一种抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA分子序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因技术领域的RNA干扰序列，具体涉及一种抑制鸡细胞周期蛋 白F基因表达的shRNA分子序列。
【背景技术】
[0002] 细胞周期通常可以分为四个阶段：Gl、S、G2及M，其中G1和G2期是细胞生长期， S期是细胞将细胞核内的染色体复制的时期；M期是细胞进行有丝分裂或者减数分裂的时 期。细胞周期蛋白，又名细胞周期素（Cyclin)，是一类与细胞周期功能状态密切相关的蛋白 质家族，已知的细胞周期蛋白有十余种，目前功能研究较为透彻的主要有Cyclin A，Cyclin B，Cyclin C，Cyclin D及Cyclin E，他们在细胞周期的不同阶段通过cyclin box激活周期 素依赖性蛋白激酶（CDK)分别发挥作用。1994年Elledge实验室发现一种新的人类细胞 周期蛋白，并将其命名为细胞周期蛋白F(Cyclin F，CCNF)。CCNF是细胞周期蛋白中分子 量最大的一个，在已检测的所有细胞中均有表达。与其他周期蛋白不同，CCNF拥有cyclin box，但没有可激活的CDK，因此其功能可能区别于其他细胞周期蛋白。近年来，随着CCNF在 不同的物种中被相继报道，功能研究也逐渐开展。鸡的CCNF基因位于14号染色体，全长由 12568个碱基编码。
[0003] RNA干扰（RNA interference, RNAi)是发生在真核生物细胞内，基因转录后的 表达被特异性抑制的现象。其作用机制是，细胞内的长双链RNA (double-stranded RNA， dsRNA)与Dicer酶结合后，被切成长度为21_23bp的小干扰RNA分子（small interfering RNA，siRNA)。siRNA识别并结合靶基因mRNA上的互补序列，引导RNA诱导沉默复合物 (RNA-induced silencing complex，RISC)将mRNA降解，从而导致革巴基因转录后的基因沉 默（posttranscriptional gene silencing，PTGS)。具有莖环结构的短发夹 RNA (short hairpin RNA，shRNA)在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，并诱导RNA干扰，而且作用时 间更为持久。针对目的基因序列构建shRNA表达载体，并导入细胞内，可以长效、特异性的 干扰靶基因的表达，实现类似于基因敲除的效果。RNAi技术被《Science》杂志评为2001年 的十大科学进展之一。该技术已被广泛用于探索基因功能等方面的研究。
[0004] 经对现有技术的文献检索发现，尚无细胞周期蛋白F基因的RNA干扰序列的有关 报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA分 子序列。根据Genbank数据库中鸡细胞周期蛋白基因序列以及shRNA的分子序列设计原则， 设计多个shRNA分子序列，根据设计经验和设计软件进行评估测定，选择4条最佳的动力学 参数靶点进入后续试验流程。根据选择的4个干扰靶点序列设计并合成4个寡聚单链DNA 序列。
[0006] 本发明提供的作用于鸡细胞周期蛋白F基因mRNA的shRNA分子序列，为如下a) 或b)或c)或d):
[0007] a)由序列表的序列1所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；
[0008] b)由序列表的序列2所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；
[0009] c)由序列表的序列3所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；
[0010] d)由序列表的序列4所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸。
[0011] 本发明还保护以上任一所述shRNA序列在抑制鸡细胞的细胞周期蛋白F基因表达 中的应用。
[0012] 所述细胞周期蛋白 F 基因 mRNA 可为 GenBank Accession Number :XM_415043. 4 自 5'末端第1至3610位碱基序列。
[0013] 所述细胞具体可为鸡胚睾丸支持细胞，鸡成纤维细胞系（DF-1)。
[0014] 本发明还保护以上任一所述shRNA在抑制鸡的细胞周期蛋白F基因表达中的应 用。
[0015] 所述细胞周期蛋白 F 基因 mRNA 可为 GenBank Accession Number :XM_415043. 4 自 5'末端第1至3610位碱基序列。
[0016] 本发明获得了有效抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA，在分子生物学上通 过实时荧光定量PCR证明它有效的降低了细胞周期蛋白F基因的表达。
【附图说明】
[0017] 图1为实施例2中shRNA干扰载体获得的病毒转染鸡胚睾丸支持细胞后细胞周期 蛋白F基因荧光定量试验结果。
[0018] 图2为实施例3中shRNA干扰载体获得的病毒转染鸡胚成纤维细胞后细胞周期蛋 白F基因荧光定量试验结果。
【具体实施方式】
[0019] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发 明进一步详细说明。
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂公司购买得到。
[0021 ] 实施例1、干扰鸡细胞周期蛋白F基因的shRNA序列的设计、合成、干扰载体构建及 病毒收集。
[0022] 根据NCBI公布的鸡细胞周期蛋白F基因mRNA核苷酸序列设计并化学合成五条 shRNA分子，序列如下：
[0023]第一条（shRNA-462):靶向基因 462-482 位碱基（GCAGAAGTGAATGGAITAAAG)5'-GC AGAAGTGAATGGATTAAAG-TTCAAGAGA-CTTTAATCCATTCACTTCTGCTT-3' （序列 1);
[0024]第二条（shRNA-623):靶向基因 623-643 位碱基（GCTGGACAAAGCTCAGAAAGG)5,-GC TGGACAAAGCTCAGAAAGG-TTCAAGAGA-CCTTTCTGAGCTTTGTCCAGCTT-3'（序列 2);
[0025]第三条（shRNA-938):靶向基因 938-958 位碱基（GGTGGCTCAGATGTITCAAGC)5'-GG TGGCTCAGATGTTTCAAGC-TTCAAGAGAG-CTTGAAACATCTGAGCCACCTT-3'（序列 3);
[0026]第四条（shRNA-1817):靶向基因1817-1837位碱基（GGAAGACAGCACTCAGGATGA) 5' -GGAAGACAGCACTCAGGATGA-TTCAAGAGA-TCATCCTGAGTGCTGTCTTCCTT-3'（序列4);
[0027] 第五条（shRNA-NC):不靶向该基因上的任何序列，作为阴性对照序列5'-TTCTCCG AACGTGTCACGTTTC-TTCAAGAGA-GAAACGTGACACGTTCGGTGAA-3'（序列 5)
[0028] 其中每条序列中的TTCAAGAGA为loop区序列。
[0029] 将以上单链寡核苷酸片段溶解后95°C加热5min，放置室温自然冷却20min，形成 双链shRNA片段，用载体构建试剂盒将5个双链shRNA片段分别插入到shRNA表达载体 pGLV3/Hl/GFP+Puro中，室温连接30min，构建5个shRNA表达质