认为是仅具有描述性意义并且不是出于限制性目的。通常应将在每个实施方式中对特征或方面的描述认为是可供在其他实施方式中相似的特征或方面使用的。尽管已经参照附图描述了一个或多个实施方式，但是本领域的普通技术人员应当理解在不脱离由下述权利要求所定义的主旨和范围的前提下，可以对其形式和细节进行各种改变。<110>三星电子株式会社<120>卤酸脱卤酶超家族蛋白变体以及使用其降低样品中含氟化合物浓度的方法<130>pn118043kr<160>33<170>kopatentin2.0<210>1<211>236<212>prt<213>蜡状芽孢杆菌<400>1metlystyrlysvalileleupheaspvalaspaspthrleuleuasp151015pheprogluthrgluarghisalaleuhisasnalaphevalglnphe202530aspmetprothrglytyrasnasptyrleualasertyrlysgluile354045serasnglyleutrpargaspleugluasnlysmetilethrleuser505560gluleualavalaspargpheargglnleuphealaleuhisasnile65707580aspvalaspalaglnglnpheseraspvaltyrleugluasnleugly859095lysgluvalhisleuilegluglyalavalglnleucysgluasnleu100105110glnaspcyslysleuglyileilethrasnglytyrthrlysvalgln115120125glnserargileglyasnserproleucysasnphepheasphisile130135140ileileserglugluvalglyhisglnlysproalaarggluilephe145150155160asptyralapheglulyspheglyilethrasplysserservalleu165170175metvalglyaspserleuthrseraspmetlysglyglygluasptyr180185190glyileaspthrcystrptyrasnproserleulysgluasnglythr195200205aspvalasnprothrtyrgluvalgluserleuleuglnileleuglu210215220ilevalgluvalalagluglulysvalalaserphe225230235<210>2<211>711<212>dna<213>蜡状芽孢杆菌<400>2atgaaatacaaagttatattattcgacgtagatgatacattattagatttccctgaaacg60gaaagacacgcattacataatgcgtttgtacagtttgatatgcctacagggtataatgat120tatcttgcaagctataaagagattagtaatggattatggagagatttagaaaataaaatg180attacgctaagtgaattagcagtagatcgatttagacaattatttgcacttcataatata240gacgtagatgcacagcaatttagtgatgtataccttgaaaatttagggaaggaagtacat300cttatagaaggcgcagtacaattatgtgaaaatctacaagattgcaagttaggtattatt360acgaatggatatacgaaggtgcaacaatcaagaatcggaaattcacctttatgtaatttc420tttgatcacattattatttctgaagaagttggtcatcaaaaaccagcacgtgagattttt480gattatgcgtttgagaagtttgggattactgataaatcaagcgtactaatggttggagat540tcgttaacttctgatatgaaaggcggagaagattacggcattgatacgtgttgg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