一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法与流程

本发明属于微生物发酵生产清洁能源技术领域，具体涉及到一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法。

背景技术：

化石能源的逐年开采和利用，使全球范围内化石能源存储量日益降低，且石油价格的不断增长，造成能源形势异常严峻，环境问题愈演愈烈。随着人口的飞速增长，社会经济的迅猛发展，世界能源需求量日益提高。在能源枯竭和环境恶化的双重压力下，世界各国俱在积极发展可再生和绿色能源来替代传统的化石能源。生物能源是可替代化石燃料的重要清洁能源。丁醇是一种极具潜力的新型生物燃料，与当前流行的生物燃料添加剂乙醇相比，具有热值高于乙醇、低吸湿性、低蒸汽压、不易溶于水、更容易与汽油和柴油燃料相混合等优点。虽然生物丁醇有良好的工业前景，但在丁醇发酵过程中由于丁醇的低产量，低合成速率使其生产力受到严重限制，导致工业化进程缓慢。

为了使丁醇发酵在工业生产上更具有竞争力，必须提高丁醇的生产能力，这也是目前国内外发酵法生产丁醇的研究热点和难点。丁醇发酵是一个复杂的生物反应过程，在发酵过程中受细胞浓度、产物抑制等因素的影响。为了解决丁醇发酵所面临的上述问题，国内外研究者通过研究新的发酵工艺来提高丙酮-丁醇发酵的生产能力，如使用细胞回流和固定化细胞技术来提高细胞浓度和反应器的效率，以及通过萃取发酵来减弱产物抑制。近年来，随着生物技术的飞速发展，采用分子生物学手段、基因改造技术以及代谢工程来增加丙酮丁醇梭菌发酵丁醇的产量得到了广泛关注。虽然基因改造是最有前途的操作技术，但由于丁醇发酵途径的复杂性，并且发酵过程中基因控制复杂，且不易操作，导致基因工程领域进展缓慢。目前为止，尚没有基因工程菌能适合工业化生产。

丁醇发酵代谢过程已阐明分为产酸期和产溶剂期两个阶段。在发酵初期，随着发酵的进行，产生大量丁酸和乙酸，发酵液ph值迅速下降，称为产酸期。当酸性物质积累到一定浓度，ph降到一定值时发酵液的还原倾向增强，乙酸、丁酸等被还原成丙酮、丁醇等新的产物，从而使ph升高，进入产溶剂期。丁醇，丙酮等溶剂的产生是碳代谢由产酸途径向产溶剂途径的转变，而丁酸作为合成丁醇的必需和有效的前体物质，通过向培养基中添加丁酸或许可作为菌体由产酸期向产溶剂期转化的诱导因子，快速激活产丁醇的代谢途径，促进丁醇合成。另外，在发酵产酸期由于大量有机酸积累，在这个过程中，如果不进行ph值的调节，那么极有可能会导致酸崩溃现象，从而使发酵受抑制而使产率降低。

因此，研究简单、有效的诱导因子丁酸的添加方式及ph的调控策略对促进丁醇合成，提高丁醇转化效率具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术不足，而提出的一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，关键在于诱导因子丁酸的添加方式及稳定ph的调控策略，为了解决上述问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，它是按照以下步骤进行的：

一、将产丁醇细菌接种到已灭菌的液体厌氧发酵培养基中，在恒温条件下振荡培养至对数期；

二、待步骤一中细菌生长达到对数期后，将丁酸溶液添加到步骤一发酵体系中，使发酵体系中的丁酸溶液浓度达到0.6～1.5g/l；

三、在添加完丁酸溶液后，将缓冲剂间歇添加到步骤二中所建立的发酵体系中，恒温条件下继续振荡培养，得到以丁醇为主的发酵液，即完成所述的提高厌氧细菌产丁醇活性；所述的缓冲剂添加总量为0.03～0.04mol/l，间歇添加的条件为每间隔24h添加一次，共添加2次，每次添加后振荡均匀。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)丁酸是合成丁醇的前体物质，添加少量丁酸有助于激发丁醇的合成的代谢途径，促进丁醇的快速合成，缩短发酵周期。

(2)本发明丁酸添加时间选择在菌体生长的对数期，可以避免其对菌体的生长造成消极的影响，还可以避免酸崩溃发生。

(3)本发明在加入丁酸后立即添加缓冲剂能够在后期丁醇发酵过程中中和有机酸，提升培养基的缓冲能力，维持一个比较稳定的ph，减轻环境对于产丁醇细菌的胁迫，有效的避免了酸崩溃现象发生。

(4)本发明中的缓冲剂是以间歇添加的手段加入的，能够更加精准的持续缓冲ph。避免一次性大量添加导致ph快速升高，从而延缓发酵体系由产酸期向产溶剂期的的转变

(5)本发明使发酵底物更多的进入丁醇合成的代谢途径，减少了发酵体系副产物如乙酸、丁酸的生成，大大提高了发酵液中丁醇所占的比例。

通过与对照试验进行比较分析，丁醇最终产量与对照相比提高了139.4％，丁醇最大合成速率与对照组相比提高了168.3％。

因此，本发明根据代谢支路耦联的特性，提出通过添加丁醇代谢过程前体物质丁酸来激发丁醇的快速合成，并开发了通过间歇流加缓冲剂的调控策略控制发酵体系ph，使丁醇发酵能够高效、稳定运行。该发明具有性能稳定、运行效果好、工艺操作简便等优势，便于推广应用。

附图说明

图1为具有代表性的后述的实例的微生物发酵制丁醇产量图；其中，a为添加丁酸+碳酸钙的丁醇产量曲线，b为对照曲线；

图2为具有代表性的后述的实例的微生物发酵制丁醇合成速率图；其中，a为添加丁酸+碳酸钙的丁醇产量曲线，b为对照曲线。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，它是按照以下步骤进行的：

一、将产丁醇细菌接种到已灭菌的液体厌氧发酵培养基中，在恒温条件下振荡培养至对数期；

二、待步骤一中细菌生长达到对数期后，将丁酸溶液添加到步骤一发酵体系中，使发酵体系中的丁酸溶液浓度达到0.6～1.5g/l；

三、在添加完丁酸溶液后，将缓冲剂间歇添加到步骤二中所建立的发酵体系中，恒温条件下继续振荡培养，得到以丁醇为主的发酵液，即完成所述的提高厌氧细菌产丁醇活性；所述的缓冲剂添加总量为0.03～0.04mol/l，间歇添加的条件为每间隔24h添加一次，共添加2次，每次添加后振荡均匀。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基含有浓度为40～60g/l的碳源、1～3g/l酵母提取物、0.1～0.3g/l硫酸镁、0.01～0.02g/l硫酸锰、0.01～0.02g/l硫酸亚铁、0.01～0.02g/l氯化钠、0.001～0.002g/l维生素b1、0.3～0.7g/l半胱氨酸、0.001～0.002g/l对氨基苯甲酸、0.0001g/l生物素和0.1～0.2g/l刃天青。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基含有浓度为40～60g/l的碳源、2g/l酵母提取物、0.2g/l硫酸镁、0.01g/l硫酸锰、0.01g/l硫酸亚铁、0.01g/l氯化钠、0.001g/l维生素b1、0.5g/l半胱氨酸、0.001g/l对氨基苯甲酸、0.0001g/l生物素和0.1g/l刃天青。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的液体厌氧发酵培养基中的碳源可为葡萄糖、淀粉或木质纤维素物质水解糖化液。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的产丁醇细菌为严格厌氧菌。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的严格厌氧菌包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、丁酸梭菌以及通过基因工程改造的微生物。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中接种的发酵产丁醇细菌的接种比例为发酵体积的1～2％。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的缓冲剂为碳酸钙、碳酸钠、磷酸盐中的一种或两种以上按任意比混合。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中恒温条件为：温度为34～37℃，转速为150～180r/min的条件下振荡培养，共培养60～100小时。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中恒温条件为：发酵体系中的丁酸溶液浓度达到1.0～1.5g/l。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中恒温条件为：发酵体系中的丁酸溶液浓度达到1.2～1.5g/l。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：

本实施方式一种提高厌氧细菌发酵产丁醇活性的方法按以下步骤实现：

(1)将丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824(购买于中国普通微生物菌种保藏中心)的种子液按体积比为2％接种到已灭菌的液体厌氧发酵培养基中，在37℃恒温条件、170r/min的转速下振荡培养至对数期。

其中厌氧发酵培养基含有浓度为60g/l的葡萄糖、2g/l酵母提取物、0.2g/l硫酸镁、0.01g/l硫酸锰、0.01g/l硫酸亚铁、0.01g/l氯化钠、0.001g/l维生素b1、0.5g/l半胱氨酸、0.001g/l对氨基苯甲酸、0.0000g/l生物素和0.1g/l刃天青。充氮气除氧后，121℃灭菌20分钟。

(2)在步骤(1)中丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824接菌后12h时，将丁酸溶液添加到步骤(1)中所建立的发酵体系中，添加丁酸溶液后，整个发酵体系的丁酸浓度为1g/l，加入丁酸后迅速振荡均匀。

(3)完成步骤(2)后立即将碳酸钙悬浊液添加到步骤(1)所建立的发酵体系中。将发酵液振荡均匀。添加碳酸钙悬浊液后，整个发酵体系中的碳酸钙浓度为2g/l，加入碳酸钙后应迅速振荡均匀。

(4)在第一次添加碳酸钙后24h之后，发现厌氧瓶内无沉淀，碳酸钙已消耗殆尽，再次添加碳酸钙，添加浓度为2g/l，即累积添加碳酸钙浓度为4g/l。

(5)在恒定37℃，转速为170r/min的条件下振荡培养，在添加丁酸后继续培养60小时可以得到富含丁醇的发酵液。

实施例2：

本实施方式一种提高厌氧细菌发酵产丁醇活性的方法按以下步骤实现：

(1)将丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824(购买于中国普通微生物菌种保藏中心)的种子液按体积比为2％接种到已灭菌的液体厌氧发酵培养基中，在37℃恒温条件、170r/min的转速下振荡培养至对数期。

其中厌氧发酵培养基含有浓度为50g/l的纤维素酶解糖化液、2g/l酵母提取物、0.2g/l硫酸镁、0.01g/l硫酸锰、0.01g/l硫酸亚铁、0.01g/l氯化钠、0.001g/l维生素b1、0.5g/l半胱氨酸、0.001g/l对氨基苯甲酸、0.0000g/l生物素和0.1g/l刃天青。充氮气除氧后，121℃灭菌20分钟。

(2)在步骤(1)中丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824接菌后12h时，将丁酸溶液添加到步骤(1)中所建立的发酵体系中，添加丁酸溶液后，整个发酵体系的丁酸浓度为1.25g/l，加入丁酸后迅速振荡均匀。

(3)完成步骤(2)后立即将碳酸钙悬浊液添加到步骤(1)所建立的发酵体系中。将发酵液振荡均匀。添加碳酸钙悬浊液后，整个发酵体系中的碳酸钙浓度为2g/l，加入碳酸钙后应迅速振荡均匀。

(4)在第一次添加碳酸钙后24h之后，发现厌氧瓶内无沉淀，碳酸钙已消耗殆尽，再次添加碳酸钙，添加浓度为2g/l，即累积添加碳酸钙浓度为4g/l。

(5)在恒定37℃，转速为170r/min的条件下振荡培养，在添加丁酸后继续培养60小时可以得到富含丁醇的发酵液。

实验结果：

本实施例的丁酸添加时间选择在菌体生长的对数期，可以避免其对菌体的生长造成消极的影响，还可以避免酸崩溃发生。额外添加碳酸钙能够在丁醇发酵过程中和有机酸，提升培养基的缓冲能力，获得一个较高的ph值，并使之维持在一个特定范围内。碳酸钙与丁酸同时添加能迅速有效的改善ph，减轻环境对于产丁醇细菌的胁迫。碳酸钙以分批补料的方式添加能控制发酵成本，精准持续的稳定发酵体系的ph。外添丁酸及碳酸钙后，丙酮丁醇梭菌梭菌依旧长势良好。

丁酸是合成丁醇的前体物质，本实施例添加少量丁酸有助于激发丁醇的合成的代谢途径，当葡萄糖和丁酸共同作为底物时，能够有效的提升葡萄糖的利用率，并且使葡萄糖浓度迅速下降。额外添加丁酸能够刺激有益于丁醇合成的氨基酸的积累，进一步提升丁醇产量。外添丁酸后丁醇合成量和丁醇合成速率趋势有明显的正向波动，发酵周期明显缩短。本实验丁醇最终产量与对照相比提高了139.4％，丁醇最大合成速率与对照组相比提高了168.3％。

由此可知，本实施例使发酵底物更多的进入丁醇合成的代谢途径，减少了发酵体系副产物如乙酸、丁酸的生成，大大提高了丁醇产量，强化了发酵液中丁醇所占的比例。